黃體生成素受體研究進展及其基因序列的同源性分析

1、黃體生成素受體研究進展及其基因序列的同源性分析張善文，陳 斌（湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，湖南 長沙 410128）摘 要：黃體生成素發(fā)揮生理作用是通過黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor,lhr）介導的。研究動物黃體生成素受體及其基因對于闡明動物的生殖生理機制具有重要意義。本文論述了動物lhr的分布、結構、表達及其調控、作用機理等方面的研究進展，并對目前genbank已公布的人、鼠、主要畜禽黃體生成素受體基因的編碼區(qū)序列進行了同源性比較分析。關鍵詞：黃體生成素；黃體生成素受體；基因；同源性分析research advance and gene seque

2、nce homology analysis of luteinizing hormone receptorshanwen zhang,chen bin(college of animal science and technology, hunan agricultural university,hunan changsha 410128)abstract:the actions of luteinizing hormone were thought to be mediated through binding to its receptor (luteinizing hormone recep

3、tor,lhr).lhr gene of animal was of importance to understand the reproduction physiology of animal.this paper summarized the research progress in lhr including its histological distribution,structure,expression,regulation and functional mechanism in animal.it also analyzed the sequence homology of th

4、e lhr gene coding sequence for human,mouse,chicken and other animal published in the genbank.keywords:luteinizing hormone;luteinizing hormone receptor;gene;homology analysis黃體生成素（luteinizing hormone,lh）又稱作促黃體素，是由腺垂體嗜堿性細胞合成并分泌的一種大分子糖蛋白，由和兩個亞基非共軛結合形成，其中亞基具有決定其分子特異性的構型特征，可以識別適當?shù)陌薪M織，并與特定的受體結合，進而發(fā)揮其生理功能1

5、，lh可和卵泡刺激素（follicle stimulating hormone,fsh）協(xié)同作用促進卵泡成熟、觸發(fā)排卵、促進黃體形成并分泌雌激素和孕激素，在動物生殖過程中發(fā)揮重要作用。黃體生成素發(fā)揮生理作用是通過黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor,lhr）介導的。自mcfarland等2和loosfelt等3先后克隆了大鼠和豬lhr基因的cdna以來，研究人員對lhr進行了較全面而深入的研究。目前，在lhr的結構、作用機理及其與一些疾病的關系等方面均取得了一定的進展。1 lhr的結構和分布大鼠lhr基因編碼一個分子量約為75 kda的糖蛋白，含674個氨基

6、酸殘基。lhr由兩個功能單位組成：對lh有高親和力的激素結合域和由7個跨膜胞漿模件構成的錨定單元，后者具有g蛋白偶聯(lián)和信號傳導功能。肽鏈形成的7個跨膜(transmembrane,tm)螺旋被相應的3個細胞內環(huán)(intracellular loops,ils)和3個細胞外環(huán)(extracellular loops,els)連接。lhr氨基端(n端) 部分有14個由20多個氨基酸殘基組成的“富含leu重復”片段。lhr的胞外域含341個氨基酸殘基，并有6個潛在的糖基化位點2。第1、2 els含有cys殘基，可形成分子內二硫鍵，起穩(wěn)定跨膜螺旋結構的作用。lhr的跨膜區(qū)是7次跨過細胞膜的波浪式結構，

7、具有g蛋白的特性，并與g蛋白家族中的其它受體具有高度同源性2。lhr細胞內羧基端(c端)部分由69個氨基酸殘基組成，包含12個蛋白激酶c（protein kinase c,pkc）磷酸化位點，1個潛在的酪氨酸激酶(tyrosine kinase)磷酸化位點以及數(shù)個由蛋白激酶a（protein kinase a,pka）催化的ser/thr磷酸化位點。對lhr蛋白質結構網絡分析的研究表明，不管在激活或者未激活的情況下，視紫質家族g蛋白偶聯(lián)受體中高度保守的氨基酸都具有維持其穩(wěn)定性的功能，而這些氨基酸的功能失活突變則可能會損害激活突變位點和激素結合區(qū)的功能4。lhr主要分布于性腺組織，如睪丸間質細胞

8、、卵巢顆粒細胞和黃體細胞。同時，lhr在腎上腺、前列腺、大腦皮質、正常乳腺表皮細胞甚至腎臟等一些非性腺組織中也有表達5,6。lhr在非性腺組織中廣泛分布說明lhr在生殖和醫(yī)學上具有很多重要功能7。近幾還年發(fā)現(xiàn)，lhr存在于一些惡性腫瘤細胞表面，如胃癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、子宮內膜癌等811。2 lhr的作用機理lhr的信號傳導過程包括4個步驟:(1)配體與受體特異性結合；(2)信號傳導；(3)受體脫敏；(4)受體活化后事件。其中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙都會影響到lh生理作用的發(fā)揮。lhr在輸卵管、子宮組織主要通過激活環(huán)化腺核苷一磷酸(camp)和磷脂酶c(plc)這兩條信號傳導途徑發(fā)揮生理活性

9、12,13，這與lhr在卵巢和睪丸活化的信號途徑完全一樣14。lh 與lhr結合后激活了細胞膜上的g蛋白，g蛋白進一步激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase,ac)和磷脂酶c(phospholipase c,plc):(1)ac導致細胞內camp水平升高，camp激活蛋白激酶a(protein kinase a,pka)，pka使前列腺素合成酶(prostaglandin h synthase,pghs)的活性升高，最終導致了前列腺素(prostaglandin,pg)合成增加。另外，camp也能使細胞內源性鈣離子釋放到胞質中，鈣離子與鈣調素(calmodulin)結合后進一步激活

10、 pghs導致pg合成增加，胞質鈣離子水平升高也可以pkc后進一步激活pghs 導致pg合成增加；(2)plc催化二磷酸甘油酯生成三磷酸肌醇(inositol triphosphate,ip3)和二脂酰甘油(diacylglycerol,dag)，ip3和dag 都能激活pkc后進一步激活pghs導致pg合成增加。3 lhr的表達及其調控不同物種之間lhr的加工過程具有很大的差異性，人表達的lhr主要是以90 kda的成熟形式存在，而大鼠表達的lhr則主要以70 kda的前體形式存在。最近有研究表明，lhr的胞外域是lhr最終加工成熟并在細胞表面表達的決定性因素15。人lhr mrna有四種形

11、式的變體，其中全長的形式稱作lhra，最短的形式稱作lhrd，lhrd編碼一個缺少跨膜域和羧基末端區(qū)的蛋白。在卵巢周期的不同階段，lhra和lhrd的表達具有極顯著的差異。在黃體期，lhra的表達量降低，而lhrd的表達量則升高。cos-7細胞中表達的lhrd不能對lh的刺激產生應答反應，同時表達lhra和lhrd的cos-7細胞中，lhra也不能對lh的刺激產生應答反應，這說明截短的lhrd對lhra的信號傳遞具有抑制作用16。甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase,mvk)具有結合lhr mrna并降低其穩(wěn)定性的作用，而雌激素(estrogens，e)和fsh能降低大鼠顆粒細胞中

12、mvk結合lhr mrna的水平，從而增加lhr mrna的穩(wěn)定性，最終增加lhr mrna的表達量17,18。lhr在卵巢中的表達受到甲羥戊酸介導的轉錄后調控，這使得lhr的表達與膽固醇代謝聯(lián)系起來19。最近有研究表明，lhr mrna的減量調節(jié)是由lrbp(lh receptor mrna binding protein,lrbp)介導并通過lh調節(jié)的erk1/2信號通路實現(xiàn)的20。 4 lhr基因突變與疾病促性腺激素基因的突變非常少，而它們各自受體基因的突變頻率相對就高很多。受體基因突變可分成激活突變和失活突變，lhr基因激活突變主要導致男性性早熟(familial male-limit

13、ed precocious puberty,fmpp)，而對女性無影響，失活突變則主要導致男性假兩性畸形(male pseudohermaphrodism)與間質細胞發(fā)育不良綜合征(leydig cell hypoplasia,lch)，對女性也產生很大影響21。大部分的lhr基因突變位于編碼區(qū)，這會引起lh與lhr結合及其信號傳導的障礙。已發(fā)現(xiàn)的與fmpp表型和lch表型相關的lhr基因突變列于表1和表2。據(jù)報道，一位lhr ala593pro純合突變女患者，其體內fsh、lh水平偏高，雌激素和孕激素水平較低，有低雌激素分泌的征象，如骨密質降低和小子宮，并且表現(xiàn)為原發(fā)性閉經。經組織學檢查發(fā)現(xiàn)

14、，該患者存在各個階段的卵泡，但不能排卵，因而表現(xiàn)為原發(fā)性閉經。從該患者的情況可以看出，單獨的fsh可以維持卵泡的生長與發(fā)育，但lh對于排卵則是必需的33。人lhr mrna剪接突變(c.537-3ca)會使其mrna剪接時跳過外顯子7，最終導致男性假兩性畸形34。女性攜帶lhr基因d556h激活突變時不表現(xiàn)為性早熟，卵巢功能也表現(xiàn)正常。而在同一基因突變(d556h)的小鼠模型中，雌鼠表現(xiàn)為性早熟和卵巢退化的現(xiàn)象比雄鼠嚴重，這和人的表型相反35。 lhr在原發(fā)性醛固酮增多癥患者體內表達異常，其表達量比正常值高95倍，這可能說明lhr具有調節(jié)醛固酮分泌的作用36。lhr在前列腺癌細胞的類固醇生成過

15、程中也具有調節(jié)作用，lh介導激活的lhr能極大地上調合成類固醇所需的基因和酶的表達，并增加前列腺癌細胞中類固醇的產量37。表 1 男性性早熟相關的lhr基因突變table.1 activating mutations of the lhr in fmpplhr基因變化lhr蛋白質變化突變位置遺傳特性參考文獻c 1103 tleu 368 protm家族性遺傳（1例）25c 1118 tala 373 valtm家族性遺傳（4例），偶發(fā)病例（1例）22t 1193 cmet 398 thrtm 家族性遺傳（6例），偶發(fā)病例（5例）26,27t 1370 gleu 457 argtm 偶發(fā)病例（1

16、例）22a 1624 cile 542 leutm 家族性遺傳（9例），偶發(fā)病例（1例）22a 1691 gasp 564 gly3rd cytoplasmic loop家族性遺傳（3例），偶發(fā)病例（2例）23a 1691 tasp 564 val3rd cytoplasmic loop偶發(fā)病例（1例）22c 1703 tala 568 val3rd cytoplasmic loop家族性遺傳（2例）偶發(fā)病例（2例）22,25g 1713 amet 571 iletm 家族性遺傳（2例）22c 1715 tala 572 valtm 家族性遺傳（1例），偶發(fā)病例（2例）22a 1723 cil

17、e 575 leutm 家族性遺傳（3例），偶發(fā)病例（1例）22c 1730 tthr 577 iletm 家族性遺傳（4例）22g 1732 tasp 578 tyrtm 偶發(fā)病例（4例）22a 1733 gasp 578 glytm 家族性遺傳（50例），偶發(fā)病例（10例）22t 1734 aasp 578 glutm 家族性遺傳（1例）22t 1741 ccys 581 argtm 家族性遺傳（1例）22g 1850 acys 617 tyrtm 偶發(fā)病例（1例）24表 2 間質細胞發(fā)育不全相關的lhr基因突變table.2 inactivating mutations of the l

18、hr in lhclhr基因變化lhr蛋白質變化位置遺傳特性參考文獻54位堿基后插入33bp插入11個氨基酸胞外域雜合突變（1例）22606680堿基缺失外顯子8缺失胞外域雜合突變（1例）22a 340 tile 114 phe3rdleucine-rich repeat雜合突變（1例）23t 391 ccys 131 arg胞外域純合突變（1例）22g 430 tval 144 phe胞外域純合突變（1例）31t 579 gphe 194 val胞外域純合突變（1例）29t 1027 acys 343 ser胞外域雜合突變（1例）22g 1060 aglu 354 lys胞外域純合突變（1例

19、）22基因組中缺失5kb外顯子10缺失胞外域純合突變（1例）28t 1505 cleu 502 protm 純合突變（1例）30t 1627 ccys 543 argtm 雜合突變（1例）22c 1635 acys 545 stoptm 雜合突變（1例）22c 1660 targ 554 stop3rd cytoplasmic loop雜合突變（1例）22g 1777 cala 593 protm 純合突變（2例），純合突變（1例）2218221827堿基缺失608leu，609val缺失tm 純合突變（1例）22t 1827 gtyr 612 stoptm 純合突變（1例）32c 1847

20、aser 616 tyrtm 純合突變（1例），雜合突變（1例）22t 1874 aile 625 lystm 純合突變（1例）225 lhr基因的研究進展及編碼區(qū)序列的同源性分析目前genbank已公布的人、鼠與主要畜禽lhr基因編碼區(qū)序列同源性比較結果見表3和圖1。在lhr基因的研究方面，人lhr基因研究得最深入，2005年4月15日公布了人lhr基因的dna全序列（genbank,ac087816）。人lhr基因位于2號染色體，定位在2p21，基因全長68968bp，mrna全長3093bp（genbank，nm000233.3），由11個外顯子和10個內含子組成，編碼區(qū)序列長2100b

21、p（genbank，m63108.1）。對畜禽lhr基因的研究也取得了很大進展，豬、牛和雞lhr基因的cdna均已克隆出來，同時也已獲得它們的lhr基因全序列，它們的lhr基因分別位于3號、11號和3號染色體上（genbank，）。表3 lhr基因編碼區(qū)序列同源性比較結果表tab.3 the homology analysis results of lhr coding sequences(%)物種人鼠牛豬猴狗貂雞人83.989.089.595.089.889.771.4鼠83.984.284.583.485.284.470.9牛89.084

22、.293.489.191.491.572.7豬89.584.593.489.292.192.071.9猴95.083.489.189.289.489.171.0狗89.885.291.492.189.495.172.1貂89.784.491.592.0雞71.470.972.771.971.072.171.3圖 1 lhr基因進化樹fig 1 phylogeny of lhr gene從lhr基因編碼區(qū)的同源性比較結果可以看出哺乳動物之間的同源性比較高，特別是人與猴及狗與貂之間的同源性，竟高達95%，牛、豬、狗和貂之間的同源性也均高于90%。這對進一步研究畜禽的lhr基

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