分子生物學(xué)技術(shù)在動物繁殖中的應(yīng)用

1、分子生物學(xué)技術(shù)在動物繁殖中的應(yīng)用岳耀敬，郭憲，焦碩，楊博輝，郭建（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州730050）摘要：rna干擾(rnai)和基因芯片技術(shù)是近年興起的重要的分子生物學(xué)技術(shù)。作者介紹了rna干擾和基因芯片的概念、分類、及其在動物繁殖中的應(yīng)用，并就這兩項分子生物學(xué)技術(shù)在未來繁殖學(xué)中的應(yīng)用進行了展望。隨著rnai和基因芯片技術(shù)的不斷發(fā)展完善,必將在動物繁殖生產(chǎn)實踐中發(fā)揮巨大的作用。關(guān)鍵詞：rna干擾；基因芯片；動物繁殖動物繁殖技術(shù)是生物技術(shù)的重要組成部分，是以動物生殖細胞和胚胎為主要研究對象，以生物科學(xué)為基礎(chǔ)，研究調(diào)控和提高動物繁殖性能、發(fā)掘動物繁殖潛能。動物繁殖是動物生

2、產(chǎn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對動物數(shù)量的增加和質(zhì)量的提高具有重要作用。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，動物繁殖技術(shù)的研究不斷深入，應(yīng)用范圍日益廣泛。動物繁殖技術(shù)從20世紀50年代的人工授精到70年代的胚胎移植的應(yīng)用，開始了新紀元。常規(guī)人工授精和胚胎移植、性別控制等一系列高新技術(shù)的應(yīng)用使得動物繁殖的速度更快、生產(chǎn)性能更高、準確性更好，給畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益，為其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了強大的動力和競爭力。另外，分子生物學(xué)的某些突破使人們能夠分離基因，并在體外進行重組。這些突破迎來了動物繁殖技術(shù)發(fā)展的新時代。本文主要闡述了rna干擾(rnainterference,rnai)，基因芯片等幾個方面的動物繁殖技術(shù)應(yīng)用

3、進展。1rna干擾rna干擾現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平基因沉(post2transcriptionalgenesilence,ptgs),是指一些小分子雙鏈rna(doublestrandrna,dsrna)通過特異性降解與其同源的mrna,而在mrna水平上高效阻斷體內(nèi)特異性基因表達的現(xiàn)象。rnai廣泛存在于真菌、高等植物、無脊椎動物和哺乳動物中,是自然界中客觀存在的進化保守防御機制,在維持基因穩(wěn)定、保護基因組免受外源核酸侵入、基因表達調(diào)控等方面發(fā)揮重要生物學(xué)作用。自1998年美國卡耐基研究院fire等報道在秀麗新小桿線蟲(caenorhabditiselegans)中低劑量的雙鏈rna可有效調(diào)節(jié)基

4、因表達現(xiàn)象,并提出rnai概念以來,rnai現(xiàn)象引起特別重視,對其的研究也越來越深入。2002年,science雜志將這一發(fā)現(xiàn)評為該年度世界十大科學(xué)成就之首,最近公布,該現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)者榮獲2006年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎,對rnai的研究和應(yīng)用已逐漸成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱點。1.1rnai應(yīng)用于動物卵母細胞2000年,wianny等首次將rnai技術(shù)應(yīng)用于小鼠卵母細胞研究,即選取在卵泡中表達的c-mos基因作為靶基因,通過顯微注射方式導(dǎo)入dsrna,結(jié)果與對照組基因敲除小鼠實驗結(jié)果完全相同,即c-mos基因表達被抑制,細胞減數(shù)分裂停滯在m期,說明rnai可以用于哺乳動物細胞基因功能研究;向小鼠生發(fā)

5、泡(g)期卵母細胞中顯微注射三磷酸肌醇型受體基因(ip3r-)的dsrna,該基因表達水平下調(diào),實驗組卵母細胞可發(fā)育至m期,但皮質(zhì)顆粒胞吐作用顯著降低,且鈣離子瞬時釋放量下降,表明卵母細胞成熟過程中,鈣離子通道蛋白(ip3受體)與鈣離子波動有一定關(guān)系;通過顯微注射方法,將具有卵母細胞特定zp3啟動子的msy2長鏈發(fā)夾dsrna注入小鼠卵母細胞,以降低msy2基因表達量,導(dǎo)致一些與卵母細胞成熟相關(guān)的蛋白質(zhì)無法合成,說明msy2基因在小鼠卵子發(fā)生過程中對母源mrna穩(wěn)定性具有調(diào)節(jié)作用;用rnai方法抑制小鼠x連鎖地中海智力低下綜合征基因(atrx)的表達,發(fā)現(xiàn)該基因?qū)π∈舐涯讣毎麥p數(shù)分裂的級數(shù)無影

6、響,但在染色體排列和減數(shù)分裂m期紡錘體的形成中具有重要作用。1.2rnai應(yīng)用于哺乳動物胚胎發(fā)育 為了證實rnai是否影響小鼠胚胎中的基因表達,wianny等構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因小鼠檢測體系,該體系在延伸因子21a(et21a)啟動子調(diào)控下表達修飾型綠色熒光蛋白(mmgfp),將mmgfp的dsrna注入單細胞受精卵,體外培養(yǎng)34d后,發(fā)現(xiàn)未注射dsrna的胚胎中大量表達gfp,而注射組只有6.18%表現(xiàn)出微弱的熒光,說明dsrna可以抑制gfp的表達;但在注入c-mos和e-cadherin的dsrna單細胞受精卵中,gfp表達并不受影響,說明dsrna具有抑制的特異性;若在小鼠受精卵中注入e-ca

7、dherin的dsrna,則胚泡發(fā)育受阻;向單細胞胚胎注入mdicer的sirna或長mdicer的dsrna,以抑制小鼠胚胎中的rnai,用于分析小鼠內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶l(muerv-l)和iap(順反子內(nèi)a粒子,intracisternalaparticle)2個自主性長端點重復(fù)序列在8-細胞期胚胎的表達情況,結(jié)果muerv2l和iap的表達量提高50%,說明rnai抑制了重復(fù)寄生序列(repetitiveparasitic_sequences)在著床前胚胎中的表達,這種機制有助于保持基因組的完整性;在小鼠受精卵原核中注射oct4的sirna表達載體,發(fā)現(xiàn)該基因mrna和蛋白質(zhì)水平下降,胚胎發(fā)

8、育停滯于囊胚期。由于易于收集和培養(yǎng)，因此雞胚是進行動物體內(nèi)實驗的常用模型。pekarik等首創(chuàng)用rnai和卵內(nèi)電穿孔相結(jié)合的方法進行活體基因功能研究,采用黃色熒光蛋白(yfp)作為指示蛋白,用電穿孔法將yfp和axonin21的dsrna轉(zhuǎn)入雞胚,發(fā)現(xiàn)yfp和axonin21表達量明顯降低;隨后,dai等構(gòu)建了含有caxin2和cparaxis兩個目的基因sirna的pegfp2shrna改良載體,用電轉(zhuǎn)換法導(dǎo)入雞胚神經(jīng)管或體節(jié)中,發(fā)現(xiàn)caxin2的表達被抑制,cparaxis的mrna表達量和肌漿蛋白量減少。1.3rnai應(yīng)用于精子發(fā)生精子形成包括精原干細胞有絲分裂增殖、精母細胞減數(shù)分裂和精

9、細胞形成等過程,是許多基因相互作用的結(jié)果。shao等用電穿孔法向小鼠睪丸中導(dǎo)入外源報告基因,然后用同樣的方法導(dǎo)入包含shrna的dna載體,發(fā)現(xiàn)報告基因的表達量在各個時期均有不同程度的降低,進一步用rnai技術(shù)沉默精母細胞形成過程中編碼dna重組酶的內(nèi)源性dmc1(disruptionofmeioticcontrol),結(jié)果發(fā)現(xiàn)dmc1基因沉默小鼠精母細胞發(fā)育停滯、不育,該實驗體系為在體內(nèi)研究精子發(fā)生相關(guān)基因的功能提供了一條新的思路;用rnai技術(shù)沉默葡萄球菌激酶(staphylokinase,sak),結(jié)果顯示其與人類細胞中心體的復(fù)制有關(guān),缺乏sak基因的細胞表現(xiàn)為中心體復(fù)制受阻,大部分精細

10、胞不能形成精子軸絲;小鼠支持細胞中威爾氏瘤基因(wilmstumor,wt1)沉默后,其干細胞凋亡率增高,粘附能力喪失,受精率降低,說明wt1能夠啟動支持細胞干細胞信號傳導(dǎo),從而促進精子的形成;磷脂酶c-zeta(plc2)基因是睪丸特異性基因,可能與雄性干細胞發(fā)育有關(guān),如果精子中缺少plc2,會造成男性不孕癥,williams和schultz在前人研究基礎(chǔ)上,進一步證實該基因會引起一連串卵子上鈣離子的沖擊而誘發(fā)卵子受精。2基因芯片技術(shù)基因芯片(gene-chip),又稱dna微陣列(dnamicroarray),是指固著在載體上的高密度dna微點陣(ehricht等,2005)?；蛐酒墓?/p>

11、作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法(southern、northern)是一致的,都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補的靶核苷酸序列雜交,通過隨后的信號檢測進行定性與定量分析,其最大的優(yōu)點在于能在一微小的基片(硅片、玻片、塑料片等)表面集成大量的分子識別探針,在同一時間內(nèi)平行分析大量基因,進行大信息量的篩選與檢測分析。試驗結(jié)果表明,利用基因芯片數(shù)一次10min至數(shù)小時的試驗,其獲取的基因表達信息相當(dāng)于傳統(tǒng)的northern雜交數(shù)月60多萬次雜交的信息,這就非常適合于同時檢測大量的基因表達變化?；蛐酒念愋洼^多,根據(jù)儲存的生物信息類型,基因芯片可分為寡核苷酸芯片和cdna微陣列。依據(jù)探針合成的順序分

12、為:原位合成基因芯片和預(yù)先合成后上樣的基因芯片,前者通過聚乙二醇或硅烷類化學(xué)試劑在不同位點合成不同的探針,后者比較簡單,先制備好cdna或寡核苷酸,然后在經(jīng)特殊處理的玻片、硅片或膜上點樣;按照基因芯片的用途可分為:基因表達芯片和dna測序芯片,前者是對不同來源的樣本進行差異基因表達分析,來確定該基因的功能,且可進一步研究基因與基因間相互作用關(guān)系,后者則是對大量基因進行序列分析。2.1基因芯片在動物繁殖中的開發(fā)和應(yīng)用目前在豬或其他家畜品種中基因芯片的應(yīng)用遠沒有在人類和小鼠中廣泛,原因之一是家畜的基因組測序要遠遠落后于小鼠和人,因此dna芯片技術(shù)最近才得到研究者的應(yīng)用。到目前為止,dna芯片在動物

13、繁殖應(yīng)用的報道仍然較少,lee(2005)用不同發(fā)育天數(shù)的豬胚胎與自制的尼龍膜芯片雜交,發(fā)現(xiàn)了在豬胚胎早期發(fā)育過程中的差異表達基因,為研究早期胚胎發(fā)育或死亡的分子機理提供了依據(jù)。在卵巢癌發(fā)展過程中,基因tp53起到臨界基因作用,chen等(1997)分別使用傳統(tǒng)的dna序列分析法和一種tp53寡核苷酸微陣芯片對108例卵巢腫瘤進行分析,根據(jù)tp53突變共計識別77例卵巢癌,使用微陣列分析識別71例,寡核苷酸微集陣列顯示出更高的精確度和靈敏度。ledger等(2004)和moser等(2005)建立了豬免疫或繁殖器官的cdna芯片進行抗病功能基因組學(xué)的研究。應(yīng)用cdna芯片的一個缺點是要建立文庫

14、并對大量基因克隆進行pcr擴增,芯片上較長的cdna的保守區(qū)域可能會與同家族的其他基因雜交造成假陽性。針對上述情況,美國qiagen-operon公司與美國豬基因組計劃協(xié)調(diào)人maxrothschild教授領(lǐng)導(dǎo)的豬基因芯片用戶委員會合作,設(shè)計并合成了豬13297個70bp長的寡聚核苷酸片段,這些片段幾乎均設(shè)計自每個基因的非保守區(qū)(即3非翻譯區(qū)),這些片段在人的所有染色體上都可找到同源基因,是進行豬功能基因組學(xué)研究的有力工具。最近,第一代豬的23937個基因的genechip也由美國affymetrix公司推出,但其價格相當(dāng)昂貴,在經(jīng)費不是相當(dāng)充足的實驗室難以推廣應(yīng)用。上述2種豬基因組芯片技術(shù)的開發(fā)為豬繁殖性能的功能基因組學(xué)研究提供了新方法(zh