人A549肺腺癌始動(dòng)細(xì)胞的富集和鑒定﹡

1、人A549肺腺癌始動(dòng)細(xì)胞的富集和鑒定林盛，張振華，饒明月，吳敬波（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科， 646000）摘要:目的 利用紫杉醇聯(lián)合無(wú)血清培養(yǎng)完成對(duì)A549肺腺癌始動(dòng)細(xì)胞的富集并鑒定富集亞群的干細(xì)胞特性。方法 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，得到成球狀生長(zhǎng)的細(xì)胞；傳至第二代時(shí)加入紫杉醇作用48h，離心去除死細(xì)胞和紫杉醇，換新鮮干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，至存活細(xì)胞恢復(fù)克隆生長(zhǎng)后鑒定其干細(xì)胞相關(guān)特性。結(jié)果 用紫杉醇聯(lián)合無(wú)血清培養(yǎng)方式法成功從A549細(xì)胞中富集得到腫瘤干細(xì)胞，該群的細(xì)胞高表達(dá)CD133/CD326分子及干細(xì)胞相關(guān)基因，具有多向分化潛能，高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因及和更強(qiáng)的致

2、瘤能力，具備干細(xì)胞相關(guān)特性。結(jié)論 紫杉醇聯(lián)合無(wú)血清培養(yǎng)富集得到高表達(dá)CD133/CD326分子的細(xì)胞亞群，該亞群具備干細(xì)胞相關(guān)特性，可用于后續(xù)肺腺癌干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究。關(guān)鍵詞:腫瘤始動(dòng)細(xì)胞；A549;紫杉醇Enrichment and identification of lung adenocarcinoma initiating cells from A549LIN Sheng, ZHANG Zhen-hua, RAO Ming-yue, WU Jing-bo(Oncology Department, Affiliated Hospital of Luzhou Medical Colle

3、ge, Sichuan 646000, China)Abstract: Objective To obtain the lung adenocarcinoma initiating cells from the A549 cell line based on paclitaxel treatment combination with serum-free cultivation and to validate spared cells can represent tumor initiating cells (TICs). Methods After dissociated by trypso

4、gen, about 106/ml cells were suspended in serum-free medium supplemented with 0.4% BSA, insulin, basic fibroblast growth factor (bFGF), human recombinant epidermal growth factor (EGF) and obtained spheroid cells. At the second passage, paclitaxel was added at a concentration of 100nmol/L for 48 h an

5、d then replaced with completely fresh medium once or twice per week until new spheroids emerged. Results The subpopulation of cells that survived serum-free cultivation and paclitaxel treatment could highly express the CD133/CD326 molecular markers and have features of stemness including differentia

6、tion, high expression of CSCs-associated genes and stronger capability of tumorigenesis.Conclusions The survived subpopulation that highly express the CD133/CD326 molecular markers presenting the characteristics of stemness in vitro and in vivo, and could be used in future 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81201682

7、）。通訊作者，Email:researches of biological functions.Key words: tumor initiating cells; A549; paclitaxel非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是重要的惡性腫瘤致死原因。近十年以來(lái)，隨著診斷水平的提高和綜合治療模式（新輔助化療，高精度放療以及分子靶向治療）的改進(jìn)，使肺癌病員有所受益，但總5年生存率改善并不明顯。大量的研究證實(shí)，在腫瘤組織中存在為數(shù)極少數(shù)的細(xì)胞（腫瘤始動(dòng)細(xì)胞或癌干細(xì)胞）：，其具備始動(dòng)腫瘤發(fā)生、維持自我更新、治療放化療抗拒、等特點(diǎn)，有更強(qiáng)的侵襲和致瘤能力，是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根

8、源。從腫瘤干細(xì)胞層面進(jìn)行研究將有利于闡明肺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的臨床診療靶點(diǎn)以達(dá)到提高療效之目的。本研究中，我們采用紫杉醇聯(lián)合無(wú)血清逆向誘導(dǎo)的方法從A549細(xì)胞株中富集肺腺癌始動(dòng)細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)干細(xì)胞特性的驗(yàn)證，為后期腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究奠定基礎(chǔ)。1 資料與方法1.1 細(xì)胞來(lái)源 A549人肺腺癌細(xì)胞株，購(gòu)自美國(guó)ATCC中心；1.2 動(dòng)物來(lái)源 雄性健康裸鼠6只，4周齡，瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室代購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，無(wú)特定病原體級(jí)；1.3 主要試劑和儀器 重組人bFGF、重組人EGF購(gòu)自Pepro Tech公司，重組人胰島素、牛血清白帶白（BSA）購(gòu)自Sigma公司，鼠抗人CD133

9、/1-PE流式抗體、鼠抗人CD326-FITC 流式抗體，鼠源同型IgG1-PE、鼠源同型IgG1-FITC,購(gòu)自Miltenyi Biotec公司。紫杉醇注射液購(gòu)自山西普德藥業(yè)有限公司, 兔抗人CD133(Abcam公司),山羊抗人CD326(Santa Cruz公司), FITC-山羊抗兔IgG(Beyotime公司),CY3-驢抗山羊IgG(Biolegend公司), DAPI工作液(Beyotime公司),山羊抗兔IgG及兔抗CK8/18工作液(中衫金橋生物技術(shù)有限公司),DAB顯色試劑盒及免疫組化試劑盒(SABC法)購(gòu)自DAKO公司,抗熒光淬滅封片液(Beyotime公司)。倒置相差

10、顯微鏡、流式細(xì)胞儀及激光共聚焦均由瀘州醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。1.4 A549細(xì)胞的逆向誘導(dǎo) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，胰酶消化后離心，用干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，第二天即可見(jiàn)成球狀生長(zhǎng)細(xì)胞的出現(xiàn)；成球細(xì)胞達(dá)到傳代量（細(xì)胞密集，成球多、成球大、致密，機(jī)械吹散成小細(xì)胞團(tuán)后第二天即恢復(fù)到之前的狀態(tài)）后，加入等量的干細(xì)胞培養(yǎng)基，吸管反復(fù)輕柔吹散成球細(xì)胞后，吸取半量細(xì)胞懸液至新培養(yǎng)瓶，完成傳代。1.5 紫杉醇對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞的富集 成球細(xì)胞傳至第二代，細(xì)胞達(dá)到傳代量后將細(xì)胞盡量機(jī)械吹散至單個(gè)細(xì)胞； 106個(gè)/ml級(jí)的A549細(xì)胞對(duì)應(yīng)紫杉醇濃度0.1mol/L，作用48 h后離心換用新鮮干細(xì)胞培養(yǎng)基；換用培養(yǎng)基后第二天

11、可見(jiàn)大量成球細(xì)胞死亡，僅少數(shù)由兩到三個(gè)聚成的細(xì)胞克隆存在；據(jù)成球細(xì)胞的多少及大小使用低速離心600-800 rpm，將存活的細(xì)胞克隆選出，去除死細(xì)胞碎片，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔天觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)，每周對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液（1-2次），直細(xì)胞恢復(fù)加藥前的生長(zhǎng)狀態(tài)。1.6 CD133/CD326流式細(xì)胞檢測(cè) 待檢細(xì)胞（A549細(xì)胞消化離心，懸浮細(xì)胞收集離心）用PBS洗滌2次；設(shè)置同型和待檢組，按照使用說(shuō)明分別加入相應(yīng)的CD133/CD326流式抗體及同型（濃度為1：11）孵育30分鐘；PBS洗滌三次后樣本避光送檢。1.7 成球細(xì)胞CD133/CD326的免疫熒光檢測(cè) 紫杉醇處理后第四代成球細(xì)胞，吸取細(xì)胞懸

12、液至載玻片，涂片離心機(jī)，800 rpm，離心5分鐘后浸入4%多聚甲醛固定20分鐘； 0.1%的Triton作用3分鐘后PBS洗滌；滴加5%的BSA作用10分鐘后用吸水紙吸凈。滴加1：300的兔抗人CD133和山羊抗人CD326一抗，4 冰箱避光孵育過(guò)夜。次日，將玻片常溫放置30分鐘，PBS洗滌三次，滴加1：400的羊抗兔-FITC-CD133，驢抗山羊-CY3-CD326熒光二抗，避光孵育30分鐘后PBS洗滌三次；滴加DAPI工作液，復(fù)染細(xì)胞核4分鐘，PBS洗滌三次，抗熒光淬滅封片劑后送檢。1.8 成球細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的成球細(xì)胞吸入六孔板中，平板離心機(jī)，1500 rpm,離心5分鐘

13、，棄掉干細(xì)胞培養(yǎng)基；重新加入含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清的完全培養(yǎng)基，每孔4 ml，常態(tài)培養(yǎng)，每天觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化情況，第六天取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定30分鐘；PBS洗滌后將其置入0.3%的雙氧水處理20分鐘；PBS漂洗，血清封閉處理30分鐘，滴加CK8/CK18單克隆抗體，孵育過(guò)夜；PBS漂洗后滴加第二抗體（山羊抗兔）后37 孵育30分鐘；PBS漂洗，加入SABC后37 孵育30分鐘；PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素細(xì)胞核復(fù)染，經(jīng)分化，藍(lán)化后，梯度乙醇脫水處理，透明后中性樹(shù)膠封片送檢。1.9 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 生長(zhǎng)良好4周齡、雄性裸鼠9只，三只/組，分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組；選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，能進(jìn)行傳代的A54

14、9細(xì)胞及成球細(xì)胞，收集到離心管，1500 rpm,5分鐘；去掉上清，按不同細(xì)胞加入相應(yīng)的培養(yǎng)基各1 ml，充分吹散細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度；CD133+/CD326+細(xì)胞的濃度分別為1104，1105和5103個(gè)/ml對(duì)應(yīng)普通A549細(xì)胞1104，1105和1106個(gè)/ml；CD133+/CD326+細(xì)胞注射在裸鼠的左前腋下，A549細(xì)胞注射在裸鼠的右前腋下；觀(guān)察成瘤情況，在瘤體最大徑線(xiàn)達(dá)到2 cm后處死所有老鼠，剝離腫瘤進(jìn)行病理學(xué)檢查。2.結(jié) 果2.1 逆向誘導(dǎo)聯(lián)合紫杉醇的富集結(jié)果 普通A549細(xì)胞胰酶消化后用干細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)成球狀生長(zhǎng)，傳代培養(yǎng)至第二代，加入紫杉醇處理48h后換以新鮮干細(xì)胞

15、培養(yǎng)基，可見(jiàn)大部分成球細(xì)胞裂解，僅有極少數(shù)的細(xì)胞克隆存活；視細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行離心換液，大約經(jīng)過(guò)兩周時(shí)間，殘存的細(xì)胞能重新恢復(fù)克隆生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。a：A549細(xì)胞誘導(dǎo)第2代；b：紫杉醇處理后第4天，細(xì)胞大部分死亡；c：紫杉醇處理后第14天（200）圖1 紫杉醇聯(lián)合干細(xì)胞培養(yǎng)基逆向誘導(dǎo)對(duì)A549始動(dòng)細(xì)胞的富集2.2 富集細(xì)胞的CD133/CD326流式檢測(cè)結(jié)果 紫杉醇處理后的細(xì)胞恢復(fù)正?？寺∩L(zhǎng)狀態(tài)后，能在體外連續(xù)的傳代培養(yǎng)；細(xì)胞球數(shù)目明顯增多，體積變大，胞漿折光度佳。第四代細(xì)胞CD133/CD326雙陽(yáng)性率在80%-90%，證實(shí)紫杉醇聯(lián)合干細(xì)胞培養(yǎng)基逆向誘導(dǎo)可有效富集CD133/CD326細(xì)胞亞

16、群，見(jiàn)圖2。a：富集細(xì)胞第4代（200）；b：第四代富集細(xì)胞的CD133/CD326雙陽(yáng)性率圖2 富集細(xì)胞第四代的生長(zhǎng)狀態(tài)及CD133/CD326的流式測(cè)定2.3 富集細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果 紫杉醇處理后第四代成球細(xì)胞進(jìn)行CD133/CD326分子表達(dá)的熒光檢測(cè)，在共聚焦顯微鏡下可以看到成球細(xì)胞中絕大多數(shù)的細(xì)胞均表達(dá)CD133(綠色熒光)和CD326（紅色熒光），熒光主要分布在細(xì)胞膜上，部分位于胞質(zhì)，見(jiàn)圖3。a：DAPI染色顯示細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色；b：CD133的表達(dá)（綠色熒光）；c：CD326的表達(dá)（紅色熒光）；d：CD133/CD326的共表達(dá)（顯示為橙色熒光）圖3第四代成球細(xì)胞的免疫熒光共聚

17、焦檢測(cè)2.4成球細(xì)胞的分化和分化抗原CK8/CK18的表達(dá) 成球細(xì)胞在分化培養(yǎng)基條件下，一天即可貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)由圓形逐漸變扁圓形，在第六天就和普通A549細(xì)胞的形態(tài)基本相似；對(duì)第六天的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞均表達(dá)分化抗原CK8或者CK18,證實(shí)CD133+/CD326+細(xì)胞亞群具備分化的功能，見(jiàn)圖4。a：成球細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中24 h的生長(zhǎng)狀態(tài)（細(xì)胞貼壁族團(tuán)狀生長(zhǎng)）；b：成球細(xì)胞分化第六天，細(xì)胞與普通A549細(xì)胞外形相似；c：免疫組化測(cè)定分化地六天細(xì)胞CK8/CK18分化抗原的表達(dá)顯示全部細(xì)胞均表達(dá)CK8/CK18分化抗原（200）圖4成球細(xì)胞的分化及分化抗原的免疫組化檢測(cè)2.5裸鼠

18、成瘤實(shí)驗(yàn) CD133+/CD326+細(xì)胞注射在裸鼠的左前肢腋下，A549細(xì)胞注射在小鼠的右前肢腋下；結(jié)果顯示1104級(jí)的CD133+/CD326+細(xì)胞即能成瘤而105級(jí)的A549細(xì)胞也不能成瘤，證實(shí)富集細(xì)胞具備更強(qiáng)的致瘤能力，見(jiàn)圖5。a：兩種細(xì)胞懸液濃度均為1104個(gè)/ml時(shí)，僅CD133+/ CD326+細(xì)胞成瘤（左前腋下）；b：剝離的移植瘤；c：移植瘤送檢HE染色示腺癌組織（200）圖5裸鼠成瘤及病理檢測(cè)3討 論癌干細(xì)胞存在于大多數(shù)實(shí)體腫瘤中，并能為某些表面分子所標(biāo)記:乳腺癌以CD44+/CD24-/low作為干細(xì)胞分子標(biāo)記【1】，黑色素瘤以CD133+或者CD20+作為干細(xì)胞分子標(biāo)記【2

19、】，其他諸如膠質(zhì)瘤【3】、前列腺癌【4】、卵巢癌【5】、肝癌【6】、胰腺癌【7】以及結(jié)腸癌【8】等均可以CD133+作為干細(xì)胞的分子標(biāo)記。但就肺癌干細(xì)胞而言，對(duì)其確切的分子表面標(biāo)記存有爭(zhēng)議。Tirino等通過(guò)體外和體內(nèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在肺癌組織中CD34+/CD326+或者CD133+/CD326+細(xì)胞亞群具備干細(xì)胞特性，但在肺癌細(xì)胞株A549/CALU1/LC12/LC31/LC52,僅CD133+/CD326+細(xì)胞亞群才具備干細(xì)胞特性【9】。但Meng等通過(guò)磁性活細(xì)胞分選，得到CD133+和CD133-細(xì)胞亞群，經(jīng)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CD133+和CD133-細(xì)胞亞群中含有等量的干細(xì)胞樣細(xì)胞，

20、說(shuō)明至少在肺癌細(xì)胞株A549和H446上，CD133不能單獨(dú)作為干細(xì)胞的分子標(biāo)記物【10】；臨床研究報(bào)道也認(rèn)為CD133的表達(dá)與肺癌的預(yù)后也無(wú)明確的相關(guān)性【11】。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇藥物篩選聯(lián)合無(wú)血清培養(yǎng)逆向誘導(dǎo)富集A549始動(dòng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)檢測(cè)流式細(xì)胞表達(dá)率證實(shí)富集得到的細(xì)胞亞群表達(dá)CD133/CD326表面分子；為了更直觀(guān)地觀(guān)察體外傳代培養(yǎng)后細(xì)胞球CD133/CD326分子的表達(dá)情況，我們用FITC標(biāo)記的綠色熒光和CY3標(biāo)記的紅色熒光抗體對(duì)CD133和CD326進(jìn)行共聚焦檢測(cè)，結(jié)果顯示第四代的始動(dòng)細(xì)胞絕大多數(shù)表達(dá)CD133/CD326分子。多向分化潛能和更強(qiáng)的成瘤能力是腫瘤干細(xì)胞所具備

21、的重要特性。在分化實(shí)驗(yàn)中，CD133+/CD326+細(xì)胞在第二天即可以貼壁生長(zhǎng)，其后逐漸成扁平不規(guī)則狀生長(zhǎng)，第六天外形和普通A549細(xì)胞相類(lèi)似，免疫組織化學(xué)結(jié)果證實(shí)分化細(xì)胞均表達(dá)CK8/CK18細(xì)胞角化蛋抗原，說(shuō)明其有向普通腫瘤細(xì)胞分化的潛能。成瘤實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)104級(jí)CD133+/CD326+即能形成移植瘤，而10倍量的普通A549細(xì)胞不能成瘤，說(shuō)明富集細(xì)胞亞群較普通的A549細(xì)胞具備更強(qiáng)的自我更新增殖能力?？傊ㄟ^(guò)以上實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)了以CD133/CD326標(biāo)記的富集細(xì)胞亞群，具備干細(xì)胞的相關(guān)特性包括連續(xù)的傳代成球能力，向普通腫瘤細(xì)胞分化的潛能，較普通細(xì)胞具備更強(qiáng)的成瘤能力，能夠用于肺腺癌

22、干細(xì)胞后期生物學(xué)特性的研究。參考文獻(xiàn)：1 Al-Hajj M., Wicha M.S., Benito-Hernandez A., et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells J. Proc. Natl. USA, 2003, 100(11):3983-88.2 Zabierowski S.E., Herlyn M. Melanoma stem cells: the dark seed of melanoma J. J C O, 2008, 26(6):2890-4.3 Singh S.K., Haw

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