毒理學(xué)新技術(shù)課件

1、毒理學(xué)新技術(shù)課件,1,體外試驗與生物新技術(shù)在毒理學(xué)中的應(yīng)用,毒理學(xué)新技術(shù)課件,2,分類,依據(jù)體外試驗在決策過程中所起的作用 篩選試驗。它僅提供決策過程的最初的資料，還需要進(jìn)行更權(quán)威的試驗，無論是整體還是體外試驗。 附加試驗。它可為協(xié)作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料，如機理的研究，但僅有它是不夠充分的。 替代試驗。它是在大量實驗的基礎(chǔ)上，使體外毒性試驗?zāi)芴娲w動物試驗，以提供更多的信息。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,3,基本原理,體外試驗的基本原理是所觀察到的毒理學(xué)效應(yīng)均是毒物和或反應(yīng)活性代謝產(chǎn)物在敏感性細(xì)胞上或敏感細(xì)胞內(nèi)某一分子靶部位作用的結(jié)果。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,4,體外毒性試驗系統(tǒng)的優(yōu)

2、點,能控制環(huán)境因素 可排除相互作用的系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響 每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細(xì)胞，細(xì)胞器等 試驗間的誤差較少 可同時和或反復(fù)多次取樣 可做成復(fù)雜的互相作用的試驗系統(tǒng)，如復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)等 較為快速和經(jīng)濟 需要較小量的受試化合物 產(chǎn)生較小量的有毒廢物 可以利用人體細(xì)胞 減少整體動物的使用,毒理學(xué)新技術(shù)課件,5,體外試驗系統(tǒng),臟器灌流 肝臟灌流 腸灌流 膈肌-膈神經(jīng)標(biāo)本 臟器切片 原代細(xì)胞培養(yǎng) 肝細(xì)胞原代培養(yǎng) 巨噬細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 腦細(xì)胞 心肌細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 組織勻漿,亞細(xì)胞組分 細(xì)胞膜 微粒體 線粒體 酶,毒理學(xué)新技術(shù)課件,6,哺乳動物細(xì)胞制備和培養(yǎng),體外系統(tǒng)分離的細(xì)

3、胞包括懸浮液中的新鮮游離細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞株、細(xì)胞系及復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞 在毒理學(xué)中以哺乳動物細(xì)胞作為實驗動物的替代系統(tǒng)的原因 來自公眾要求減少實驗中使用動物數(shù)量的壓力 整體動物實驗可顯著地減少常規(guī)整體動物實驗所需的高額費用 人們越來越不滿意實驗動物與人體結(jié)果之間相關(guān)性的缺乏。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,7,體外系統(tǒng)細(xì)胞在毒理學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)、缺點,優(yōu)點 改善效率，減少費用 使用實驗動物較少 僅需少量的受試物 較大程度控制細(xì)胞族的性狀 直接控制胞外基質(zhì)、化學(xué)物濃度及接觸時間 排除可能的混淆因素如激素；神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的影響 可從同一實驗體系重復(fù)取樣 缺點 缺少整個器官的形態(tài)學(xué)觀察 選擇性喪失整體器官特

4、異性功能，如毒性代謝酶的喪失 缺乏可能的調(diào)節(jié)影響因素如激素，神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)， 一般為靜態(tài)系統(tǒng)，將導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少和代謝終產(chǎn)物的逐漸累積。 多為短期試驗，對亞慢性或慢性毒性的評估價值不大,毒理學(xué)新技術(shù)課件,8,毒理學(xué)研究中常用細(xì)胞,各種物種的成纖維細(xì)胞 淋巴母細(xì)胞 腹水瘤細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 角質(zhì)細(xì)胞 肝 細(xì) 胞 肝癌細(xì)胞 腎臟髓質(zhì)和皮質(zhì)細(xì)胞,肺的各種類型細(xì)胞 培養(yǎng)的背根膠質(zhì)細(xì)胞 培養(yǎng)的睪丸細(xì)胞 膀胱細(xì)胞 心臟細(xì)胞 脊髓微血管細(xì)胞 脂肪細(xì)胞,毒理學(xué)新技術(shù)課件,9,細(xì)胞實驗方法,建立正在迅速生長的細(xì)胞株，用以觀察受試物對整體細(xì)胞的一般毒作用和正在分裂組織的毒作用 利用已高度分化的細(xì)胞，無論是原

5、代培養(yǎng)或是特定的細(xì)胞株，研究受試物對已分化成熟的細(xì)胞或其功能的特殊毒作用；,毒理學(xué)新技術(shù)課件,10,細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件,無菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器， 潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外 燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素 細(xì)胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶， CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清 細(xì)胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀 ，微孔板震蕩器，高 速離心機，移液器 細(xì)胞保存條件：液氮罐 實驗室安全：生物實驗室安全，P1,P2,P3實驗室安全,毒理學(xué)新技術(shù)課件,11,毒理學(xué)新技術(shù)課件,12,風(fēng)淋室:風(fēng)淋室是生物潔凈室的理想配套設(shè)備，它不僅可以清除人體和物品

6、表面附著的塵埃，減少帶入潔凈室的灰塵量，而且兼有氣閘室的功能，可防止非潔凈空氣的侵入。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,13,傳遞窗: 該裝置是一種潔凈室的輔助設(shè)備，主要用于潔凈區(qū)與潔凈區(qū)，潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開門次數(shù)，把對潔凈區(qū)的污染降低到最低程度。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,14,超凈工作臺,超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣，通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,15,培 養(yǎng) 板,毒理學(xué)新技術(shù)課件,16,培養(yǎng)瓶,毒理學(xué)新技術(shù)課件,17,毒理學(xué)新技術(shù)課件,18,酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器,毒理學(xué)新技術(shù)

7、課件,19,培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件,1 細(xì)胞的營養(yǎng)需要 2 細(xì)胞的生存環(huán)境 溫度: 37 ，O2 CO2: 5%，CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓 3 無污染 4 無毒,毒理學(xué)新技術(shù)課件,20,細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制 水：新鮮配置的三蒸水或去離子水 平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml,毒理學(xué)新技術(shù)課件,21,胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶

8、液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細(xì)胞。 胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過濾除菌。 胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用,消化液：,毒理學(xué)新技術(shù)課件,22,培養(yǎng)基：,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。 天然培養(yǎng)基： 天然培養(yǎng)基有血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。 優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好 缺點：來源受限。 成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染,毒理學(xué)新技術(shù)課件,23,合成培養(yǎng)基,主要成分是

9、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低 。 缺點： 缺少某些成分不能完全滿足細(xì)胞生長需要。 如 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,24,無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段，難以推廣。目前，絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加血清。 一般說來，含5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長一般需加 10血清,毒理學(xué)新技術(shù)課件,25,血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。 常用血清有胎牛血潔、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支

10、原體、病毒污染。 血清的滅活（消除補體活性）：56 ，30 分鐘 血清的消毒：過濾除菌,毒理學(xué)新技術(shù)課件,26,抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,27,基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95 血清 5一20 碳酸氫鈉 2.0 g/L 青、鏈霉素 各100單位毫升,完全培養(yǎng)基的組成,毒理學(xué)新技術(shù)課件,28,RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至 1000m

11、l, 過濾除菌； 調(diào)節(jié)pH值至7.2； 加血清（終濃度 10）。,培養(yǎng)基的配制,毒理學(xué)新技術(shù)課件,29,主要培養(yǎng)基,MEM：低限量Eagle培養(yǎng)基 DMEM：貼壁細(xì)胞 IMDM：密度低、生長困難細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞 RPMI1640：懸浮、腫瘤、原代、傳代等細(xì)胞 199、109培養(yǎng)基：原代培養(yǎng)、難以培養(yǎng)的細(xì)胞,毒理學(xué)新技術(shù)課件,30,細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù),毒理學(xué)新技術(shù)課件,31,無菌操作技術(shù),體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,32,【培養(yǎng)前準(zhǔn)備】 在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操

12、作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,33,【操作與消毒】 無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面次(專用拖布)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線，物品不要重疊放置。移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,34,【火焰消毒】 首先要點燃酒精燈。按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,35,【操作】 進(jìn)

13、行培養(yǎng)時，動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,36,培養(yǎng)細(xì)胞的觀察,肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài),毒理學(xué)新技術(shù)課件,37,毒理學(xué)新技術(shù)課件,38,細(xì)胞計數(shù),培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計數(shù)相同。 血細(xì)胞計數(shù)器：手工計數(shù)細(xì)胞,毒理學(xué)新技術(shù)課件,39,細(xì)胞計數(shù)： 1、將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，將蓋片蓋在計數(shù)板上。 2、吸少許細(xì)胞懸液，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。 3、靜置3分鐘。 4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計

14、左側(cè)和上方的。然后按下式計算：細(xì)胞數(shù)/ml4大格細(xì)胞總數(shù)/ 410000注意：若兩個以上的細(xì)胞團(tuán)，按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，需重新制備細(xì)胞懸液。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,40,毒理學(xué)新技術(shù)課件,41,根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種： 1懸浮生長細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。,細(xì)胞傳代方法,毒理學(xué)新技術(shù)課件,42,2半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳

15、代。 3貼壁生長細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,43,總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力 檢測的細(xì)胞： 組織分離的細(xì)胞 復(fù)蘇后的細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞活力測定,毒理學(xué)新技術(shù)課件,44,1臺盼藍(lán)法 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色； 方法： 1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中； 2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘； 3、鏡檢計細(xì)胞活力。 死細(xì)胞深蘭色，活細(xì)胞呈無色透明狀。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,45,2四唑鹽（MTT）比色法 四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)； 原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物，而死細(xì)胞沒有這種

16、功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解藍(lán)紫色，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。酶標(biāo)儀測定OD值。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,46,毒理學(xué)新技術(shù)課件,47,細(xì)胞凍存和復(fù)蘇,細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。 凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融慢凍程序： 將冷凍管放入紗布袋內(nèi)，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投入液氮中。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO,毒理學(xué)新技術(shù)課件,48,細(xì)胞復(fù)蘇方法,（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分鐘左右）； （2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上； （3）低速離心10分

17、鐘； （4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,49,培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征,植物輸導(dǎo)水分的細(xì)胞,哺乳類的肌肉細(xì)胞,人類脊髓神經(jīng)細(xì)胞,毒理學(xué)新技術(shù)課件,50,體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型,（一）貼附型： 大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：,毒理學(xué)新技術(shù)課件,51,培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程,毒理學(xué)新技術(shù)課件,52,（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期（Life Span of Culture Cells） 所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,53,1原代培養(yǎng)期即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。與體內(nèi)原組織在

18、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，依存性強，獨立生存性差。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,54,2傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代1050次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,55,3衰退期：生存，但增殖慢或不增殖；最后衰退凋亡。 由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系，主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體

19、。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,56,（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期,所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增36次。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段：,毒理學(xué)新技術(shù)課件,57,2指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)表示

20、，即細(xì)胞群中每1000個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%5%。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,58,在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)35天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。 細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝

21、物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,59,特點： 是細(xì)胞增生最活躍、活力最旺盛的階段 培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長,細(xì)胞群體均一 是理想的實驗用細(xì)胞。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,60,判斷細(xì)胞生長的指標(biāo)： 指數(shù)生長期內(nèi)細(xì)胞分裂活動的程度(增殖活性)可作為判斷細(xì)胞生長是否旺盛的重要指標(biāo) 1.有絲分裂指數(shù)(MI): 指培養(yǎng)物中分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比，統(tǒng)計時，每瓶至少需計數(shù)1000個細(xì)胞。一般細(xì)胞的MI約為0.10.5%；原代培養(yǎng)物的MI比繼代培養(yǎng)物低。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞高，可達(dá)3%5%。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,61,判斷細(xì)胞生長的指

22、標(biāo)： 2.細(xì)胞群體倍增時間:培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量翻倍的平均時間 3.MTT法：反映細(xì)胞內(nèi)一種酶活性程度 4.標(biāo)記核苷酸(3H-TdR)摻入量：反映DNA,毒理學(xué)新技術(shù)課件,62,細(xì)胞生長一定階段(指數(shù)生長期一般持續(xù)35 d）,即可長滿培養(yǎng)器皿，相互匯合成片(鋪滿 confluence) 當(dāng)細(xì)胞相互接觸連接成片，出現(xiàn)接觸抑制，接觸抑制以后，雖然運動受抑制，但只要營養(yǎng)成分充足，仍可短期的分裂增殖，只有當(dāng)細(xì)胞密度增大到一定程度，細(xì)胞便不再分裂增殖。為密度依賴性細(xì)胞生長抑制 當(dāng)細(xì)胞分裂停止后，細(xì)胞數(shù)量即不再增加進(jìn)入平臺期,毒理學(xué)新技術(shù)課件,63,3停滯期（Stagnate Phase）：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度

23、后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺期（Plateau）。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳12兩代，通過換液淘汰死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,64,概述 細(xì)胞鋪滿后再1-2倍增, 進(jìn)入細(xì)胞達(dá)飽和密度, 可存活仍有代謝活動，但基本不分裂， 細(xì)胞數(shù)量維持在某一水平上，生長活動停滯,毒理學(xué)新技術(shù)課件,65,特點 (1)細(xì)胞數(shù)量： 細(xì)胞達(dá)飽和密度，出現(xiàn)密度抑制。 停

24、止生長原因: 細(xì)胞數(shù)量多、生長地區(qū)占滿、營養(yǎng)消耗、培養(yǎng)液中代謝廢物積聚漸多，細(xì)胞停止生長。即使經(jīng)常更換培養(yǎng)液，細(xì)胞也會變性,從生長基質(zhì)表面脫落、死亡唯有進(jìn)行傳代方可緩解。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,66,(2)細(xì)胞活動小, 細(xì)胞膜的活動小 (3)生長組分下降: 010% (4)及時傳代：細(xì)胞已中毒，即使傳代，也會影響下一代細(xì)胞的功能狀況,?,毒理學(xué)新技術(shù)課件,67,體內(nèi)細(xì)胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subcultur

25、e）。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,68,體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類,毒理學(xué)新技術(shù)課件,69,（一）初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細(xì)胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,70,（二）細(xì)胞系 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱之為有限細(xì)胞系（Finite Cell Line）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系（Infinite Cell Line）。無限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此

26、本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。無限細(xì)胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說明已惡性化。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,71,（三）細(xì)胞株 從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株（Substrain）,毒理學(xué)新技術(shù)課件,72,（四）二倍體細(xì)胞 細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細(xì)胞占75或80以上）的細(xì)胞群，稱二倍體細(xì)胞培養(yǎng)。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。二倍

27、體細(xì)胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細(xì)胞系。但隨供體年齡和組織細(xì)胞的不同，二倍體細(xì)胞的壽命長短各異。人胚肺成纖維細(xì)胞可傳50代土10代，人胚腎只有810代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞1530代。由不同年齡供體取材建立的二倍體細(xì)胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細(xì)胞能長期被利用，一般在初代或25代即大量凍存作為原種（Stook Cells），用時再進(jìn)行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長期使用或延緩細(xì)胞的衰老。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,73,（五）遺傳缺陷細(xì)胞 從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細(xì)胞）培養(yǎng)的細(xì)胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞，都屬遺傳缺欠細(xì)胞。這類細(xì)胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。,毒理學(xué)新技術(shù)

28、課件,74,（六）腫瘤細(xì)胞系或株 這是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類，我國已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,75,細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名,HeLa：為供體患者的姓名（來源于宮頸癌）CHO：中國地鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary） 宮-743：宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立；每3天傳代，每次接種3105細(xì)胞毫升。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,76,基本技術(shù),儀器與設(shè)備 1. 培養(yǎng)箱 2.

29、冰箱和冷柜 冰箱(4) ，冷柜(20) 3. 顯微鏡 ，相差顯微鏡或熒光顯微鏡，并附有照相裝置或攝影裝置。 4. 超凈工作臺 5.電熱干燥箱消毒 器皿的清洗可用超聲波洗滌器。 6. 培養(yǎng)器皿 ；多孔培養(yǎng)板，其規(guī)格有4孔、6孔、24孔及96孔，它體積小，適于少量細(xì)胞或單個細(xì)胞克隆的生長；培養(yǎng)皿，培養(yǎng)瓶，；其它：凍存細(xì)胞的塑料安瓿及微量加樣器頭，。 吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規(guī)格有l(wèi)0ml，5ml和lml；玻璃瓶， 離心管， 7. 液氮貯存器 8. 水純化裝置 但是，在細(xì)胞培養(yǎng)中，不宜使用去離子純水，因其不能有效地去除有機物。 9. 濾過消毒裝置,毒理學(xué)新技術(shù)課件,77,三、培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定

30、,目的： 觀察培養(yǎng)有無變化，以決定是否終止培養(yǎng)，并從冷凍貯存的樣品重新建立新的培養(yǎng)細(xì)胞； 培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)液)變化，對培養(yǎng)細(xì)胞的影響。 鑒定 污染鑒定 生存指標(biāo) 細(xì)胞性質(zhì)(如細(xì)胞形態(tài)、生長特性、染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)等)。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,78,污染鑒定,細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染有真菌、細(xì)菌和支原體等，此外有化學(xué)物和非同一種細(xì)胞的污染。 污染表現(xiàn)： 細(xì)胞培養(yǎng)可明顯地改變生長特性， 引起pH變化和生長遲緩 培養(yǎng)液表面起泡或起膜， 培養(yǎng)液中的絮狀物及細(xì)胞生長表面的斑點，搖動培養(yǎng)器皿可消失。,肉眼見不到的污染可影響細(xì)胞的代謝。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,79,細(xì)胞特性鑒定,1. 形態(tài)學(xué)檢查：評價細(xì)胞正常與否的最簡單

31、方法是形態(tài)學(xué)檢查 。 “成纖維樣” “上皮樣 2.生長特性的檢查 主要通過測定更換培養(yǎng)液的時間和傳代的時間來完成 接種效率= 小于30表示生長不正常 3.其它檢查 除上述指標(biāo)外，在細(xì)胞培養(yǎng)時，可進(jìn)行染色體分析，包括染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量測定，來判斷培養(yǎng)細(xì)胞的特性。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,80,細(xì)胞培養(yǎng)在食品毒理學(xué)中應(yīng)用,一般毒性：主要為急性細(xì)胞毒性 器官特異性毒性：利用有代表性細(xì)胞類型如肝細(xì)胞、腎近曲小管細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及心肌細(xì)胞等： 毒作用機理 生物轉(zhuǎn)化、毒性代謝產(chǎn)物的形成 遺傳毒性，如程序外DNA合成測定 繁殖毒性 聯(lián)合毒性 不同物種間的比較毒性 光敏毒性,毒理學(xué)新技

32、術(shù)課件,81,毒性指標(biāo)的選擇,依據(jù)不同的試驗?zāi)康暮驮囼灄l件，可選擇不同的觀察指標(biāo)。下列指標(biāo)在毒理學(xué)中經(jīng)常采用： (1) IC50：即經(jīng)3天培養(yǎng)后，引起生長速率減至對照組一半時所需受試物的濃度生長速率可用蛋白總濃度來表示，可用于細(xì)胞毒性的常規(guī)篩檢。此外，前述評價細(xì)胞特性的指標(biāo)，如形態(tài)學(xué)和接種效率等，均可采用。 (2) 細(xì)胞膜損傷：可選擇臺盼藍(lán)攝取、胞漿酶漏出、Ca2+的釋放以及鈣泵的變化等指標(biāo)來評價細(xì)胞膜的損傷。 (3) 大分子物質(zhì)合成與降解的改變：可選用14C亮氨酸蛋白試驗和3H尿嘧啶參入RNA試驗等指標(biāo)，以判斷受試物對培養(yǎng)細(xì)胞的大分子合成與降解的有無作用。 (4) 代謝能力：除可選擇ATP濃

33、度、NADPNADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指標(biāo)外，還有毒物代謝酶的活性、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用及14C-葡萄糖氧化代謝成14CO2的速率，均可反映出細(xì)胞的代謝能力。 (5) 形態(tài)學(xué)觀察：通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，可了解受試物對培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)改變情況。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,82,毒理學(xué)中應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)時應(yīng)注意的幾個問題,1. 細(xì)胞類型的選擇 細(xì)胞類型的選擇取決于實驗的目的。 一般性篩選系列化合物的一般毒性時，應(yīng)選擇生長迅速且易于處理的細(xì)胞系。 機理研究多不用細(xì)胞系，因為培養(yǎng)的細(xì)胞會逐漸喪失許多功能，如細(xì)胞色素P-450的活性。 細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點之一是可選擇來源于人體的組織細(xì)胞，可減少試

34、驗結(jié)果的物種差異。成纖維樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞均可選用。 常用的細(xì)胞系有CHO、V79、Hela、BHR及L929等。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,83,2. 代謝活化,細(xì)胞經(jīng)8-24h培養(yǎng)后，細(xì)胞色素P-450活性將迅速下降。 而在CHO細(xì)胞系中，涉及代謝活化的酶活性下降。所以，培養(yǎng)細(xì)胞對需代謝活化的化學(xué)物不能夠敏感。 解決方法， 一是加S9。 S9需要NADPH才具有代謝活化作用，故在培養(yǎng)液中應(yīng)加有NADPH生成系統(tǒng)(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸和NADP)。 與原代肝細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)。與原代肝細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)時也可采用其它不同的細(xì)胞系，如V79、中國地鼠肺成纖維細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞。,毒理學(xué)新技

35、術(shù)課件,84,3. 受試物的給予,許多受試物由于水溶性較低，在加入培養(yǎng)液前，常需溶于有機溶劑，有機溶劑對細(xì)胞有損害作用，故應(yīng)限制有機溶劑濃度在1以下。 在試驗中可設(shè)立適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑對照和培養(yǎng)液對照。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,85,4.設(shè)立陽性對照組,實驗系統(tǒng)的重現(xiàn)性應(yīng)該用陽性對照物來檢查。陽性對照物指采用經(jīng)過研究或公認(rèn)有特定作用的化學(xué)物。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,86,亞細(xì)胞組分制備及其檢測方法,微粒體的制備 肝微粒體制備 肝外組織微粒體的制備 線粒體的制備 亞線粒體顆粒的制備,毒理學(xué)新技術(shù)課件,87,設(shè)備,設(shè)備 勻漿器 離心機： 低溫高速離心機，最大轉(zhuǎn)速為18 00024000rpm， 超速離心機，最大

36、轉(zhuǎn)速為5000075000rpm。 勻漿介質(zhì)和緩沖液 最常用的勻漿介質(zhì)為等滲的蔗糖(0.25molL)和氯化鉀(0.154molL) 生物樣品 實驗動物如大鼠、小鼠、金黃地鼠應(yīng)迅速處死，常用的方法是斷頭處死。 應(yīng)避免使用麻醉劑，如乙醚、巴比妥類藥物，它們將影響毒物代謝酶的活力。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,88,肝微粒體制備,肝勻槳,離心，10000g 20 min,上清液 沉淀,離心，10500g 1h,沉淀 （微粒體） 上清液棄去,毒理學(xué)新技術(shù)課件,89,線粒體的制備,肝勻槳,離心，460g 10 min,上清液 沉淀(包括細(xì)胞核，紅細(xì)胞,離心，12500g 10 min 及大的細(xì)胞碎片),沉淀 （

37、含有線粒體） 上清液 棄去,整個制備過程應(yīng)在1h內(nèi)完成,細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞,大量完整的線粒體和一些溶酶體,一些破的線粒體和微粒體,毒理學(xué)新技術(shù)課件,90,細(xì)胞程序性死亡及其檢測方法,細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一種與遺傳機制有關(guān)的、主動的自發(fā)性死亡方式，并在形態(tài)和生化上出現(xiàn)一系列特征表現(xiàn)。具有這些特征表現(xiàn)的細(xì)胞稱為細(xì)胞凋亡(apoptosis)。 細(xì)胞凋亡：而細(xì)胞凋亡的特征表現(xiàn)是胞內(nèi)水分丟失，胞漿濃縮，胞膜結(jié)構(gòu)完好，細(xì)胞核濃縮聚集于核膜邊緣，形成新月形。到晚期，細(xì)胞核碎裂成小片，胞漿分割，形成由細(xì)胞膜所包繞的含有核碎片的小體，稱為凋亡小體(apoptot

38、ic body)。 細(xì)胞壞死(necrosis) ：壞死是指體內(nèi)、外致?lián)p傷因素作用達(dá)到一定強度、持續(xù)一定時間后，所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，它表現(xiàn)為細(xì)胞及細(xì)胞器腫脹、碎裂和溶解等。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,91,細(xì)胞程序性死亡的檢測方法,1. 形態(tài)學(xué)觀察法 主要依靠光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特點。 觀察材料可以是石蠟切片、冰凍切片或細(xì)胞涂片。 形態(tài)學(xué)觀察可用HE染色或熒光染料PI、DAPI等染色。,normal,毒理學(xué)新技術(shù)課件,92,毒理學(xué)新技術(shù)課件,93,掃描電鏡,毒理學(xué)新技術(shù)課件,94,透射電鏡觀察,毒理學(xué)新技術(shù)課件,95,電泳檢測法,原理是在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，由于內(nèi)源性核苷酸酶的激活，D

39、NA被有規(guī)律地切割成約180bp或其倍體的雙鏈DNA片段，在凝膠電泳上可形成梯帶，即具有凋亡的特征DNA梯帶(DNAladder)。,，,毒理學(xué)新技術(shù)課件,96,單細(xì)胞凝膠電泳,將細(xì)胞包埋于低熔點瓊脂糖內(nèi)，置于堿性裂解液中，使細(xì)胞裂解后，瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色，觀察細(xì)胞DNA的斷裂情況。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,97,末端轉(zhuǎn)移標(biāo)記法,末端轉(zhuǎn)移標(biāo)記技術(shù)是利用在發(fā)生凋亡時，DNA鏈被激活的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶切割成許多180bp左右的雙鏈DNA片段。 這些片斷均含有3-OH末端，在末端轉(zhuǎn)換酶或DNA多聚酶，(TdT酶)作用下，加入已標(biāo)記的核苷酸或核苷酸混合物，再經(jīng)過酶顯色或用熒光抗體使之顯示出來。,毒理

40、學(xué)新技術(shù)課件,98,細(xì)胞分析儀檢測法,常用的細(xì)胞分析儀有兩類， 流式細(xì)胞分析儀，可對單個細(xì)胞懸液中的單個細(xì)胞進(jìn)行檢測。 借助細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)和計算機分析技術(shù)，可快速檢出發(fā)生凋亡的細(xì)胞。其原理是在正常增殖狀態(tài)的細(xì)胞，處于不同周期時相，即G0Gl，S1，G2M期，其DNA含量分布在2n4n之間；。 細(xì)胞形態(tài)分析儀，可對載玻片上單個細(xì)胞進(jìn)行檢測。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,99,毒理學(xué)新技術(shù)課件,100,二、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因,現(xiàn)已報道，有25個癌基因與細(xì)胞凋亡有關(guān)。 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因大致可分為兩大類，即凋亡促進(jìn)（apoptosis on）基因和凋亡抑制（apoptosis off ）基因。它們分別起著促進(jìn)凋亡和

41、抑制凋亡的作用，彼此之間還存在一定的相互關(guān)聯(lián)。 1凋亡抑制基因 凋亡抑制基因包括bcl-2、ced-9、bcl-X，其中最主要也是當(dāng)前研究最多的是bcl-2，bcl-2是癌基因的一種，在人體多種形態(tài)的腫瘤中過度表達(dá)，可抑制由多種剌激包括化療和放療引起的細(xì)胞凋亡。bcl-2常在淋巴細(xì)胞系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，抑制該部位的細(xì)胞凋亡。淋巴性白血病細(xì)胞中bcl-2也是過度表達(dá)的。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,101,2凋亡促進(jìn)基因 凋亡促進(jìn)基因有ced-3,4、p53、ICE、Bax、bcl-Xs、TGF等。其中ced-3，4是在線蟲索中發(fā)現(xiàn)的，而p53、ICE等存在于哺乳動物中。 p53為腫瘤的抑制基因，分為兩

42、型，一型是使細(xì)胞周期停止在GI期，抑制細(xì)胞繁殖的野生型；另一型是具有突變能力的變異型。野生型p53可誘導(dǎo)易感細(xì)胞發(fā)生凋亡。 白介素1轉(zhuǎn)換酶（interlukin 1-converting enzyme, ICE）,與線蟲細(xì)胞凋亡相關(guān)基因ced-3有較高的同源性，具有直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。 c-myc是典型的原癌基因，在許多腫瘤中它有多種失活形式。c-myc的表達(dá)驅(qū)動細(xì)胞凋亡，這與細(xì)胞所處的條件有關(guān),毒理學(xué)新技術(shù)課件,102,凋亡基因之間的相互作用,bcl-2能妨礙依賴p53的凋亡，但不影響依賴p53的生長停滯，可是將bcl-2與c-myc共表達(dá)時，這兩者都被阻斷。一個主要顯性癌基因c-myc與一個抗凋亡基因bcl-2的協(xié)同作用會導(dǎo)致腫瘤向惡性表型進(jìn)展，并對腫瘤治療的抗性增加，而p53和bcl-2間的相互拮抗作用則有利于抗腫瘤治療。,毒理學(xué)新技術(shù)課件,103,凋亡細(xì)胞特有的生化改變,(1)Ca2+活化胞漿蛋白酶，稱為IC