生物化學(xué)實(shí)習(xí)報(bào)告

1、生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn) 實(shí)習(xí)報(bào)告 院 系：理 學(xué) 院 專 業(yè)：應(yīng) 用 化 學(xué) 學(xué) 號： 20110153013 姓 名：黃 學(xué) 云 指導(dǎo)教師：任梅蓉 李靖 趙寧 賈璐 日 期：2013年06月21日 目 錄序言2實(shí)驗(yàn)一、各種谷物中營養(yǎng)成分的測定4一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)原理4三、實(shí)驗(yàn)器材5四、實(shí)驗(yàn)步驟5 （一） 玉米粉中粗蛋白的測定6 （二）玉米粉中粗脂肪的測定7 （三）玉米粉中還原糖及總糖的測定8 （四）玉米粉中灰分及水分的測定10五、結(jié)果處理 11六、結(jié)論 15七、注意事項(xiàng) 15八、討論 15實(shí)驗(yàn)二、苯丙氨酸解氨酶的純化及活性測定16 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?6 二、實(shí)驗(yàn)原理16三、實(shí)驗(yàn)器材17四、實(shí)驗(yàn)步驟1

2、8 五、結(jié)果處理21六、結(jié)論22七、注意事項(xiàng)23八、討論23序言 生物化學(xué)是用化學(xué)的原理和方法，研究生命現(xiàn)象的學(xué)科。通過研究生物體的化學(xué)組成、代謝、營養(yǎng)、酶功能、遺傳信息傳遞、生物膜、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及分子病等闡明生命現(xiàn)象。生物體內(nèi)幾乎所有的化學(xué)反應(yīng)都是酶催化的。酶的作用具有催化效率高、專一性強(qiáng)等特點(diǎn)。酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、反應(yīng)動力學(xué)及作用機(jī)制、酶活性的調(diào)節(jié)控制等是酶學(xué)研究的基本內(nèi)容。通過x射線晶體學(xué)分析、化學(xué)修飾和動力學(xué)等多種途徑的研究，一些具有代 表性的酶的作用原理已經(jīng)比較清楚。70年代發(fā)展起來的親和標(biāo)記試劑和自殺底物等專一性的不可逆抑制劑已成為探討酶的活性部位的有效工具。多酶系統(tǒng)中各種酶的協(xié)同作

3、用，酶與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的相互作用以及應(yīng)用蛋白質(zhì)工程研究酶的結(jié)構(gòu)與功能是酶學(xué)研究的幾個(gè)新的方向。酶與人類生活和生產(chǎn)活動關(guān)系十分密切，因此酶在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、國防和醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用一直受到廣泛的重視。 生物化學(xué)對其他各門生物學(xué)科具有深刻的影響，最緊密的有細(xì)胞學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)等領(lǐng)域。通過對生物高分子結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行深入的研究，揭示了生物體物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換遺傳信息傳遞、光合作用、神經(jīng)傳導(dǎo)、肌肉收縮、激素作用、免疫和細(xì)胞間通訊等許多奧秘，使人們對生命本質(zhì)認(rèn)識躍進(jìn)到一個(gè)嶄新的階段。應(yīng)用一直受到廣泛的重視。分離純化意義：（1）分離大分子，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動規(guī)律有重要意義（2）滿

4、足工業(yè)生產(chǎn)的需要（3）滿足醫(yī)療的需要（4）滿足基因工程的需要 生物體內(nèi)幾乎所有的化學(xué)反應(yīng)都是酶催化的。酶的作用具有催化效率高、專一性強(qiáng)等特點(diǎn)。酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、反應(yīng)動力學(xué)及作用機(jī)制、酶活性的調(diào)節(jié)控制等是酶學(xué)研究的基本內(nèi)容。通過x射線晶體學(xué)分析、化學(xué)修飾和動力學(xué)等多種途徑的研究，一些具有代 表性的酶的作用原理已經(jīng)比較清楚。70年代發(fā)展起來的親和標(biāo)記試劑和自殺底物等專一性的不可逆抑制劑已成為探討酶的活性部位的有效工具。多酶系統(tǒng)中各種酶的協(xié)同作用，酶與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的相互作用以及應(yīng)用蛋白質(zhì)工程研究酶的結(jié)構(gòu)與功能是酶學(xué)研究的幾個(gè)新的方向。酶與人類生活和生產(chǎn)活動關(guān)系十分密切，因此酶在工農(nóng)業(yè)

5、生產(chǎn)、國防和醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用一直受到廣泛的重視。生物大分子的分離純化一般可以分為以下幾個(gè)階段：1材料的選擇和預(yù)處理；2破碎細(xì)胞及提?。?分離和純化：包括粗分級分離和細(xì)分級分離；其中前兩個(gè)階段為生物大分子分離純化的前處理。離心的原理：將樣品放入離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的離心管內(nèi)，離心機(jī)驅(qū)動時(shí)，樣品液就隨離心管做勻速圓周運(yùn)動，于是就產(chǎn)生了一個(gè)向外的離心力。由于不同顆粒的質(zhì)量，密度，大小及形狀等彼此各不相同，在同一固定大小的離心場中沉降速度也就不同，由此便可以得到相互間的分離。受到的力：離心力、介質(zhì)的摩擦阻力、浮力、重力及重力浮力(均可忽略不計(jì)) 本次試驗(yàn)包括“各谷物中營養(yǎng)成分的測定”和“苯丙氨酸解氫酶的純化及活性測

6、定”兩個(gè)試驗(yàn)。 苯丙氨酸解氨酶（l-phenylalanine：ammonie lyase，簡稱pal；ec4.3.1.5）是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等的合成密切相關(guān)。在植物生長發(fā)育和抵制病菌侵害的過程中起重要作用。pal催化l-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸在290nm處有強(qiáng)大的吸收值。規(guī)定1h內(nèi)增加0.01為pal的一個(gè)活力單位。酶的比活力是指樣品中每毫克蛋白所含的酶活力單位數(shù)。在實(shí)驗(yàn)中將會看到隨著pal的逐步被純化，其比活力也在逐步增加。 在蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的中性鹽（如硫酸銨、硫酸鈉等）使蛋白質(zhì)沉淀析出稱為鹽析。溶液的鹽濃度通

7、常以鹽溶液的飽和度表示，飽和溶液稱100%飽和度。沉淀一種酶所需的具體濃度需要經(jīng)試驗(yàn)確定。谷類含蛋白質(zhì)在8-12%之間，因谷粒外層蛋白質(zhì)較里層含量高，因此，精制的大米和面粉因過多的去除外皮，使蛋白質(zhì)含量較粗制的米和面低。谷類脂肪含量較少，約2%，但玉米和小米可達(dá)到4%,主要存在于糊粉層及谷胚中。大部分為不飽和脂肪酸，還有少量磷脂。胚芽油中含有較多的維生素e，有抗氧化作用?！菊勘敬卧囼?yàn)主要測定苯丙氨酸解氨酶的純化及活性測定和各種谷物中營養(yǎng)成分的測定這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)【關(guān)鍵詞】苯丙氨酸解氨酶、sephadexg-25、層析、dns試劑、凱氏定氮法、索氏提取脂肪法實(shí)驗(yàn)一各種谷物中營養(yǎng)成分的測定一、 目的

8、1.掌握樣品中蛋白質(zhì)含量測定的方法之一凱氏定氮法2.掌握測定食物中的灰分、水分、油脂及碳水化合物的方法二、 原理谷物是人類特別是發(fā)展中國家人民的主要蛋白質(zhì)來源，谷物中蛋白質(zhì)的含量是衡量其品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值的最重要的指標(biāo)。培育高蛋白質(zhì)谷物品種，是廣大育種工作者的奮斗目標(biāo)。對現(xiàn)有谷物進(jìn)行評價(jià)、利用，對大批原材料（種質(zhì)資源）及育成品系篩選，都需要測定種子蛋白質(zhì)的含量。測定種子蛋白質(zhì)含量的方法很多，一般可以分為間接方法和直接方法兩類。凱氏定氮法是間接方法中的一種，國際谷物化學(xué)委員會（icc）、美國分析化學(xué)協(xié)會（aoac）、美國谷物化學(xué)協(xié)會（aacc）等不少國際機(jī)構(gòu)都將凱氏定氮法定為標(biāo)準(zhǔn)方法。 蛋白質(zhì)是生命

9、的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分，蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物，是有機(jī)形態(tài)氮的表現(xiàn)形式。樣品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后在用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量。用反應(yīng)式表示如下：2nh2(ch2)2cooh+13h2so4(nh4)2so4+6co2+12so2+16h20(nh4)2so4+2noh2nh3+ na2so4 +2h2o2nh3+4h3bo3(nh4)2b4o7+5h2o(nh4)2b4o7+2hcl+5h2o2nh4c+4h3bo4三、儀器、試劑和材料、儀器：（1）凱

10、氏定氮儀；（2）索氏抽提器；（3）馬弗爐；（4）微量滴定管；（5）722n型可見分光光度計(jì)；（6）干燥器；（7）烘箱；（8）電子天平；（9）恒溫水浴鍋；（10）瓷坩堝；（11）稱量瓶；（12）燒杯、容量瓶、刻度吸管；（13）電爐；2、實(shí)驗(yàn)試劑；（1）hcl(0.1mol/l);（2）naoh(40%);（3）硼酸溶液（4%）;（4）濃硫酸;（5）硫酸銅和硫酸鉀;（6）3，5二硝基水楊酸;（7）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（1mg/ml）;（8）無水乙醚;（9）碘-碘化鉀溶液;3、實(shí)驗(yàn)材料；玉米粉、面粉和大米粉四、實(shí)驗(yàn)步驟、玉米粉、面粉和大米粉中粗蛋白的測定（凱氏定氮法）（一）實(shí)驗(yàn)步驟；消化） 消化樣品前，要

11、將實(shí)驗(yàn)儀器洗干凈并烘干。同時(shí)將樣品研磨。） 用電子天平稱取0.5000g樣品粉末（米粉、面粉、玉米粉），用硫酸紙橋加入消化管底部。（注意：稱量藥品時(shí)要用硫酸紙；加樣品時(shí)避免將樣品沾到消化管壁） 稱取0.5000g硫酸銅（催化劑）和3.0000g硫酸鉀（提高硫酸的沸點(diǎn)）加入消化管。） 用移液管取10ml濃h2so4加入消化管（注意：濃硫酸具有強(qiáng)烈的腐蝕性，避免占到皮膚、衣服以及地面；如有濺出立即清洗） 另外做兩支空白樣，消化管里加入0.5000g葡萄糖，其他與上管相同。） 架好消化管，將消化管的橫梁密封好，兩端皮管接好通入盛滿水的水桶。） 接通電源，初始消化時(shí)電壓調(diào)至90v，半小時(shí)后調(diào)至180v

12、。消化液變至綠色繼續(xù)加熱半小時(shí)。關(guān)閉電源前，要先將皮管從桶里拿出，關(guān)閉電源。） 靜置至消化管變冷，備用蒸餾。2 蒸餾） 定氮前，要按說明接好水管，檢查儀器是否正常。） 用一只消化管接在蒸汽入口處，要密封，再放250ml的三角錐瓶在氨的出口管，打開冷凝水，開啟儀器，蒸汽清洗定氮儀半小時(shí)。（將naoh管通入50%naoh溶液中，打開naoh開關(guān)，抽提溶液進(jìn)入消化管中，關(guān)閉naoh開關(guān)，為了讓整個(gè)naoh管路中的水被naoh替換） 清洗完畢后，關(guān)閉電源。用盛有樣品的消化管換下空消化管，用盛有50ml的4%的硼酸的三角錐瓶替換空三角錐瓶，加1-2滴指示劑到硼酸三角錐瓶中，升高三角錐瓶直至出氮的玻璃管完

13、全浸入硼酸液面下。） 將naoh管通入50%的naoh溶液中，打開naoh開關(guān)，進(jìn)50ml的溶液進(jìn)入消化管中，關(guān)閉naoh開關(guān)。） 打開進(jìn)水開關(guān)，儀器啟動完畢。） 當(dāng)三角錐瓶中的溶液顏色變?yōu)樗{(lán)色繼續(xù)蒸餾10分鐘，調(diào)低三角錐瓶，用洗瓶沖洗氨出口管，關(guān)閉定氮儀。） 用空消化管替換蒸餾完畢的消化管，同時(shí)用空三角錐瓶替換溶液變?yōu)樗{(lán)色的三角錐瓶。啟動儀器，并將naoh管通入蒸餾水中，打開naoh開關(guān)，吸取三次蒸餾水，沖洗管道中濃堿。清洗半小時(shí)。關(guān)閉儀器。） 用0.1mol/l 的hcl滴定變色溶液，直至溶液變?yōu)闆]有通入氨前的顏色。記錄體積。） 計(jì)算樣品的含氮量。3樣品含氮量的計(jì)算=0.1mol/lv滴定

14、體積14含氮系數(shù)m樣品總質(zhì)量100%（含氮系數(shù)隨種子的不同而不同）b、粗脂肪的測定（索氏法）1.將抽提瓶洗干凈后放入幾粒沸石，然后放到烤箱中恒溫干燥至恒重備用。2.將水浴鍋加入純凈水備用。3.稱取實(shí)驗(yàn)用材料（玉米粉）5.000g，用濾紙包裹后放入抽提筒中，慢慢加乙醚于抽提筒中至溶劑稍高于虹吸管，使乙醚流入燒瓶中，然后再加入乙醚至虹吸管1/3處（注：所加乙醚不能超過50ml），裝上冷凝管回流提取，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度，使乙醚冷凝后下滴速為2滴/秒。4.提取1.5小時(shí)后，當(dāng)乙醚從提取器中全部回?zé)恐斜憧赏Ｖ辜訜?，提高冷凝管，用鑷子取出濾紙筒，再放下冷凝器，繼續(xù)蒸餾，當(dāng)乙醚快要達(dá)到虹吸管高度時(shí)停止加熱，待

15、冷凝管中不再滴下乙醚后，移走冷凝管，取出提取筒，將乙醚由虹吸管中倒入回收瓶中，重新裝好儀器，繼續(xù)蒸餾，至冷凝管中不再滴下乙醚時(shí)即可停止加熱5.拆下儀器，取出平底燒瓶放入烤箱中恒溫干燥至恒重，用減量法稱出油脂質(zhì)量，計(jì)算含油率含油量=m油脂質(zhì)量m總質(zhì)量100%c、還原糖及總糖測定（3，5-二硝基水楊酸比色法）一、實(shí)驗(yàn)原理植物體內(nèi)的還原糖，主要是葡萄糖、果糖和麥芽糖。他們在體內(nèi)的分布，不僅反映植物體內(nèi)碳水化合物的運(yùn)轉(zhuǎn)情況，而且也是呼吸作用的基質(zhì)。還原糖還能形成其他物質(zhì)如有機(jī)酸等；此外，水果，蔬菜中含糖量的多少，也是鑒定其品質(zhì)的重要指標(biāo)。還原糖在有機(jī)體的代謝中起著重要的作用，其他碳水化合物，如淀粉、蔗

16、糖等，經(jīng)水解也能生成還原糖。各種單糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用溶解度的不同，可以將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，再用酸水解法使沒有還原性的雙糖和多糖徹底水解成還原性的單糖。在堿性條件下，還原糖與3，5-二硝基水楊酸共熱，3，5-二硝基水楊酸被還原為3-氨基-5-硝基水楊酸（棕紅色物質(zhì)），還原糖則被氧化成糖酸和其他產(chǎn)物。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度呈一定的比例關(guān)系，在540nm波長下測定棕紅色物質(zhì)的吸光值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可分辨出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解成單糖時(shí)，每斷裂一個(gè)糖苷鍵需要加入一分子水，所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以0

17、.9。二、儀器、試劑和材料1.儀器（1）離心管或玻璃漏斗2（2）燒杯：1001（3）三角瓶：1001（4）容量瓶：1003（5）刻度吸管：1ml1;2ml4;10ml1（6）恒溫水浴鍋（7）電爐（8）離心機(jī)（9）電子天平（10）分光光度計(jì)2.試劑（1）1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(2)3，5-二硝基水楊酸（nds）試劑（3）碘-碘化鉀溶液（4）酚酞指示劑（5）6m hcl和6m naoh 各100ml三、操作步驟1.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7支20ml具塞刻度試管編號，按表一分別加入濃度為1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、蒸餾水和3，5-二硝基水楊酸（nds）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。試劑管

18、號123456葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）00.10.20.30.40.5蒸餾水（ml）10.90.80.70.6053，5-二硝基水楊酸(ml)0.750.750.750.750.750.75將各管搖勻，在沸水域中加熱5min，取出后立即冷卻至室溫，再加入蒸餾水9ml，混勻。在540nm波長下，以一號管調(diào)零，分別測定其余試管的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品中還原糖和總糖含量的測定（1）樣品中還原糖的提?。簻?zhǔn)確稱量3g玉米粉，放在100ml三角瓶中，先以少量的蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加入50ml蒸餾水，攪勻，至于50恒溫水浴鍋中保溫20min，使還原糖浸出，將浸出液

19、（含沉淀）轉(zhuǎn)移到六支10ml離心管中，于4000r/min下離心5min，沉淀可用20ml蒸餾水洗一次，再離心，將兩次離心的上清夜收集在100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液。（2）總糖的水解和提?。簻?zhǔn)確稱取1.00g玉米粉，放入100ml三角瓶中，用15ml蒸餾水及10ml 6m hcl,置沸水域中加熱水解30min（水解是否完全可用碘-碘化鉀溶液檢查），待三角瓶中的水解液冷卻后，加入一滴酚酞指示劑，用6mol/l naoh中和至微紅色，在100ml容量瓶中用蒸餾水定容，混勻。將定容后水解液過濾，取濾液10ml，移入另一100ml容量瓶定容，混勻，作為總糖待測液。（3

20、）顯色和比色取4支試管，編號，按下表所示操作管號還原糖測定管號總糖測定管號1212還原糖待測液（ml）0.50.5總糖待測液（ml）0.50.5蒸餾水（ml）0.50.50.50.53，5-二硝基水楊酸(ml)0.750.750.750.75加入試劑后，在沸水域中加熱5min，冷卻至室溫，在540nm波長處測吸光值。d、樣品中灰分及水分的測定（恒重法）：（一）樣品中灰分的測定1洗兩個(gè)瓷坩堝放到烤箱中干燥后，用鉛筆在瓷坩堝上標(biāo)記，放到馬弗爐中恒重2小時(shí)（馬弗爐的溫度為600）；2.待溫度降到200左右時(shí)，將瓷坩堝取出放到干燥器中冷卻至室溫，用電子天平準(zhǔn)確稱出其質(zhì)量，記下數(shù)據(jù)；3.繼續(xù)將瓷坩堝放到

21、馬弗爐中恒重1小時(shí)，取出冷卻后準(zhǔn)確稱出其質(zhì)量，記下數(shù)據(jù)，兩次數(shù)據(jù)相對誤差不超過萬分之五就可使用；4.將瓷坩堝放到電子天平上，分別稱取玉米粉1.000g放入其中，然后在電爐上碳化至無青煙飄出后，把瓷坩堝放到馬弗爐中（馬弗爐的溫度為600），四小時(shí)后關(guān)閉馬弗爐電源，待溫度降到200左右時(shí)，取出瓷坩堝冷卻后稱出質(zhì)量；5.再將瓷坩堝放回馬弗爐中恒溫1小時(shí)，待溫度降到200左右時(shí)，取出瓷坩堝冷卻后稱出質(zhì)量；兩次數(shù)據(jù)相對誤差不超過萬分之五即可；6.計(jì)算灰分含量=m灰分質(zhì)量m樣品質(zhì)量100%（二）樣品中水分測定1.將兩個(gè)洗凈的稱量瓶放到烤箱中恒溫干燥至恒重；2.分別稱取玉米粉2g與稱量瓶中，然后放到烤箱中恒

22、溫干燥至恒重；3.用減量法稱出稱量瓶的質(zhì)量，計(jì)算水分含量=m水分m樣品質(zhì)量100%五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算（一）玉米粉中粗蛋白的測定消化管號1234葡萄糖質(zhì)量（g）0.54410.5123玉米粉質(zhì)量（g）0.50080.5302硫酸銅質(zhì)量（g）0.53050.52670.53790.5208硫酸鉀質(zhì)量（g）3.07913.01023.05553.0769濃硫酸體積（ml）10101010滴定消耗hcl(ml)3.633.8200含氮量%6.09%6.05%00=0.1mol/lv滴定體積14含氮系數(shù)m樣品總質(zhì)量100%1=0.10.00363146.00.5008100%=6.09%2=0.10.0

23、0382146.00.5302100%=6.05%=(1+2)2=（6.09%+6.05%）2=6.07%（二）粗脂肪的測定抽提瓶編號12恒重抽提瓶及沸石總質(zhì)量（）97.886792.0005玉米粉質(zhì)量（）5.02315.0024干燥后抽提瓶及油脂總質(zhì)量（）98.031692.1487粗脂肪質(zhì)量（）0.14490.1482含油量（）2.88%2.96%平均含油量（%）2.92%含油量=m油脂質(zhì)量m總質(zhì)量100%1=98.0316-97.88675.0231100%=2.88%2=92.1487-92.00055.0024100=2.96%=(1+2)2=2.92%（三） 樣品中還原糖和總糖的含

24、量測定1. 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線管號123456葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）00.10.20.30.40.5蒸餾水（ml）10.90.80.70.6053，5-二硝基水楊酸(ml)0.750.750.750.750.750.75吸光度a54000.1150.2870.4680.6470.794由上表繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：2. 還原糖和總糖測定還原糖%=查曲線所得還原糖質(zhì)量（mg)測定時(shí)取用體積提取液總體積樣品質(zhì)量（mg)100%總糖%=查曲線所得水解后還原糖質(zhì)量（mg)稀釋倍數(shù)樣品質(zhì)量（mg)100%管號還原糖測定管號總糖測定管號1212還原糖待測液（ml）11總糖待測液（ml）0.50.5蒸餾水

25、（ml）0.50.50.50.53，5-二硝基水楊酸(ml)0.750.750.750.75吸光值a54001890.1920.3260.303平均吸光值a5400.19050.3145對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖含量（mg）0.13120.2069由以上數(shù)據(jù)可計(jì)算得：還原糖%=07100%=0.43%總糖%=0.20691025.4100%=0.02%（四）灰分及水分測定1.灰分測定坩堝編號12恒重坩堝質(zhì)量（）32.818231.6444玉米粉質(zhì)量（）1.07681.0114坩堝及灰分質(zhì)量（）32.828131.6530灰分含量（）0.919%0.850%計(jì)算公式：=m灰分質(zhì)

26、量m樣品質(zhì)量100%1=32.8281-32.81821.0768100%=0.919% 2=31.6530-31.64441.0114100%=0.850%則：=（0.919%+0.850%）/2=0.8845%2.水分測定稱量瓶編號12恒重后稱量瓶質(zhì)量（）19.495215.3729玉米粉質(zhì)量（）2.01262.0240干燥后稱量瓶及玉米粉質(zhì)量（）21.344717.2339干燥后玉米粉質(zhì)量（）1.84951.861水分（）0.16310.1630含水量（）8.10%8.05%計(jì)算公式：=m水分m樣品質(zhì)量100%1=2.0126-（21.3447-19.4952）2.0126100%=8.

27、10%2=2.0240-（17.2339-15.3729）2.0240100%=8.05%則：=（8.10%+8.05%）/2=8.075%六 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)通過測量粗脂的含量，灰分，水分，含氮量的測定，以試驗(yàn)數(shù)據(jù)充分知道了玉米粉的各項(xiàng)含量，對本實(shí)驗(yàn)含氮量了解了玉米粉中的營養(yǎng)成分的多少。實(shí)驗(yàn)以對照組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，增加了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。七 注意事項(xiàng) 1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品的含糖量測定應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，一起顯色和比色。 2.用乙醚提取還原性糖類。 3.在做樣品還原糖的實(shí)驗(yàn)時(shí)一定不要取到沉淀，沉淀對測量有影響。八、討論1、索氏提取脂肪為什么提取的是粗脂肪，提取時(shí)應(yīng)該注意哪些問題?答：所有溶于提取液的物質(zhì)都會被

28、提取出來，溶于提取液的物質(zhì)除了脂肪外，還有別的物質(zhì)，所以提取出來的是粗脂肪。1接好裝置,保證密閉性.2用濾紙或?yàn)V布包好要提取的東西,放在索氏提取器里面,從上端加入提取液,注意提取液的高度不要超過虹吸管上端2、凱氏定氮法的適用范圍及其優(yōu)缺點(diǎn)是什么？答：凱氏定氮針對有機(jī)氮化合物,主要是指蛋白質(zhì),核酸,尿素以及大量合成的氮為負(fù)三價(jià)的有機(jī)氮化合物.它不包括疊氮化合物,聯(lián)氮,偶氮,腙,硝酸鹽,亞硝酸鹽,硝基,腈,肟和半卡巴腙類的含氮化合物.凱氏定氮法只是一個(gè)氧化還原反應(yīng),把低價(jià)氮氧化并轉(zhuǎn)為氨鹽來測定,而不能把高價(jià)氮還原為氮鹽的形式,所以不可以測出物質(zhì)中所有價(jià)態(tài)的氮含量.實(shí)驗(yàn)二 苯丙氨酸解氨酶的純化及活性

29、測定一、目的1. 掌握大分子分離純化的一般步驟和原則；2. 了解層析技術(shù)、離心技術(shù)。超過濾技術(shù)的原理及應(yīng)用；3. 學(xué)習(xí)一種常用的酶活力測定方法；二、原理苯丙氨酸解氨酶（l-phenylalanine:ammonia lyase,簡稱pal；ec4.3.1.5）是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等的合成密切相關(guān)。在植物生長發(fā)育和抵制病菌侵害的過程中起重要作用。pal催化l-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸在290nm處有強(qiáng)大的吸收值。規(guī)定1h內(nèi)增加0.01為pal的一個(gè)活力單位。酶的比活力是指樣品中每毫克蛋白所含的酶活力單位數(shù)。在實(shí)驗(yàn)中將會看到隨著p

30、al的逐步被純化，其比活力也在逐步增加。在蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的中性鹽（如硫酸銨、硫酸鈉等）使蛋白質(zhì)沉淀析出稱為鹽析。溶液的鹽濃度通常以鹽溶液的飽和度表示，飽和溶液稱100%飽和度。沉淀一種酶所需的具體濃度需要經(jīng)試驗(yàn)確定。 sephadex（交聯(lián)葡萄糖凝膠）是由細(xì)菌葡聚糖長鏈，用交聯(lián)劑1-氯2-，3-環(huán)氯丙烷交聯(lián)而成。凝膠商品名后面的g值表示每克干膠吸水量（毫升數(shù)）的10倍。交聯(lián)度大，網(wǎng)孔??；交聯(lián)度小，網(wǎng)孔大。交聯(lián)度的大小還與凝膠顆粒的機(jī)械強(qiáng)度有關(guān)，交聯(lián)度大，機(jī)械強(qiáng)度也大（硬膠），在柱層析中流速快。根據(jù)需要，選用一定型號的凝膠柱做柱層析介質(zhì)（蛋白脫鹽一般用g-25或g-50，g-100g-2

31、00分離不同分子質(zhì)量的蛋白組分）。由于被分離物質(zhì)的分子大小和形狀不同，分子質(zhì)量大的進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔中被阻滯，從而后流出層析柱，達(dá)到分離的目的。 deae纖維素是以天然纖維素為母體聯(lián)接了二乙基氨基制備而成的。deae纖維素柱層析屬于陰離子交換層析的一種，deae纖維素經(jīng)過處理上柱后，由于靜電吸力等可吸引在固定相和流動相中的一些陰離子（如oh-、cl-等）。蛋白質(zhì)粉在水溶液中可以做兩性解離，控制溶液ph，可使蛋白質(zhì)分子成為陰離子。對于deae纖維素而言，應(yīng)使酶溶液ph大于酶蛋白分子的ph，使其成為陰離子。在實(shí)驗(yàn)中還要測定蛋白質(zhì)的含量，用考馬斯亮藍(lán)法?？捡R斯亮藍(lán)法是染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)在游離狀態(tài)

32、下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者的最大光吸收?56nm處。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0-100微克/毫升），蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在波長595nm處的光吸收與蛋白質(zhì)的含量呈正比，故可以用于蛋白質(zhì)的定量測定，而且該反應(yīng)非常靈敏，可用于測定微克級蛋白含量。三、實(shí)驗(yàn)器材1. 儀器(1) 高速冷凍離心機(jī)(2) 研缽(3) 恒溫水浴鍋(4) 電子天平(5) 試管、燒杯(6) 量杯(7) 量筒(8) 層析柱(9) 移液管（10）膠頭滴管（11）蛋白質(zhì)核酸自動分析儀（12）紫外分光光度儀（13）可見分光光度儀等2.試劑(1)0.1mol/l硼酸-硼砂緩沖液（ph=8.7）(2)酶提取液0.1mol/

33、l(3)6mol/l的hcl(4)固體硫酸銨(5)0.02mol/l磷酸鹽緩沖溶液（ph=8.0，含0.5mmol/l edta,2.5%甘油，20nlmol/l.- 基乙醇）(6)sephadexg-25(7)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（0.1ug/ml）(8)考馬斯亮藍(lán)g-250蛋白質(zhì)染色液（稱取10mg考馬斯亮藍(lán)g-250，溶于5ml95%乙醇中，加入85%（w/v）磷酸10ml，混勻后即為母液。用時(shí)按15ml母液加85ml蒸餾水的比例稀釋，混勻后過濾即為稀釋液(9)0.6mol/l苯丙氨酸溶液3.材料：馬鈴薯四、操作步驟1.酶液提?。?）用電子天平稱取馬鈴薯5g，切成小塊，加入10ml酶提取液，于

34、冰浴上同時(shí)加石英砂，用研缽研成漿。（2）用膠頭滴管漿已經(jīng)勻漿的酶液轉(zhuǎn)入離心管，再用少量的提取液沖洗研缽及研棒，將沖洗液轉(zhuǎn)移到同一個(gè)離心管中，在8000轉(zhuǎn)下離心15分鐘。（3）取離心后的上清液（即粗酶提取液），倒入量筒量出其體積。（4）從粗酶提取液中吸出1ml于eppendorf管中放入冰箱，作為后面活力測定用（貼好標(biāo)簽，置于冰箱中）。2.硫酸銨分級沉淀酶蛋白（1）余下的酶液根據(jù)實(shí)際體積、溫度和飽和硫酸銨的用量表，算出達(dá)到38%飽和度應(yīng)該加入的硫酸銨的量（38%飽和100ml加硫酸銨21.32g），并稱取硫酸銨。（2）將酶液倒入燒杯中，邊緩慢攪拌邊緩慢加入稱好的固體硫酸鐵，待全部加完后，再緩慢攪

35、拌10分鐘；然后然后于8000r/min下冷凍離心15分鐘，保留上清液于燒杯內(nèi)。（3）根據(jù)硫酸銨飽和度用量表，算出從38%到75%飽和度所需硫酸銨的用量。（4）按上述方法處理，離心后，棄去上清液，保留沉淀。（5）將沉淀溶于4ml酶抽提液中，取1ml于eppendorf管中冰箱保存，以作為后面活力測定用。3.sephedexg-25 層析脫鹽（1）凝膠溶脹：稱取sephedexg-25g，加入適量的0.02mol/l磷酸鹽緩沖溶液，在室溫下溶脹。待溶脹平衡后，虹吸去除上清夜中的細(xì)小凝膠顆粒，這樣處理2-3次。（2）裝柱：固定好層析柱，柱保持垂直，將20ml蒸餾水裝入柱內(nèi)，打開止水夾趕去出口內(nèi)氣泡

36、，當(dāng)柱內(nèi)保留1ml左右水層時(shí)，把處理好的sephedexg-25 用玻璃棒攪勻，盡量一次加入柱內(nèi)，待膠床表面僅有1-2cm液層時(shí)，旋緊止水夾。裝好的膠柱應(yīng)無氣泡、無節(jié)痕、床面平正。（3）上樣：讓膠床表面幾乎不留液層，將lml 酶液小心注入膠床面中央，注意不要沖壞床面，吸取lml 磷酸鹽緩沖液，把吸附在玻璃壁上的沉淀液洗入柱內(nèi)，在床表面僅有l(wèi)ml 左右液層時(shí)，再小心地用滴管加入5-6cm 高的磷酸緩沖液洗脫。（4）洗脫收集：取刻度試管5支（包括上面一支），編號，柱床上不斷加磷酸緩沖液洗脫，出水口用刻度試管收集處溶液。（5）將出現(xiàn)峰值的試管集中在一起。吸取1.0ml 于eppendorf管保留，以

37、作后面活力測定用。4.酶活力的測定（1）取試管4支，按下表所述加樣（0號為調(diào)零管，其余為測定管）試管編號0e1e2e30.1mol/l硼酸緩沖液（ml）5.003.903.903.90酶液（ml）0.100.100.100.06mmol/ll苯丙氨酸溶液（ml）_1.001.001.00a29000.16080.12290.0699（2）將各管混勻，放入40。c恒溫水浴鍋中保溫30min，然后加入0.2ml 2mol/l的hcl終止反應(yīng)。（3）紫外分光光度計(jì)預(yù)熱10min，于波長290nm處測定各管的a2905.蛋白質(zhì)含量測定（考馬斯亮藍(lán)染色法）（1）取第一次和第二次eppendorf管中保留的酶提取液各0.1ml，用蒸餾水稀釋50倍，取第三次eppendorf管中的酶提取液0.5ml，用蒸餾水稀釋10倍。（2）取9支試管按下表加入各種溶液，并做一組平行組。試管編號012345e1 稀釋酶液e2 稀釋酶液e3 稀釋酶液0.1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（ml）00.20.40.60.81.0稀釋酶液（ml）111蒸餾水（ml）2.