原花青素的生化活性研究畢業(yè)論文

1、第 一 章前言原花青素(procyanldins，簡稱pc，其它曾用過的英文名有（proanthocyanidins,1eucoanthocyanidlns,lpycnogenol）是植物王國中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱。起初統(tǒng)歸于縮合鞣質(zhì)或黃烷醇類。隨著分離鑒定技術(shù)的提高和對此類物質(zhì)的深入研究與深刻認識，現(xiàn)已成為獨樹一幟的一大類物質(zhì)并稱之為原花青素。1961年，德國karl等從英國山楂crataegus oxyacantha新鮮果實的乙醇提取物中首次分離出2種多酚化合物；1967年，美國josiw等又從葡萄皮和籽提取物中分離出4種多酚化合物、他們得到的多酚化合物是無色的，在酸性介質(zhì)中加

2、熱均可產(chǎn)生花青素(cyanidins)物質(zhì)，故將這類多酚化合物命名為原花青素原花青素(procyanidins或proanthocyanidins,pc.)存在于許多植物的葉、花、果、皮中，且以皮中含量最高。是由黃烷-3-醇或黃烷-3.4-二醇及其酯以不同的聚合度聚合而成，原花青素化學結(jié)構(gòu)是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成。最簡單的原花青素是兒茶素與表兒茶素形成的二聚體，此外還有三聚體、四聚體等直至十聚體。按聚合度的大小分類，通常將二-四聚體稱為低聚體(procyanidolic o1igomers、簡稱opc， s)、將五聚體以上的稱為高聚體(procyamdolic polymers)

3、簡稱ppc。二聚體中、因兩個單體的構(gòu)象或鍵合位置的不同、可有多種異構(gòu)體、已分離鑒定的8種結(jié)構(gòu)形式分別命名為b1-b8，其中、blb4是由4-8位c-c鍵合、b5b8由4-6位c-c鍵合。在各類原花青素中，二聚體分布最廣，研究最多、是最重要的一類原花青素。三聚體中，也因組成的單體及其相連接碳原子位置的不同形成各種各樣的結(jié)構(gòu)并命名為c1、c2等，其中c1在自然界中分布最豐富。葡萄籽提取物原花青素呈棕色粉末溶于水、乙醇、甲醇、丙酮，也可溶于乙酸乙酯，不溶于乙醚、氯仿、苯等。有澀味。在280nn處有強的紫外吸收。高品質(zhì)的低聚原花青素在水和醇中有良好的溶解性，色澤亮麗。原花青素最具特征性的化學反應(yīng)是在酸

4、性溶液中加熱可降解和氧化形成花色素(batesmith反應(yīng))。原花青素在酸性溶液中同時發(fā)生自身縮合現(xiàn)象。一般情況下，在水溶液中縮合反應(yīng)的趨勢更明顯，在醇溶液中，以花色素反應(yīng)為主。目前對葡萄opc的研究一直處于領(lǐng)先地位共分離鑒定出16種pc，其中有8種二聚體、4種三聚體的opc。原花青素是一種很強的天然抗氧化劑和ve再生劑，能顯著抑制肝、腦中tpa誘導的脂質(zhì)過氧化和dna分裂，效果明顯優(yōu)于ve、vc和-胡蘿卜素。隨著pc研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)opc具有強大的抗氧化性和廣闊的藥理活性。經(jīng)文獻研究表明，低聚原花青素具有100%的生物利用率，是最強大的抗氧化劑。而現(xiàn)代藥理學研究表明：低聚原花青素可保護心

5、血管系統(tǒng)、改善微循環(huán)、抗腫瘤、抗突變、抗衰老、抗菌抗病毒、抗?jié)?、改善視力、改善腦功能等與80多種疾病有關(guān)。經(jīng)過40多年廣泛臨床、毒理學、藥物動力學研究證明，其無毒、非致癌、非致畸，并以安全、高效、高生物利用度著稱已有20年。因此，使其在醫(yī)藥、保健食品和化妝品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，引起各領(lǐng)域越來越多學者的關(guān)注。葡萄籽中已分離鑒定的低聚原花青素如圖。procyanidin(48) dimersr1=h,r2=oh (+)-caiechinr1=oh,r2=h (-)-epicaiechinprocyanidin(46) dimers葡萄籽中主要代表物原花青素的化學結(jié)構(gòu)（n表示以上的整數(shù)）低聚原花青素

6、結(jié)構(gòu)1 原花青素的生化活性研究進展自二十世紀80年代以來，人們對數(shù)十種植物的原花青素低聚體和高聚體進行了生化、藥理活性的研究。不同聚合度的原花青素其生化、藥理活性不盡相同。其中對葡萄籽原花青素低聚體的研究獨占熬頭，取得了突破性進展。法國masquelier j在對原花青素皮膚學方面研究發(fā)現(xiàn)，原花青素對皮膚保護和治療作用與其清除自由基的能力密切相關(guān)，而環(huán)境對皮膚、粘膜和毛發(fā)的刺激引起的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸的衰退過程均與自由基分不開。原花青素的多羥基結(jié)構(gòu)賦予其特殊的抗氧化活性和清除自由基能力，為其在保護皮膚的化妝品領(lǐng)域應(yīng)用提供了可靠的基礎(chǔ)。1.1抗氧化活性原花青素清除自由基和抗氧化活性的顯著作用已得

7、到國內(nèi)外學者和人們的肯定。原花青素對各種疾病的治療作用也與其超強的清除自由基能力和抗氧化活性密切有關(guān)。1951年，法國masqudier j從松樹皮中提取到原花青素，隨后發(fā)現(xiàn)原花青素具有清除自由基和抗氧化活性，又證明葡萄籽中低聚原花青素的抗氧化活性是ve的50倍，vc的20倍，是一種很好的氧自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑。至此，關(guān)于原花青素清除各類自由基和抗氧化作用相繼報道。noda等，通過esr分析技術(shù)對天然植物、健康食品和抗氧化物質(zhì)進行o2、oh清除活性實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原花青素捕獲oh能力強于銀杏提取物，在抗氧化方面則強于-兒茶素和茶葉提取物。葡萄籽原花青素能有效地清除o2、oh、h2o2、

8、onoo-和全血嗜中性白細胞“呼吸爆發(fā)”產(chǎn)生的多種活性氧而抑制體系發(fā)光，并有效抑制脂質(zhì)過氧化，保護dna免受oh引起的氧化損傷。 原花青素的聚合度對其抗氧化活性也有很大影響。原花青素二聚體的抗氧化活性最強。原花青素抑制低密度脂蛋白氧化活性與其結(jié)構(gòu)和聚合度密切相關(guān)。plumb等對兒茶素和原花青素抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，原花青素抗氧化活性在油相中隨聚合度而降低；在水相中抗氧化活性從單體到三聚體是增加的，而三聚體到五聚體的抗氧化活性則逐漸下降，兒茶素與原花青素二聚體棓?；a(chǎn)物抗氧化活性在油相中減弱，而在水相中增強；對兒茶素糖基化實驗證明其產(chǎn)物在油、水兩相中抗氧化活性均下降。bagchi d等在對醋酸酚（

9、tpa）誘導的小鼠大腦和肝臟脂質(zhì)過氧化和dna 損傷研究中，指出了葡萄籽原花青素對小鼠大腦和肝臟脂質(zhì)過氧化和dna 損傷都有較強的抑制作用，并與原花青素存在劑量依賴關(guān)系。在以谷氨酸鹽誘導的神經(jīng)膠質(zhì)細胞毒模型中，原花青素通過抗氧化作用可保護神經(jīng)細胞免受谷氨酸鹽的損害。原花青素不僅對巴豆油刺激多形核白細胞（pmns）生成h2o2有顯著的抑制作用，而且還可抑制h2o2釋放；并能抗巴豆油誘發(fā)的小鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化，提高肝線粒體sod活力，減少mda生成。原花青素對h2o2誘導的大鼠fao肝癌細胞氧化有較好的抑制作用，能降低mda和ldh含量，顯著增加還原型/氧化型谷胱甘肽的比例，維持過氧化氫酶水平，

10、使谷胱甘肽過氧化物酶活性增強，并提高谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性。葡萄和葡萄籽提取物原花青素對cu2+/aaph或sin-1和單核巨噬細胞過氧化物釋放而誘導的ldl氧化有較好的保護作用。給小鼠每天連續(xù)灌胃200、400mg/kg.bw的野生山葡萄多酚（主要成分為原花青素）30d，可顯著降低小鼠心、肝、腎、腦組織中mda及脂褐質(zhì)的含量（p0.05），當每天給予400mg/kg.bw時可極顯著提高心、腦組織sod活性，降低心、腦組織脂褐質(zhì)及mda含量（p0.01）。給糖尿病大鼠腹腔每天注射10mg/kg.bw自法國松樹皮提取的原花青素14d，能提高鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠抗氧化能力，使肝、

11、心、腎中過氧化氫酶恢復(fù)到正常水平，并能提高谷胱甘肽還原酶水平。人體每天食用0.375g/kg.bw可可粉（含兒茶素、表兒茶素和原花青素 b-2）對aaph誘導的人紅細胞氧化溶血有較好的保護作用，并達到顯著性差異（p0.05）。maffei f r等研究高相對分子質(zhì)量兒茶素寡聚體在0.11.0mmol/l時能防止細胞膜中ve損失，顯著減少膜脂質(zhì)過氧化，明顯推遲細胞溶血的發(fā)生時間。在oh誘導的卵磷脂過氧化作用中，葡萄籽原花青素具有顯著地劑量依賴性保護ve的消耗，并證實葡萄籽原花青素可使ve再生。健康人每天食用原花青素110mg，連續(xù)30d，可以使紅細胞膜中ve的水平從(1.80.1)mg/g增加到

12、(2.80.2) mg/g，同樣使淋巴細胞dna氧化水平從7.232.47降低到2.340.51，并能提高紅細胞膜不飽和脂肪酸含量。說明原花青素在體內(nèi)可以保護紅細胞膜中的ve和減少dna氧化損傷。1.2抗衰老作用當植物成熟時，它們產(chǎn)生了叫做花青素的植物化學物質(zhì)。這些植物化學物質(zhì)保護植物免受陽光引發(fā)的自由基傷害。許多物質(zhì)和某些環(huán)境（如陽光曝曬）會在人體內(nèi)產(chǎn)生自由基，這些植物化學物質(zhì)也保護我們身體免受這些自由基傷害。今天，科學家認為，起因于自由基對細胞的傷害，是引發(fā)大量疾病的首要因素，這些疾病包括癌癥、心血管問題、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、中風、白內(nèi)障等。另外，花青素還保護大腦與神經(jīng)組織，因為它有跨越血腦屏

13、障的獨特能力；它能改善血液循環(huán)，減少炎癥；它與膠原蛋白結(jié)合，助長細胞完善，使你有靈活的關(guān)節(jié)和年青人那樣的皮膚。可見，花青素這種奇妙物質(zhì)多方面有益于人體健康，可能正好是我們尋找的“青春之源”。原花青素抗衰老研究較早。masqudier j和美國專利均有報道，低聚原花青素的分子配置對膠原質(zhì)的穩(wěn)定性最適合，對膠原纖維的彈性恢復(fù)、交聯(lián)及穩(wěn)定效果最好。并通過體外實驗測定彈性蛋白酶（豬胰彈性蛋白酶和人白細胞彈性蛋白酶）的降低來評價原花青素對膠原蛋白保護作用。結(jié)果，原花青素組對豬胰彈性蛋白酶的抑制率達到86.6%，對人白細胞彈性蛋白酶的抑制率高達100%。而兒茶素對豬胰彈性蛋白酶抑制率僅為27.8%，對人白

14、細胞彈性蛋白酶無抑制作用。體內(nèi)研究結(jié)果表明，當將原花青素注入幼兔皮膚內(nèi)時，可束縛皮內(nèi)彈性纖維。將其相同量注入豬的皮內(nèi)，同樣抑制胰蛋白酶水解彈性蛋白，使皮內(nèi)周圍的彈性蛋白大量重建。同時證明，在炎癥過程中，原花青素可潛在抑制彈性蛋白酶對彈性蛋白的降解作用。原花青素對vc保護和再生的同時，對維持膠原質(zhì)的彈性和強度也起作用。相關(guān)報道同樣證明原花青素可改善皮膚皺紋和調(diào)節(jié)皮膚功能。deters a等在探討金縷梅皮原花青素對培養(yǎng)的人皮膚角質(zhì)細胞增殖和分化的影響研究中，得到金縷梅皮原花青素能明顯促進角質(zhì)細胞增殖，且無分化作用，促進皮膚角質(zhì)細胞新陳代謝，延緩皮膚衰老。在sls刺激皮膚的實驗中，原花青素可以減少透

15、皮水分損耗和紅斑的形成。此外，臨床研究表明原花青素能有效的改變刺激過程。另一方面，原花青素的抗氧化作用也是其抗衰老作用的基礎(chǔ)。原花青素具有良好的抗氧化功能，使其一定程度上延緩d-半乳糖所致小鼠衰老，使衰老模型小鼠血清、肝、腦組織中l(wèi)po水平均有不同程度的下降。血、肝中sod活性水平有不同程度的上升。腦脂褐質(zhì)水平下降。同樣給老齡大鼠每天連續(xù)灌胃200mg/kg.bw和400mg/kg.bw原花青素30d，結(jié)果200mg/kg.bw劑量組顯著降低老齡大鼠血清中mda和腦組織脂褐素含量(p0.05)，400mg/kg.bw劑量組提高老齡大鼠血清sod活性(p0.05)。原花青素也會降低正常小鼠血中m

16、da和升高血清sod活力，延長果蠅平均壽命。1.3美白作用歐洲人稱花青素為青春營養(yǎng)品，皮膚維生素，口服化妝品。因為它能恢復(fù)膠原蛋白活力，使皮膚平滑而有彈性。膠原蛋白是皮膚的基本成份，并且是一種使我們身體成為一個整體的膠狀物質(zhì)。維生素c是生化合成膠原蛋白必要的營養(yǎng)品。花青素使更多的維生素c生效，這意味著，維生素c可以更容易地去完成它所有功能（包括膠原蛋白產(chǎn)生）。花青素連接在膠原蛋白上，可以阻止那些破壞膠原蛋白的酶的危害。花青素不僅幫助膠原蛋白纖維形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，而且可以幫助恢復(fù)因受傷和自由基所引起的過度交聯(lián)的損害。過度交聯(lián)會使結(jié)締組織窒息和硬化，從而使皮膚起皺紋和過早老化?；ㄇ嗨剡€保護人體免受陽光

17、傷害，促進治愈牛皮癬和壽斑?；ㄇ嗨匾彩蔷植渴┯玫钠つw霜的極好添加劑。皮膚黑化、雀斑、褐斑和老年斑的出現(xiàn)，都與體內(nèi)酪氨酸酶活性增高密切相關(guān)。此酶在皮膚組織的黑色素細胞代謝中起催化作用，引起黑色素分泌的增加。因此降低酪氨酸酶的活性，從而減少色素細胞的代謝強度，以減少色素的生成。另一方面，在黑色素顆粒的成長中，即由體內(nèi)的酪氨酸在酪氨酸酶催化下轉(zhuǎn)化為多巴、多巴醌、多巴色素、吲哚、吲哚醌，最終轉(zhuǎn)變?yōu)榫酆象w的色素顆粒，一直是一個氧化過程，活性氧在其中表現(xiàn)出重要的作用。因原花青素作為氧自由基清除劑和抗氧化劑可清除活性氧和還原黑色素中間體，抑制黑色素的生成。日本學者keiji takagi和tohrmitsu

18、naga研究從木本植物karamatsu皮 ( larix sp.)， 阿拉伯樹膠 ( acacia mearnsii) 和 民間白堅木( schinopsis lorentzii)中提取的原花青素對酪氨酸酶有較強的抑制作用，并證明其抑制作用與原花青素a環(huán)5，7-二羥基結(jié)構(gòu)和b環(huán)3，4，5-三羥基結(jié)構(gòu)有關(guān)。日本yamaskosh研制了含有1%原花青素低聚體的可使皮膚亮潔的油性化妝品，它是基于原花青素可抑制酪氨酸酶的活性而研制成功。其機理尚不清楚，可能是與原花青素具有金屬絡(luò)合特性有關(guān)。茶單寧和葡萄單寧在100mg/ml濃度下即可完全抑制因蛋白質(zhì)氨基和核酸氨基發(fā)生的美拉德反應(yīng)，從而抑制了脂褐素、老

19、年斑的形成，起到美白的作用。1.4 收斂和保濕作用原花青素的收斂作用，可使粗大的毛孔收縮，汗腺膨脹，使松弛的皮膚收斂、繃緊、減少皺紋，從而讓皮膚顯現(xiàn)出細膩的外觀。日本學者小島弘之等報道，利用單寧酸（含原花青素）對油性發(fā)質(zhì)表現(xiàn)出良好的作用，其接觸皮膚后，可使汗腺口腫脹而堵塞汗液的滲透，抑制排汗，從而達到減少汗液分泌量。因此開發(fā)出含單寧的抑汗劑，調(diào)整型收斂液。原花青素的保濕作用基于原花青素具有多羥基結(jié)構(gòu)。在空氣中易吸濕是因為原花青素能與多糖（透明質(zhì)酸）、蛋白質(zhì)、脂類（磷脂）、多肽等復(fù)合的特性。利用原花青素此特性，開發(fā)出含有葡萄籽原花青素（0.01 v /v）奶液。日本開發(fā)出含有4%肉桂單寧的提高皮

20、膚濕度的化妝品，是基于原花青素的分子中含有親水性的酚羥基結(jié)構(gòu)這一特性。1.5免疫調(diào)節(jié)作用花青素不僅幫助減緩心血管發(fā)炎，且也幫助治療許多疾病，例如，過敏、氣喘、支氣管炎、花粉熱、類風濕動脈炎、運動受傷、壓力潰瘍等。人體發(fā)炎時要釋放出一種名叫組胺的化合物，它可誘發(fā)上述疾病的種種癥狀?；ㄇ嗨匾种飘a(chǎn)生組胺需要的酶，防止生成組胺，從而減輕發(fā)炎?；ㄇ嗨厥墙M胺的著名的抑制劑，但它并不阻礙其它的酶?，F(xiàn)在，我們身體過多地承受了來自食品、飲用水、空氣和動植物（如花粉）的化學物質(zhì)及污染物，其結(jié)果，過敏便成了非常普遍的疾病。有關(guān)花青素抗過敏和抗炎癥的能力，許多文獻都有記載。運動員很賞識花青素，因為花青素使關(guān)節(jié)靈活、可

21、以修復(fù)結(jié)締組織內(nèi)的膠原蛋白，以及減輕水腫。還有報道，花青素改善許多人的關(guān)節(jié)炎癥。原花青素對機體免疫功能調(diào)節(jié)作用也可以間接的對皮膚產(chǎn)生保護作用。liu等報道原花青素對老化小鼠(sam)免疫和造血功能不全有調(diào)節(jié)作用。使sam的t、b淋巴細胞功能均明顯提高，骨髓造血干細胞的增殖活性得到增強。原花青素對因甲醇或感染鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的小鼠免疫功能不全具有動態(tài)調(diào)節(jié)作用，能促進小鼠體內(nèi)il-2的產(chǎn)生，減少感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的小鼠細胞所產(chǎn)生il-6的數(shù)量，降低食用甲醇小鼠脾細胞所產(chǎn)生il-10的水平，同時還可增加自然殺傷細胞的細胞毒性。gerardo g m等探討兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚體b，對pma刺激t

22、細胞nf-b活性的影響。將t細胞預(yù)先用兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚體b處理，則可以減弱pma引起nf-b黏附活性增強和降低nf-b激活的il-2基因。表明，兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚體b能通過調(diào)節(jié)t細胞內(nèi)nf-b 來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。原花青素單體到十聚體對植物凝集素（pha）刺激外周血單核細胞（pbmc）的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白分泌均有不同程度影響。原花青素從五聚體到十聚體隨著聚合度的增加能顯著刺激il-1濃度增加（增加9倍），也使il-4濃度增加。另外，高聚合度的原花青素對pha誘導的基因表達也有影響，與pha對照組相比原花青素五到十聚體能使il-1表達增加7%19%，六到十聚體能抑制pha誘導的

23、il-4的轉(zhuǎn)錄，抑制率達71%86%。同時觀察pha刺激的單核細胞轉(zhuǎn)錄水平即il-1反應(yīng)的蛋白水平及有絲分裂原刺激il-4產(chǎn)生的蛋白水平，結(jié)果，低聚體對單核細胞中il-2轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響，而五聚體、六聚體和七聚體，能有效抑制il-2基因表達，抑制率達61%73%。mao t k等探討原花青素單體到十聚體對13名健康人外周血單核細胞轉(zhuǎn)移生長因子(tgf)-1的分泌調(diào)節(jié)作用。結(jié)果，原花青素單體和二聚體對外周血tgf-1低水平者能顯著性提高tgf-1水平，且單體和二聚體最佳，分別增加66%和68%；而三聚體到十聚體對外周血tgf-1高水平者能顯著性降低tgf-1水平，其抑制率達28%42%。葡萄籽原

24、花青素能激活正常人外周血th1細胞產(chǎn)生 ifn-（-干擾素），由rt-pcr證明原花青素能有效促進ifn-mrna的轉(zhuǎn)錄 ，得到原花青素能促進ifn-的合成和分泌來增強免疫功能。1.6 原花青素對皮膚保護作用研究展望清除自由基和抗氧化作用是原花青素生物活性中研究最早和較為深入的一部分。原花青素能有效清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、一氧化氮、過氧化氫等活性氧和活性氮，對各種原因引起的生物大分子損傷和脂質(zhì)過氧化均有抑制作用，并能調(diào)節(jié)或提高機體的抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成。這些作用都間接增強其對皮膚的保護作用。皮膚作為人體最大器官也有其固有的抗氧化酶系統(tǒng)，這種酶系統(tǒng)的平衡對于維持皮膚正

25、常功能及延緩皮膚衰老具有重要的意義。而原花青素對皮膚的保護作用中缺少對正常皮膚或損傷皮膚內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用研究，通過這方面的研究能直接表現(xiàn)出原花青素對正常皮膚和損傷皮膚是否有保護和恢復(fù)作用。隨著原花青素的深入研究和開發(fā)，用于原花青素生產(chǎn)的資源較單一，40多年來主要利用的資源是葡萄籽和皮。為了改變這種狀況，必須尋找可利用的新資源。本項目是在前人研究發(fā)現(xiàn)蓮，特別是其非可食部分蓮房中含有與人體健康和生命密切相關(guān)的重要天然活性物質(zhì)原花青素，含量高于目前國內(nèi)外研究和利用最多的葡萄籽和皮，有望成為原花青素利用的新資源的基礎(chǔ)上開展的！2 原花青素的應(yīng)用2.1 在藥物方面的應(yīng)用在法國，用葡萄籽原花青素制

26、成的專利產(chǎn)品用于治療微循環(huán)疾病，包括眼睛與外周毛細血管通透性疾病及靜脈與淋巴功能不全。法國sanofi公司用葡萄籽原花青素與大豆卵磷脂制成復(fù)合物，用作血管保護劑和抗炎劑，每年含復(fù)合物250mg。法國的vennat等還制成了含80%原花青素的高劑量片(50mg片)，改進了處方，使此片劑能迅速而完全釋放，而且在不同條件下，貯存10個月仍有很好穩(wěn)定性。此外，德國的brekhman等研制了用于治療酒精中毒的原花青素制劑并獲專利保護。在羅馬尼亞，一種商品名為endotelon的原花青素制劑已上市用于治療毛細血管疾病。2.1.1.心臟保護劑花青素不僅幫助恢復(fù)皮膚彈性，而且也幫助關(guān)節(jié)、動脈以及其它組織（如心

27、臟）維持正常功能。血管系統(tǒng)負責血液流動，把血液送到所有細胞和組織。因此，不管是從長期和短期效果來看，花青素都是至今發(fā)現(xiàn)的、最好的心臟保護劑。花青素也抑制組胺產(chǎn)生，因而可減輕炎癥，幫助動脈抗拒那些引發(fā)心血管病的誘變因素的沖擊。盡管法國人通常吃高脂肪食物遠多于美國人，但法國人死于心臟病的比例比美國人少很多，法國人以愛喝酒出名，通常是進餐必飲。法國飲君子患冠心病的人數(shù)也比不沾酒的人群低30%到40%，這是因為法國紅葡萄酒中含有花青素。2.1.2.視力保護者糖尿病性視網(wǎng)膜病是糖尿病的征兆，它是眼睛毛細血管微出血引起的，是成年盲人的常見病因。法國允許用花青素治療該病已經(jīng)很多年了。這一方法顯著減少了眼睛毛

28、細血管出血，改善了視力。花青素也已經(jīng)用來防止糖尿病患者白內(nèi)障手術(shù)后的并發(fā)癥。1998年，專家們選擇了許多沒有眼病眼傷的人做試驗，考察花青素是否可以緩解夜盲癥。參加者分成兩組，一組是晚上開車的司機，一組是整天和電腦屏幕為伴的人。四個星期后，再檢查他們的耐盲能力，98%的試驗者有了改善。2.1.3 血液循環(huán)在歐洲，為了改善血液循環(huán)、治療糖尿病性視網(wǎng)膜病、減輕水腫和抑制靜脈曲張等，花青素己用于臨床治療幾十年。花青素可以強化毛細血管、動脈與靜脈血管，因此，它有消腫化淤的功效。毛細血管的阻力減少和滲透性改善，使細胞更容易吸收養(yǎng)分與排除廢物。輸送養(yǎng)分與運出廢物這是血液循環(huán)系統(tǒng)的功能。心臟負責抽壓血液；動脈

29、與靜脈血管輸送血液；而負責運送營養(yǎng)給細胞，又運出廢物的是毛細血管?；ㄇ嗨乜梢郧宄毎ぶ兴苄院椭苄缘淖杂苫?，因此，抑制了釋放某些酶去傷害毛細血管壁的過程。2.1.4 維生素c的增效劑維生素c又叫抗壞血酸，維生素c和它的輔助因子是產(chǎn)生細胞內(nèi)部材料必需的成份，這些材料支持結(jié)締組織，形成像膠結(jié)劑那樣的物質(zhì)，用于修理骨骼、毛細血管、軟骨和牙質(zhì)。缺乏維生素c會造成身體虛弱、不易治愈的折傷、結(jié)締組織不堅固、血管壁脆弱與多孔，最后能引起毛細血管破裂和出血。假如人體缺少維生素c長達三個月，就會患所謂的壞血病。壞血病患者有如下病癥：體質(zhì)虛弱、牙床軟化而出血、掉牙、皮膚生瘡、關(guān)節(jié)腫痛、皮下出血等。研究表明，缺

30、少維生素c的人是很普遍的。許多人都有早期壞血病的診兆。長期缺少維生素c，人體會受到嚴重摧殘。現(xiàn)在人們懂得了，僅僅補充抗壞血酸，不是糾正維生素c缺乏癥的答案。人們還需要補充花青素，使維生素c發(fā)揮最大效益。大多數(shù)動物能自身產(chǎn)生維生素c，但是，人類一定要依靠食物才能獲得確保健康所需的維生素c。對于長期漂泊海上而缺少新鮮水果和蔬菜的水手們來說，壞血病曾經(jīng)是一種令人恐懼的流行病。早在十九世紀初期，英國水手就發(fā)現(xiàn)，吃檸檬可防止壞血病。在masquelier發(fā)現(xiàn)花青素之前，動物實驗表明：天然來源的抗壞血酸防止壞血病的能力比較高，而純化了的或合成的抗壞血酸活性比較低。這吸引了許多科學家和醫(yī)生去尋找維生素c的輔

31、助因子。他還指出，聰明人每次服用花青素的時候，也要服用維生素c，因為花青素是維生素c的增效劑。2.2 在食品方面的應(yīng)用原花青素作為天然強力自由基清除劑倍受青睞，國外，已廣泛用于延緩衰老、調(diào)節(jié)血壓血脂、抗腫瘤、健腦等保健食品中。原花青素作為具有極強抗氧化性的天然功能性成分，在歐美被廣泛加入到各種普通食品如蛋糕、奶酪中，既作為營養(yǎng)強化劑，又作為天然防腐劑來替代合成防腐劑(如苯甲酸等)，符合人們回歸自然的要求，提高了食品的安全性。2.3 在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用原花青素的多羥基結(jié)構(gòu)使它具有特殊抗氧活性和清除自由基的能力，已成為科學家關(guān)注的熱點，也為其在化妝品領(lǐng)域開辟了廣闊前景。原花青素具有獨特的化學和生理

32、活性，在護膚品中起到多重作用，如抗衰老、抗紫外線、抗輻射、增白、保濕等，對多種因素造成的皮膚老化都有獨特的功效。低聚原花青可減少皺紋，增加皮膚彈性。一方面，它可促進膠原蛋白形成適度的交聯(lián)，維護膠原的生合成；另一方面，它作為一種有效的自由基清除劑，可預(yù)防“過度交聯(lián)”這種反常生理狀況的發(fā)生，從而阻止了皮膚皺紋和囊泡的出現(xiàn)，保持皮膚的柔順光滑。opc清除自由基，阻斷硬彈性蛋白酶的產(chǎn)生并抑制其活性，因而根本上改善皮膚的健康狀況。改善皮膚的健康循環(huán)。從而避免或減少皺紋的產(chǎn)生。原花青素經(jīng)過多年的開發(fā)研究和臨床應(yīng)用，以其優(yōu)越的抗氧化活性為人們所青睞。其既可作為營養(yǎng)強化劑，又可作為防腐劑替代合成防腐劑(如苯甲

33、酸等)，符合人們回歸自然的要求.提高了其應(yīng)用的安全性。因此.我們應(yīng)充分利用我國植物資源，如葡萄、甘薯、山植、花生、銀杏、大黃、蓮房等，結(jié)合我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥技術(shù)，開發(fā)出適宜而又有功效的原花青素產(chǎn)品，使這一資源的開發(fā)和利用提高到一個新的階段。3 實驗的目的和意義 鑒于以上文獻綜述，關(guān)于原花青素具有多種生物活性，其中，抗氧化研究已有不少報道，故本論文以分離得到的蓮房，蓮子殼中活性因子原花青素（多酚）為試驗材料，以vc為對照做比較，通過還原力測定、抗氧化值測定、對羥基自由基的抑制作用、對超氧陰離子自由基的清除作用等一系列的試驗，初步探討lspc抗氧化作用機制，并與vc做對比。旨在為提高蓮房、蓮子殼中原花

34、青素的提取率，為提高蓮房，蓮子殼的利用率和應(yīng)用價值，包括在藥理方面、營養(yǎng)方面和人類生命方面等的產(chǎn)品的開發(fā)提供參考，為蓮資源開發(fā)應(yīng)用開辟新途徑。也為一些前沿科學研究提供一些理論基礎(chǔ)。4. 課題主要研究內(nèi)容根據(jù)本文的研究目的，將從以下四部分研究。第一部分 前言、目的和意義第二部分 微波輔助提取原花青素的工藝第三部分 蓮房（及蓮子殼）原花青素的抗氧化能力的研究第四部分 結(jié)論第 二 章 微波輔助提取原花青素的工藝引言直接使用試劑浸泡原材料來提取蓮中的原花青素的得率不高，且所需的時間比較長，所以在工業(yè)化中用這種方法提取原花青素的經(jīng)濟價值不高。因此迫切需要改進提取原花青素的方法，經(jīng)過科研工作者的不斷努力、

35、實驗，終于探究出了利用改變外界條件的方法來輔助提取原花青素的方法。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，通過微波輔助、超聲波輔助以及改變提取溫度等方法可以提高原花青素的得率。本實驗就是通過微波輔助的方法來提取原花青素，通過控制改變微波的輸出功率、微波作用時間，原材料與試劑的料液比及萃取次數(shù)等條件來探究微波富足后提取的具體效果，旨在找出一個最佳的工藝條件，并利用原花青素的初提液進行抗氧化試驗，以此來探究原花青素的抗氧化能力、清除自由基的能力，通過證明其具有抗氧化能力來說明原花青素在抗衰老、護膚等方面是有功效的。因此為藥理學、生命科學研究等方面提供一點理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。1 材料與方法1.1 試劑與儀器1.1.1 試劑沒

36、食子酸生物試劑中國藥品生物檢定所兒茶素生物試劑中國藥品生物檢定所乙醇分析純江蘇省宜興市興洋企業(yè)濃鹽酸分析純溫州天盛電化有限公司香草醛分析純青島裕達精細化工有限公司甲醇分析純江蘇省宜興市興洋企業(yè)nahco3分析純上海四星醫(yī)藥科技工貿(mào)公司folin-clocalteau 分析純sigma公司兒茶素，沒食子酸分析純sigma公司蓮房，蓮子殼，分析純sigma公司1.1.2 器材與儀器722分光光度計上海精密科學儀器有限公司微波爐lg電子（天津）電器有限公司恒溫烘箱101a3s 上海意豐電爐有限公司電子天平上海精密科學儀器有限公司大小燒杯、錐形瓶若干、不同規(guī)格的離心管、滴管、移液管、玻璃棒、移液槍等。

37、1.2實驗方法蓮房的預(yù)處理：將蓮房篩選除去雜質(zhì)后粉碎過60目篩，用正己烷脫脂后待用。1.2.1 總酚含量的測定folin-clocalteau法。配制試劑：稀釋十倍的folin-clocalteau原液試劑及15%的碳酸鈉溶液。標準曲線的繪制：精確稱取沒食子酸1.0mg用水溶解并定容到10ml得0.1mg/ml的對照品標準溶液，精確吸取對照樣品溶液0.20ml、0.25ml、0.30ml、0.35ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml于10ml容量瓶中，再加入1ml folin-clocalteau試劑，搖勻后再加入2ml 15%碳酸鈉溶液，定容到10ml，室溫下反應(yīng)2小時后測定a76

38、0，繪制標準曲線。提取液中總多酚含量的測定：移取待測提取液0.5ml于10ml容量瓶中，依次假如1.0ml folin-clocalteau（稀釋后）顯色劑及2ml 15%碳酸鈉溶液并定容，反應(yīng)2h后測定（a760）吸光度值,根據(jù)標準曲線計算多酚的沒食子酸當量，并計算提取得率。1.2.2 原花青素含量的測定香草醛-濃鹽酸法.配制試劑：40.0g/l的香草醛-甲醇溶液。精確稱取2.0g香草醛（香蘭素）固體溶解到50ml甲醇中，混勻待用。標準曲線的繪制：精密稱取兒茶素（對照品）5.0mg用去離子水定容到25.0ml，得1.0mg/ml的兒茶素標準溶液。用移液管移取兒茶素標準溶液1.0ml、1.5m

39、l、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml,用去離子水定容到10ml得不同濃度的對比溶液。依次移取1.0ml的對比溶液到對應(yīng)的容量瓶中，再依次加入3.0ml香草醛-甲醇，1.5ml濃鹽酸，混合均勻后在水浴鍋中20反應(yīng)15分鐘。以3.0ml香草醛-甲醇、1.5ml濃鹽酸、0.5ml甲醇的混合液作為空白對照，在500nm處測吸光度值，得到標準曲線的回歸方程。1.2.3單因素實驗1.2.3.1 溶劑選擇精密稱取4份1.00g的蓮房粉放入100ml的燒杯中，微波功率一定，料液比一定，微波作用一定時間，以提取綠為衡量標準，考察不同溶劑70%的丙酮、70%的乙醇、70%的甲醇和水（加入

40、亞硫酸氫鈉1%）對總多酚和原花青素提取效果的影響，確定一種作為后續(xù)溶劑。1.2.3.2 溶劑濃度的選擇精密稱取7份1.00g的蓮房粉放入錐形瓶中，加入一定濃度，一定料液比的溶劑，微波功率一定，萃取時間一定，考察不同濃度溶劑（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、）對提取效果的影響然后進行多酚和原花青素提取綠的影響。1.2.3.3 微波作用時間的影響精密稱取7份1.00g的蓮房粉放入錐形瓶中，以選定溶劑為提取劑，微波功率一定(80%輸出功率)，料液比一定，微波作用一定時間后一提取綠為衡量指標，考察了微波作用時間（30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s、100s）

41、對總酚和原花青素提取效果的影響。1.2.3.4 微波萃取功率的影響精密稱取5份1.00g的蓮房粉放入100ml的燒杯中，以選定溶劑為提取劑，一定料液比，微波作用50s后，以提取綠為衡量指標，考察了微波功率（20%、40%、60%、80%、100%）對總酚和原花青素提取效果的影響。1.2.3.5 料液比的影響 精密稱取5份1.00g的蓮房粉放入錐形瓶中，以選定溶劑為提取劑，微波功率為中火（80%功率）微波作用時間90s后，以提取率為衡量指標考察了料液比（1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35（m/v）對總酚和原花青素提取效果的影響。 1.2.3.6 萃取次數(shù)的影響 精密稱取4

42、份1.00g的蓮房粉放入錐形瓶中，以選定溶劑為提取劑，料液比為一定，微波功率為中火（80%功率），微波處理90s,以提取率為指標，考察了提取次數(shù)（1、2、3、4次）對總酚和原花青素提取效果的影響。1.2.3.7 ph值對萃取得率的影響 精密稱取6份1.00g的蓮房粉，置于250ml三角瓶中，加入適量的選定溶劑，用5mol/l鹽酸來調(diào)節(jié)ph分別為2、3、4、5、6、7，于室溫下浸提，以提取率為衡量指標，對總酚和原花青素提取效果的影響。1.2.3.8 正交實驗精確稱取蓮房粉9份，每份1 g，置于三角瓶中，按l9(34)正交表設(shè)計實驗浸提條件，提取過濾、離心合并濾液，于真空條件下濃縮回收酒精，濃縮樣

43、品，定容，測定蓮房多酚和原花青素的含量。水平因素溶劑容度a萃取功率b萃取時間c料液比d1111122222333332結(jié)果與分析2.1標準曲線：圖-1 總酚標準曲線fig-1 total phenol standard curvey（總酚）=0.1997x+0.0012 r2 = 0.9973圖-2 原花青素含量標準曲線fig-2 proanthocyanidins content standard curvey（ 原花青素）= 0.0996x + 0.0009 r2 = 0.9959r值都在0.99以上，滿足線性回歸。得回歸方程為y=ax+b(其中y為沒食子酸的含量mg，x為吸光度值)2.2

44、單因素實驗2.2.1 溶劑選擇 圖-3 溶劑選擇fig-3 solvent choice如（圖-3）所示，在所有實驗中，用丙酮作為萃取劑的組不論是原花青素得率還是總酚得率，其數(shù)值都高于其他溶劑，因此與之相比丙酮是比較理想的萃取劑。2.2.2 溶劑濃度選擇 圖-4 溶劑濃度選擇fig-4 solvent concentration choice如（圖-4）所示，用不同濃度的丙酮作為萃取劑，原花青素和總酚的得率都是在丙酮濃度在60%是達到最大值。2.2.3 微波作用時間的影響圖-5 微波作用時間的影響fig-5 microwave time of impact在其它條件相同的情況下，考慮微波作用時

45、間的不同對原花青素和總酚得率的影響，如（圖-5）所示，當微波作用時間定為90s時，其得率是最高的。2.2.4 微波萃取功率的影響圖-6 微波萃取功率的影響fig-6 microwave power extraction of impact 在其它條件不變的情況下考慮通過改變微波的輸出功率對原花青素和總酚的得率的影響。如（圖-6）所示，當把微波的輸出功率調(diào)整到80%（即560w）時，原花青素和總酚的得率達到最高值。2.2.5 料液比的影響圖-7 料液比的影響fig-7 feed ratio of impact 在微波輸出功率，微波作用時間都一定時，通過調(diào)整料液比來觀察其對原花青素和總酚得率的影響

46、。如（圖-7）所示當料液比為1：25時，兩者的得率都在同條件下達到最高。2.2.6 萃取次數(shù)的影響圖-8 萃取次數(shù)的影響fig-8 extraction number of impact 如（圖-8）所示，當萃取次數(shù)達到3次以后，原花青素和總酚的得率都趨于平行，表明再做多余的萃取次數(shù)已經(jīng)沒有必要了。2.2.7 ph值的影響圖-9 ph值的影響fig-9 ph value of impact通過調(diào)整溶劑的ph值來觀察其對兩者的得率的影響，如（圖-9）所示ph值對總酚的影響不大，而且當ph值調(diào)整為5時，兩者的得率都是最高的。2.2.8正交實驗通過以上單因素實驗，以溶劑濃度、微波輸出功率、微波作用時

47、間和料液比為四個考察因素，做四因素三水平（l9(34)）的正交實驗，如（表-1）、（表-2）表-1 原花青素正交實驗表tabie-1 proanthocyanidins orthogonal table試管號因素原花青素得率丙酮濃度微波功率微波作用時間料液比（%）111113.242 212224.229 313335.552 421233.659 522314.891 623124.658 731324.680 832134.963 933213.034 k113.023 11.581 12.863 11.167 k213.208 14.083 待添加的隱藏文字內(nèi)容110.922 13.56

48、8 4.323 k312.677 13.245 15.123 14.173 k14.341 3.860 4.288 3.722 k24.403 4.694 3.641 4.523 k34.226 4.415 5.041 4.724 表-2 總酚正交實驗表table-2 total phenol orthogonal table試管號因素總酚得率丙酮濃度微波功率微波作用時間料液 比（mg/g)111117.616 2122210.438 3133312.568 4212312.484 522317.862 623129.602 7313210.317 8321312.497 933217.268

49、 k130.621 30.417 29.714 22.746 k229.948 30.797 30.190 30.357 10.072 k330.081 29.437 30.747 37.548 k110.207 10.139 9.905 7.582 k29.983 10.266 10.063 10.119 k310.027 9.812 10.249 12.516 2.2.9 重復(fù)實驗圖-10 重復(fù)實驗fig-10 repeat experiments經(jīng)過正交試驗確定最佳的微波輔助提取原花青素的條件是，控制微波作用時間為90s，微波的輸出功率為80%（即560w），并且配制丙酮濃度為60%，料

50、液比為1：25（1g:25ml），通過重復(fù)實驗驗證，利用最佳的實驗條件進行的實驗的原花青素和總酚的得率是所有單因素實驗中最高的。2.3 水提原花青素的單因素實驗2.3.1 微波作用時間的影響圖-11 微波作用時間的影響fig-11 microwave time of impact在對單因素-時間進行試驗時，如圖-11所示，微波作用時間定為90s時原花青素和總酚的得率都達到其它條件相同下的最高值。2.3.2 微波萃取功率的影響 圖-12 微波輸出功率的影響fig-12 microwave power extraction of impact 如圖-12所示，當微波輸出功率為80%（即560w）時

51、，原花青素和總酚的得率在同條件下達到最高。2.3.3 料液比的影響 圖-13 料液比的影響fig-13 feed ratio of impact如圖-17所示，當料液比為1：25時，原花青素的得率達到最高值。而當料液比為1：30時總酚的得率達到最高值。2.3.4 萃取次數(shù)的影響 圖-14 萃取次數(shù)的影響fig-14 extraction number of impact 如圖-14所示當萃取次數(shù)達到3次之后，原花青素和總酚的得率已經(jīng)相當?shù)土?，所以?jīng)過3次萃取后就沒有必要在進行萃取了。2.3.5 正交試驗表-3 水提原花青素正交試驗表table-3 proanthocyanidins ortho

52、gonal table試管號因素原花青素得率微波功率微波時間料液比（mg/g)11115.002 21227.083 31337.733 42127.737 52237.478 62316.814 73138.167 83216.595 93328.446 k119.818 20.906 18.410 k222.029 21.156 23.267 7.228 k323.208 22.993 23.377 k16.606 6.969 6.137 k27.343 7.052 7.756 k37.736 7.664 7.792 運用表-1、表-2的方法，以微波輸出功率、微波作用時間和料液比三個因素作

53、為考察因素作三因素三水平正交表，如表-3。2.4紫外掃描 為了觀察用丙酮作為萃取劑來萃取原花青素和總酚在得到原花青素初提液時是否同時破壞了原花青素的結(jié)構(gòu)，因此將丙酮-蓮房、丙酮-斂資殼的初提液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再用60%的丙酮溶解，在196nm900nm范圍內(nèi)做全波長紫外掃描，并與標準品進行對比。如（圖913） 圖-15丙酮-蓮房紫外掃描fig-15 acetone-lian the uv scanning圖-16 丙酮-蓮子殼紫外掃描fig-16 acetone-seed shells uv scanning 圖-17 丙酮-葡萄標準品紫外掃描fig-17 acetone-grape stand

54、ard uv scanning 圖-18 微波-蓮房紫外掃描fig-18 microwave-lian the uv scanning圖-19 微波-蓮子殼紫外掃描fig-19 microwave-seed shells uv scanning 通過對圖-1519的比較，發(fā)現(xiàn)其吸收峰的位子基本上相同，這說明微波并沒有破壞原花青素的結(jié)構(gòu)，雖然在280nm處沒有明顯的吸收峰，但這可能是丙酮將其它的雜質(zhì)也帶了出來。圖-20 亞硫酸氫鈉-蓮房紫外掃描fig-20 sodium bisulfite-the uv scanning lotus圖-21 亞硫酸氫鈉-蓮子殼紫外掃描fig-21 sodium

55、bisulfite- seed shells uv-shell 用1%亞硫酸氫鈉溶液提取原花青素的初提液在196nm900nm范圍內(nèi)作全波長紫外掃描如圖-20、21，可以看出再280nm附近有吸收峰，這與一些相關(guān)報道是相符合的。3.討論通過作原花青素的標準曲線，進行一系列單因素試驗，以及通過正交實驗進行選擇最佳的實驗條件，并用重復(fù)試驗來驗證通過正交實驗選出的最佳方案的穩(wěn)定性和可靠性。通過以上試驗可以證明利用微波輔助提取原花青素是可取的，而且經(jīng)過微波處理后的蓮房和蓮子殼中的原花青素被提取出的含量也是相當?shù)母撸ㄅc單純的浸泡相比）。但是利用微波處理后原花青素的結(jié)構(gòu)是否被破壞呢？通過做196nm900nm全波長紫外掃描，判定丙酮沒有破壞原花青素的結(jié)構(gòu)，而通過對用1%