生物化學實驗教學大綱

1、湖北大學生物化學實驗（課程代碼）實驗教學大綱（第2版）生命科學學院 生化教研室2010年7月前 言課程名稱：生物化學 實驗學時：64適用專業(yè)：生物科學、生物技術(shù)、生物工程 課程性質(zhì)：必修一、 實驗課程簡介生物化學實驗課程是生命科學本科實驗教學的一個重要組成部分，實驗性質(zhì)有基礎性、綜合性、設計（創(chuàng)新）性三層次，實驗項目數(shù)共25個，按照學時要求完成必做與選做實驗。在實驗過程中要求學生自己動手，獨立觀察并完成實驗報告，注重培養(yǎng)學生創(chuàng)新思維與能力。二、課程目的通過實驗教學可以加強學生對生物化學基本知識和基本理論的理解，掌握現(xiàn)代生物科學與技術(shù)的實驗原理與技能；同時，通過實驗培養(yǎng)學生獨立觀察、思考和分析問

2、題、解決問題和提出問題的能力，養(yǎng)成實事求是、嚴肅認真的科學態(tài)度，提高學生的科學素養(yǎng)以及敢于創(chuàng)新的開拓精神。 三、考核方式及成績評定標準生物化學實驗課程考核采用筆試與操作能力二種方式；期末成績評定標準為：平時成績60%；筆試10%；操作能力30% 。四、實驗指導書及主要參考書1 陳均輝等，生物化學實驗科學出版社，2003年4月第三版2 蔣立科等，生物化學實驗設計與實踐高等教育出版社， 2007年10月 第1版五、實驗項目實驗項目一覽表序號實驗項目名稱實驗類型實驗學時必做/選做實驗一蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應與甲醛滴定法測定氨基氮驗證性3必做實驗二氨基酸的分離鑒定紙層析法驗證性3必做實驗三醋酸纖維薄

3、膜電泳分離血清蛋白驗證性3必做實驗四雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度驗證性3必做實驗五酪蛋白的制備與定量測定綜合性4必做實驗六影響酶促反應的因素驗證性3必做實驗七枯草桿菌蛋白酶活力的測定驗證性3必做實驗八米氏常數(shù)的測定驗證性3選做實驗九維生素C的定量測定驗證性3必做實驗十核黃素的熒光光度定量測定驗證性3必做實驗十一植物組織中蔗糖酶的提取與酶活力測定綜合性5選做實驗十二紫外分光光度法測定核酸含量驗證性3選做實驗十三腺苷三磷酸的測定（電泳法）驗證性3選做實驗十四酵母核糖核酸的提取、鑒定與定量分析綜合性5必做實驗十五糖的旋光性和變旋現(xiàn)象驗證性3必做實驗十六還原糖的測定3，5-二硝基水楊酸法驗證性3必做實驗十七

4、脂肪酸的氧化作用驗證性3必做實驗十八大豆中粗脂肪含量測定和組分分析綜合性5選做實驗十九卵磷脂的提取、鑒定與定量測定綜合性5必做實驗二十陽離子交換樹脂攝取氯化鈉驗證性3必做實驗二十一離子交換柱層析法分離氨基酸綜合性4必做實驗二十二發(fā)酵過程中無機磷的利用綜合性4必做實驗二十三乳酸脫氫酶活力測定綜合性4選做實驗二十四凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)分子量綜合性4選做實驗二十五脂蛋白的分離與鑒定瓊脂糖電泳綜合性4選做合計64實驗類型：演示性、驗證性、綜合性、設計性、其它實驗一 蛋白質(zhì)及氨基酸呈色反應與甲醛滴定法測定氨基氮（3課時）實驗類型：驗證性實驗目的：學習幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)與氨基酸的方法，掌握甲醛滴定法測定

5、氨基酸含量的原理和操作要點。實驗內(nèi)容：1、茚三酮反應：（1）取兩支試管分別加入蛋白質(zhì)和氨基酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混勻，沸水浴加熱1-2min，觀察顏色由粉色變紫紅再變藍。（2）在一小塊濾紙上滴上一滴0.5%Gly溶液，風干后，再在原處滴上一滴0.1%的印三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅斑點的出現(xiàn)。2、黃色反應：向7個試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。管 號1234567材 料（滴）雞蛋清溶液4大豆提取液4指甲少許頭發(fā)少許0.5%苯酚40

6、.3%色氨酸40.3%酪氨酸4濃硝酸（滴）2440404443、甲醛滴定（1）標準Gly溶液的滴定。（2）計算：Gly氨基氮的回收率%=實際測得量加入理論值100%4、未知濃度Gly溶液的滴定氨基氮（mg/ml）=（V未V對）NNaOH14.008實驗要求：要求仔細觀察并記錄實驗現(xiàn)象，如顏色等變化，分析實驗結(jié)果。實驗二 氨基酸的分離鑒定紙層析法（3課時）實驗類型：驗證性實驗目的：學習分配層析的原理；掌握氨基酸紙層析法的操作技術(shù)要點；以及氨基酸的呈色反應原理。實驗內(nèi)容：1、平衡：將展層劑置于層析缸中進行平衡。2、標記：取層析濾紙一張，在紙的一端距邊緣23cm處用鉛筆劃一直線，在此直線上，每隔23

7、cm做一記號（點樣點）。3、點樣：用毛細管將各氨基酸樣品分別點在標記的位置上，干后在原來點樣位置再點一次（可用吹風機吹干，但要控制溫度不能太高）。注意，每點的擴散直徑不能超過3mm。4、展層：用線將濾紙縫成筒狀（用透明膠粘也可以），注意濾紙的兩邊不能接觸?？p好后，將濾紙直立于層析缸中。（點樣端在下，展層劑的液面需低于點樣線）待溶劑上升15cm左右（約40min），取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，吹風機吹干。5、顯色：用噴霧器均勻噴上茚三酮顯色液（要離開濾紙一定距離且要直立噴灑，顯色液在濾紙上不能成柱狀流下）；熱風吹干，可見顯色的各層析斑點。6、計算：計用直尺量出原點到溶劑前沿及各層析點中心的

8、距離，分別計算Rf值；并通過比較單種氨基酸樣品與混合液中氨基酸的Rf值，指出相對應的氨基酸。實驗要求：要求仔細觀察并記錄實驗現(xiàn)象，計算并分析實驗結(jié)果。實驗三 醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白（3課時）實驗類型：驗證性實驗目的：學習醋酸纖維薄膜電泳的操作，掌握電泳技術(shù)的原理。實驗內(nèi)容：1、浸泡：用木筷取醋酸纖維素薄膜，識別光澤面和非光澤面，并做記號，放在緩沖液中浸泡20 min。2、點樣：用木筷取出膜條（不能用手接觸），夾在兩層濾紙之間，輕輕按一下，吸干膜表面水分，膜無光澤面向上平鋪在玻璃板上，點樣器蘸取少許血清在距膜條一端23cm處點樣。3、電泳：將膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上，點樣面朝下，點樣

9、端靠近負極，蓋嚴電泳室，通電，調(diào)節(jié)電壓為160V，電泳25min。4、染色：用木筷取出膜條，浸泡于染色液中約10min。5、漂洗：染色后，在浸泡于漂洗液中，漂洗23次，洗至無蛋白區(qū)底色脫凈為止。實驗要求：要求仔細觀察并記錄實驗現(xiàn)象，計算并分析實驗結(jié)果。實驗四 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度（3課時）實驗類型：驗證性實驗目的：學習并掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的原理與方法及標準曲線的繪制。實驗內(nèi)容：1、繪制標準曲線管號012345標準蛋白液/ml0.20.40.60.81蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）246810蒸餾水/ml10.80.60.40.20雙縮脲試劑/ml444444充分混勻，室溫（20-25）下放

10、置30minA5402、樣品測定管號01樣品液/ml0.5蒸餾水/ml10.5雙縮脲試劑/ml44充分混勻，室溫（20-25）下放置30minA5403、計算樣品中蛋白質(zhì)含量（g/100ml）YN/V 103100Y為從標準曲線上查得的蛋白質(zhì)濃度（mg/ml），N為稀釋倍數(shù)，V為樣品體積（ml）實驗要求：定量實驗要求正確使用移液管準確加量，計算并分析實驗結(jié)果。實驗五 酪蛋白的制備與紫外定量分析（4課時）實驗類型：綜合性實驗目的：1、學習從牛乳中制備酪蛋白的原理和方法； 2、掌握酪蛋白紫外分光光度法定量分析原理與方法實驗內(nèi)容：1、酪蛋白的制備（1）制備酪蛋白粗制品：將一定量牛奶與pH4.7的醋酸

11、緩沖液加熱至40。調(diào)pH至4.7。將上述懸浮液冷卻至室溫。離心15分鐘（3000r/min）。取沉淀，得酪蛋白粗制品。（2）多次水洗沉淀并離心15分鐘（3000r/min），棄上清。（3）有機溶劑洗沉淀：分別用一定量乙醇洗沉淀，布氏漏斗中抽濾。用乙醇重復洗一次后改用乙醚洗沉淀并抽干。風干，可得酪蛋白純品。（4）稱重并計算含量和得率。含量：酪蛋白g/100 ml 牛乳得率：測得含量 /理論含量100%理論含量為3.5 g/100 ml 牛乳2、酪蛋白的定量測定采用紫外分光光度法，波長280nm，讀取吸光度。以標準蛋白濃度為參照。實驗要求：要求掌握提取蛋白質(zhì)的原理和方法；學習紫外分光光度計的基本原

12、理和使用方法，計算并分析實驗結(jié)果。實驗六 影響酶促反應的因素（3課時）實驗類型：驗證性實驗目的：加深對酶的性質(zhì)以及影響酶活因素的認識和理解實驗內(nèi)容：1、溫度對酶活力的影響取三支試管，編號后按下表加入試劑：管 號123淀粉溶液（ml）稀釋唾液（ml）煮沸過的稀釋唾液1.51.51.5111搖勻后，將1，3號兩試管放入37恒溫水浴中，2號試管放入冰水中。10分鐘后取出（將2號管內(nèi)液體分為兩半），用碘化鉀-碘溶液來檢驗1、2、3號管內(nèi)淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。2號管剩下的一半溶液放入37水浴中繼續(xù)保溫10min后，再用碘液實驗2、唾液淀粉酶的活化和抑制管號12340.1%淀粉溶液（ml）1.51.

13、51.51.5稀釋唾液（ml）0.50.50.50.51%硫酸銅溶液（ml）0.51%氯化鈉溶液（ml）0.51%硫酸鈉溶液（ml）0.5蒸餾水（ml）0.537恒溫水浴，保溫10min碘化鉀碘溶液（滴）23232323實驗要求：要求仔細觀察并記錄實驗現(xiàn)象，計算并分析實驗結(jié)果。實驗七 枯草桿菌蛋白酶活力的測定（3課時）實驗類型：驗證性實驗目的：學習測定蛋白酶活力的方法，掌握72型分光光度計的原理和使用方法實驗內(nèi)容：1、繪制標準曲線2、酶活測定Na2CO3溶液酚試劑30放置15minA68011ml5ml1ml21ml5ml1ml31ml5ml1ml3、計算酶活1克枯草桿菌蛋白酶在30，pH7.

14、5的條件下所具有的活力單位為：（A樣-A對).K.V/t.N實驗要求：要求掌握測定蛋白酶活力的原理和方法；準確進行定量實驗，計算并分析實驗結(jié)果。實驗八 米氏常數(shù)的測定（3課時）實驗類型：驗證性實驗目的：了解底物濃度對酶促反應速度的影響，學習測定米氏常數(shù)的原理和方法實驗內(nèi)容：1、向6個小錐形瓶中分別加入5ml甲醛與1滴酚酞并用0.1mol/L 標準氫氧化鈉溶液滴定至微粉紅色2、100ml酪蛋白溶液與胰蛋白溶液分別在37水浴10min，準確稱量10ml酶液加到酪蛋白溶液中（同時計時），混勻后，取出10ml反應液作為零時樣品。向反應液中加入甲醛、酚酞并用氫氧化鈉滴定至終點，記下所用的氫氧化鈉的ml數(shù)

15、。在2、4、6、8min時分別取10ml消化樣品。按上述方法操作，每個樣品滴定終點顏色應一致，用增加的地定都對時間作圖測定初速度。3、配制不同濃度的酪蛋白溶液，測定不同底物濃度時的活力4、用測得的實驗結(jié)果，以1/V對1/S作圖，求出V和Km的數(shù)值實驗要求：要求掌握測定酶Km的原理和方法；畫圖、計算并分析實驗結(jié)果。實驗九 維生素C的定量測定（3課時）實驗類型：驗證性實驗目的：掌握2，6-二氯酚靛酚法測定維生素C的原理和方法實驗內(nèi)容：1、不同樣品用不同方法提取（1）松針：用水將松針洗凈，用濾紙吸去表面水分。稱取1g，放入研缽中，加1%HCl溶液5ml一起研磨。放置片刻，將提取液轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中

16、，如此反復23次。最后用1%HCl溶液稀釋到刻度并混勻，靜置10min，過濾，濾液備用。（2）新鮮蔬菜和水果類：水洗凈，用紗布或吸水紙吸干表面水分。然后稱取20.0g，加2%草酸100 ml置組織攪碎機中打成漿狀。稱取漿狀物5.0g，倒入50ml容量瓶中以2%草酸溶液稀釋至刻度。靜置10min，過濾。濾液備用。2、滴定（1）標準液滴定。準確吸取維生素C溶液1.0ml（含0.1mg維生素C）置100ml錐形瓶中，加9ml1%草酸，用微量滴定管以0.1%2，6-二氯酚靛酚滴定滴定至淡紅色，并保持15秒鐘即為終點。由消耗染料體積計算出1 ml染料相當于多少mg維生素C。（2）樣液滴定。準確吸取濾液兩

17、份，每份10.0ml分別放入兩個100ml錐形瓶中，滴定方法同前。3、計算： mVTm0100實驗要求：要求掌握滴定法測定維生素C的原理和方法；計算并分析實驗結(jié)果。實驗十 核黃素的熒光光度定量測定實驗類型：驗證性實驗目的：1、把握標準曲線法定量分析維生素B2的基本原理。2、了解熒光分光光度計的基本原理、結(jié)構(gòu)及性能，把握其基本操作。實驗內(nèi)容：1、系列標準溶液的制備2、激發(fā)光譜的繪制設置em540nm為發(fā)射波長，在250500nm范圍內(nèi)掃描，記錄熒光發(fā)射強度和激發(fā)波長的關(guān)系曲線，便得到激發(fā)光譜。從激發(fā)光譜圖上可找出其最大激發(fā)波長ex。3、標準溶液及樣品的熒光測定將激發(fā)波長固定在最大激發(fā)波長，熒光發(fā)

18、射波長固定在最大熒光發(fā)射波優(yōu)點。測量上述系列標準維生素B2溶液的熒光發(fā)射強度。數(shù)據(jù)記錄于表2中。以溶液的熒光發(fā)射強度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，制作標準曲線。 在同樣條件下測定未知溶液的熒光強度，并由標準曲線確定未知試樣中維生素B2的濃度，計算待測樣品溶液中的維生素B2的含量。4、數(shù)據(jù)記錄與結(jié)果分析1）激發(fā)光譜繪制過程中實驗數(shù)據(jù)記錄 2）標準溶液及待測溶液的濃度和熒光強度數(shù)據(jù)記錄： 3）系列標準溶液濃度與熒光發(fā)射強度的標準曲線圖： 4）則待測溶液的濃度的測量實驗要求：要求掌握熒光分光光度法測定維生素B2的原理和方法；計算并分析實驗結(jié)果。實驗十一 植物組織中蔗糖酶的活力測定（5課時）實驗類型

19、：綜合性實驗目的：掌握植物組織中蔗糖酶的提取方法，以及蔗糖酶活力測定的原理實驗內(nèi)容：1、繪制標準曲線：取8支具塞試管按下表加入各試劑室溫靜置5min后，向每支試管中加7ml蒸餾水，混勻，在510nm下測光吸收值，以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線管號12345678葡萄糖（ml）（4mmol/L）0.000.020.050.100.150.200.250.30水（ml）1.000.980.950.900.850.800.750.70Nelson試劑（ml）11111111混勻，蓋上塞子，置于沸水浴中水浴20min后冷卻至室溫砷鉬酸試劑（ml）111111112、蔗糖酶的提取與活力

20、測定：（1）提取蔗糖酶：稱取綠豆芽3.672g于研缽中，以1ml/g加入乙酸緩沖液，在冰浴中用研缽研磨成糊狀，以12000r/min離心10min，留取上清夜用于酶活力測定（2）測定吸光值：取兩支具塞試管，按下表加入各試劑室溫靜置5min后，向每管中加7ml蒸餾水，510nm下比色，測定光吸收值管號空白管樣品管1ml/g乙酸緩沖液（ml）0.80.80.5mmol/L蔗糖溶液（ml）0.20.2稀釋5倍綠豆芽酶液（ml）1蒸餾水（ml）1混勻，室溫下放置10minNelson試劑（ml）11混勻，蓋上塞子，置于沸水浴中水浴20min后冷卻至室溫砷鉬酸試劑（ml）113、酶活力計算：室溫，PH4

21、.5條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1umol葡萄糖所需的酶的量定義為酶的一個活力單位酶活力=測得還原糖的含量（mg）nv1000/Wt上式中：n為稀釋倍數(shù) v為酶液總體積 w為樣品重 t為反應時間10min實驗要求：要求掌握提取酶蛋白提取與活力測定的原理和方法；準確進行定量實驗，計算并分析實驗結(jié)果。實驗十二 紫外分光光度法測定核酸的含量（3課時）實驗類型：驗證性實驗目的：1、2、學習用紫外分光光度法測定核酸含量的原理和操作方法實驗內(nèi)容：1、分析天平準確稱取核酸樣品500mg，少量水調(diào)成糊狀，再加水稀釋，氨水調(diào)節(jié)到pH7，定容到50ml2、紫外光吸收值的測定管號樣品管對照管核酸樣品溶液（ml）22蒸餾水

22、（ml）2沉淀劑溶液（ml）2混勻，在冰浴中放置30min后離心（3000r/min,10min)分別取兩管中的上清液0.5ml，蒸餾水定容至50ml，260nm處測定其光吸收值3、計算實驗要求：要求掌握紫外分光光度法測定核酸含量的原理和操作方法；計算并分析實驗結(jié)果。實驗十三 腺苷三磷酸的測定（電泳法）實驗類型：驗證性實驗目的： 掌握紙電泳法分析腺苷三磷酸的原理和方法。 實驗內(nèi)容： 1樣液的制備 用稱量瓶稱取樣品(可用腺苷三磷酸粗品或藥用結(jié)晶品)100Omg，用34ml蒸餾水溶解，仔細傾入10ml容量瓶中，再加12ml蒸餾水洗稱量瓶2次，一并倒入容量瓶，最后用蒸餾水稀釋至刻度，混勻。此溶液每毫

23、升含樣品10mg。 2點樣 取3era30era濾紙3條，距濾紙一端約7cm處，用鉛筆輕輕劃一基線(圖24)。用點樣管吸取樣液10tAj)t，將樣液輕輕點在濾紙基線上，用冷風吹干(三條濾紙作三個重復測定)。于另一同樣大小的濾紙條上，按同樣方法點標準腺苷三磷酸溶液，作標準試驗。 3電泳 電泳槽兩端貯液槽內(nèi)都注以pH48檸檬酸緩沖液。將上述濾紙條的兩端用檸檬酸緩沖液浸濕后(注意：點樣處勿浸入緩沖液中!)，將濾紙放在電泳槽中點樣端置負極，另一端在正極。蓋好電泳槽蓋子，等濾紙條完全被緩沖液滲濕后，接通電源，調(diào)節(jié)電壓至400V，30min后切斷電源，取出濾紙條，掛在架上，置50烘箱烘干，或用電吹風吹干。

24、將烘干的濾紙條置紫外燈上觀察，并用鉛筆將斑點劃出。根據(jù)標準試驗腺苷三磷酸斑點的位置，決定另三條濾紙上哪一個斑點是腺苷三磷酸。 4洗脫取4支清潔干燥的小試管，標以O、1、2、3號碼。將三條濾紙上的腺苷三磷酸斑點剪下，再剪成寬約1mm的細條，分別放在1、2、3號試管內(nèi)。另在無斑點處剪一和腺苷三磷酸斑點大小相仿的濾紙，亦剪成細條，放在0號管內(nèi)，作空白試驗。向上述4支試管內(nèi)各加50ml 001m01L HCl溶液浸提濾紙條，將腺苷三磷酸洗脫浸提2h，浸提期間經(jīng)常搖動試管。 5測定 將試管內(nèi)浸提液分別倒入4只石英比色杯，以0號管的浸提液調(diào)零（A=0） 測定1、2、3管浸提液A260im，計算樣品中腺苷三

25、磷酸的質(zhì)量分數(shù)。實驗要求：掌握紙電泳法分析腺苷三磷酸的原理及計算樣品中腺苷三磷酸質(zhì)量分數(shù)的方法。實驗十四 酵母核糖核酸的提取、鑒定與定量分析（5課時）實驗類型：綜合性實驗目的：了解核酸的組分，學習并掌握提取、鑒定與定量測定核糖核酸的方法實驗內(nèi)容：1、酵母核糖核酸的提?。?5g酵母懸浮于90ml 0.04mol/L氫氧化鈉溶液中并研磨均勻，懸浮液移至錐形瓶沸水浴加熱30min，冷卻。懸浮液中緩慢加入30ml酸性乙醇溶液并攪拌。待核酸核糖完全沉淀，3000r/min離心3min。棄上清，沉淀用95%乙醇洗滌沉淀兩次，乙醚洗滌沉淀一次后抽濾，空氣中干燥沉淀。2、 核糖核酸組分的鑒定：（1）水解液的制

26、作：200g提取的核酸加入1.5mol/L硫酸溶液10ml，沸水浴中加熱10min制成水解液進行組分鑒定（2）嘌呤堿的鑒定：干凈試管中加入水解液1ml，過量氨水及1ml 0.1mol/L硝酸銀溶液，觀察有無嘌呤堿的銀化合物沉淀（3）核糖的鑒定：干凈試管中加入水解液1ml，三氯化鐵濃鹽酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液0.2ml，沸水浴10min，觀察溶液是否變?yōu)榫G色（4）磷酸的鑒定：干凈試管中加入水解液1ml及定磷試劑1ml，水浴加熱，觀察溶液是否變成藍色3酵母核糖核酸的組分定量測定（1）RNA標準曲線的繪制（2）樣品液中RNA含量的測定：取2支試管，一支加入樣品液（實驗十四中提取的沉淀用水溶解即得

27、）2ml和苔黑酚試劑2ml，另一支試管加入蒸餾水2ml和苔黑酚試劑2ml（為對照管），混勻后，置沸水浴中顯色15min，用分光光度計在波長640nm處測光吸收值，查標準曲線，計算RNA含量 實驗要求：要求掌握核酸提取鑒定以及分光光度法測定核酸含量的原理和操作方法；計算并分析實驗結(jié)果。實驗十五 糖的旋光性和變旋現(xiàn)象（3課時）實驗類型：驗證性實驗目的：1、了解糖的變旋現(xiàn)象，掌握利用糖的旋光性測定糖濃度的方法2、學會使用旋光儀實驗內(nèi)容：1、標準曲線的繪制2、樣品液的測定實驗要求：要求掌握糖的旋光鑒定以及測定糖濃度的原理和操作方法；計算并分析實驗結(jié)果。實驗十六 還原糖的測定3，5-二硝基水楊酸法（3課

28、時）實驗類型：驗證性實驗目的：掌握3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖的基本原理，進一步學習比色法測定還原糖的操作方法和分光光度計的使用實驗內(nèi)容：1、繪制標準曲線：配制不同濃度葡萄糖標準液2、還原糖的提??；3g食用面粉于50ml蒸餾水中攪勻，50恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出。浸出液于4000r/min離心5min，沉淀用20ml蒸餾水洗一次，再離心。兩次離心的上清液收集在100ml容量瓶中，定容至刻度，混勻，作為還原糖待測液3、 顯色：干凈試管中加入樣品液0.4ml，蒸餾水0.6ml，DNS0.8ml進行顯色反應4、比色：波長540nm5. 定量：查標準曲線實驗要求：要求掌握定量測定糖濃

29、度的原理和操作方法；計算并分析實驗結(jié)果。實驗十七 脂肪酸的氧化（3課時）實驗類型：驗證性實驗目的：了解脂肪酸的氧化作用，掌握從肝組織中測定丙酮的含量的滴定法。實驗內(nèi)容：1、肝糜制備：取5g豬肝研磨加0.9%NaCl配制10ml漿液 2、氧化和酮體生成反應磷酸緩沖液正丁酸肝糜43保溫1.5h13ml2ml2ml23ml2ml3、沉淀蛋白質(zhì)43保溫1.5h15%三氯乙酸正丁酸靜止15min過濾13ml23ml2ml4、酮體測定：記錄滴定樣品與滴定對照所用的硫代硫酸鈉溶液的ml數(shù)。5、計算樣品中丙酮的含量：實驗要求：要求掌握測定丙酮的含量的滴定法，計算并分析實驗結(jié)果。實驗十八 卵磷脂的提取、鑒定與定

30、量測定實驗類型：綜合性實驗目的： 學習掌握以乙醚作為溶劑提取生蛋黃中的卵磷脂的原理與方法。實驗內(nèi)容：卵磷脂是甘油磷脂的一種，由磷酸、脂肪酸、甘油和膽堿組成。卵磷脂可溶于乙醚、乙醇等溶劑，因而可以利用這些溶劑進行提取。卵磷脂的膽堿基在堿性條件下可以分解為三甲胺，三甲胺有特殊的魚腥味，可以此鑒別。1、卵磷脂的提?。喝?5g生雞蛋黃于150mL三角錐瓶中，加入40mL乙醚，放入磁攪拌器，室溫下攪拌提取15min。然后靜置30min，上層液用帶棉花塞的漏斗過濾，往殘渣中再加入15mL乙醚，攪拌提取min。第二次提取液通過過濾后，與第一次提取液合并，于60熱水浴中蒸去乙醚，將殘留物質(zhì)倒入燒杯中，再于真空

31、干燥器中進行減壓干燥30min，以除盡乙醚，約可得5g粗提取物。粗提取物進行離心10min后，下層為卵磷脂，約得2.5-2.8g。卵磷脂可以通過冷凍干燥得到無水的產(chǎn)物。2、卵磷脂的鑒定：取以上提取物約0.1g，于試管內(nèi)加入10%NaOH溶液2mL，水浴加熱數(shù)分鐘，嗅之是否有魚醒味，以確定是否卵磷脂。3.乳化作用：兩支試管中各加入35mL水，一只加卵磷脂少許，溶解后滴加5滴花生油。另一只也滴入5滴花生油，加塞極力振蕩試管，使花生油分散。觀察比較兩只試管內(nèi)的乳化狀態(tài)。4、定量測定：將干凈的離心試管和玻棒置于100mL燒杯中，烘干、冷卻后稱量。5、稱取在6570時過濾的油樣10g 左右，注入離心管，

32、放入烘箱中加熱至40取出。6、用移液管向離心管中加水0.5mL，用玻棒猛烈攪拌1min。然后取出玻棒，在離心管邊上刮凈玻棒上的油，將離心管放入離心機中進行分離，直至吸水膨脹后析出的磷脂沉于離心管的底部。7、先傾出上層清油，再將磷脂離心分離，再傾出上層清油。離心管中沉淀物用丙酮進行洗滌，離心分離，傾出丙酮液。如此用丙酮反復洗滌分離34次，直到所得丙酮無油跡為止。8、把盛有沉淀物的離心管和玻棒放入盛有離心管的燒杯中，置105烘箱內(nèi)烘至恒重。油脂的磷脂含量按下式計算： 式中 ： W1 一 沉淀物重（g ） W2一 油樣重（g）實驗要求：要求在卵磷脂的提取與鑒定中仔細觀察并記錄實驗現(xiàn)象，定量計算并分析

33、實驗結(jié)果。實驗十九 大豆中粗脂肪含量測定和組分分析（5課時）實驗類型：綜合性實驗目的：1. 掌握索氏抽提法測定粗脂肪含量的原理和操作方法2. 了解測定過程中誤差的來源及修正方法實驗內(nèi)容：1、濾紙包樣：將濾紙切成8cm8cm，疊成一邊不封口的紙包，用硬鉛筆編寫順序號，按順序排列在培養(yǎng)皿中。將盛有濾紙包的培養(yǎng)皿移入105烘箱中干燥2h，取出放入干燥器中，冷卻至室溫。按順序?qū)⒏鳛V紙包放入同一稱量瓶中稱重（記作a），稱量時室內(nèi)相對濕度必須低于70%2、包裝和干燥：在上述已稱重的濾紙包中裝入3g左右研細的大豆粉，封好包口，放入105的烘箱中干燥3h，移至干燥器中冷卻至室溫。按順序號依次放入稱量瓶中稱重3

34、、抽提：將裝有大豆粉的濾紙包用長鑷子放入抽提筒中，注入一次虹吸量的1.67倍的無水乙醚，試樣品包完全浸沒在乙醚中。連接好抽提器各部分，接通冷凝水水流，在恒溫水浴中進行抽提，調(diào)節(jié)水溫在7080之間，使冷凝而下滴的乙醚成連珠狀（120150滴/min或回流7次/h以上），抽提至抽取筒內(nèi)的乙醚用濾紙點滴檢查無油跡為止（約需612h）。抽提完畢后，用長鑷子取出濾紙包，在通風處使乙醚揮發(fā)（抽提室溫以1225為宜）。提取瓶中的乙醚另行回收4、稱重：待乙醚揮發(fā)后，將濾紙包置于105烘箱中干燥2h，放入干燥器冷卻至恒重為止（記作c）5、計算：粗脂肪含量（%）=100上式中：a是稱量瓶加濾紙包重（g） b是稱量

35、瓶加濾紙包和烘干樣重（g） c是稱量瓶加濾紙包和抽提后烘干殘渣重（g）實驗要求：要求掌握索氏抽提法測定粗脂肪含量的原理和操作方法，計算并分析實驗結(jié)果。實驗二十 陽離子交換樹脂攝取氯化鈉（3課時）實驗類型：驗證性實驗目的：學習并掌握離子交換層析法的原理和基本操作技術(shù)實驗內(nèi)容：1、樹脂處理、轉(zhuǎn)型：水浸過夜鹽酸浸泡氫氧化鈉溶液浸泡鹽酸轉(zhuǎn)型水洗至中性待用2、裝柱：采用重力沉降法3、加樣：加入6ml 10g/L的氯化鈉溶液4、洗脫：收集40ml洗脫液5、滴定：用0.1mol/L的標準氫氧化鈉溶液滴定洗脫液6、計算實驗要求：學習并掌握離子交換層析法的原理和裝柱、洗脫及滴定等基本操作技術(shù)。實驗二十一 離子交

36、換柱層析法分離氨基酸（4課時）實驗類型：綜合性實驗目的：1. 學習掌握利用陽離子交換樹脂柱層析法分離氨基酸的原理和操作方法2. 掌握分光光度法測定氨基酸的原理與方法，以及洗脫曲線的繪制實驗內(nèi)容：1、層析柱的準備：將強酸型陽離子交換樹脂用氫氧化鈉處理成鈉型后洗至中性裝柱2、平衡：用pH5.8的檸檬酸緩沖液平衡交換柱3、加樣：由柱上端加入0.5ml氨基酸混合液4、洗脫：用檸檬酸緩沖液洗脫，共收集80ml左右的洗脫液 5、顯色及測定：各管洗脫液中加入1ml茚三酮，沸水浴15min，冷卻后加入1.5ml 50%乙醇溶液，放置10min后，以第二管為空白，測定A570，以光吸收值為縱坐標，洗脫體積為橫坐

37、標繪制洗脫曲線。實驗要求：要求掌握利用陽離子交換樹脂柱層析法分離氨基酸的原理和操作方法，以及洗脫曲線的繪制。實驗二十二 發(fā)酵過程中無機磷的利用與ATP的生成（4課時）實驗類型：綜合性實驗目的：1、掌握定磷法測定無機磷的原理和操作技術(shù) 2、了解發(fā)酵過程中無機磷的利用與ATP生成情況實驗內(nèi)容：1、標準曲線制定2、酵母發(fā)酵：取酵母適量稀釋后于37發(fā)酵，每隔15min取出0.5ml懸浮液，立即加入三氯乙酸混勻，得無蛋白濾液，分別得到3份濾液。3、無機磷的測定管號發(fā)酵時間（min）無蛋白濾液 （ml）蒸餾水（ml）鉬酸銨-硫酸溶液（ml）-1，2，4-氨基萘酚磺酸溶液（ml）37保溫10min再冷卻至室

38、溫10.12.92.50.52150.12.92.50.53300.12.92.50.543.02.50.5 4. ATP生成鑒定：參考實驗十二 腺苷三磷酸的測定（電泳法）實驗要求：要求掌握定量測定無機磷濃度的原理和操作方法；計算并分析實驗結(jié)果。實驗二十三 乳酸脫氫酶活力測定（4課時）實驗類型：綜合性實驗目的：1. 學習從豬肉中制備肌肉勻漿的操作方法，2. 掌握測定豬肉提取液中LDH活力及比活力的方法及原理實驗內(nèi)容：1、制備肌肉勻漿：取瘦豬肉20g，按w/v=1/4加入40預冷的10mol/L pH 6.5磷酸鉀鹽緩沖液，用組織搗碎機搗碎，取勻漿液4冰箱過夜，過濾后的紅色液體為組織提取液。2、LDH活力測定：預先將丙酮酸溶液及氫氧化鈉溶液放在25水浴中預熱。取2支光徑為1cm的石英比色杯，在1支比色杯中加入0.1mol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液3ml，放在紫外分光光度計中，在340nm處經(jīng)光吸收調(diào)至零；另一支比色杯用于測定LDH活力，依次加入丙酮酸鈉溶液2.9ml，氫氧化鈉