如何分離葉綠體和測定葉綠體的活力

1、如何分離葉綠體和測定葉綠體的活力？葉綠體活力的測定生物學實驗?zāi)芰紪说闹饕问绞遣僮骺荚嚭图埞P測試。在紙筆測 試中，以真實的實驗情境為素材考査實驗?zāi)芰?，是高中生物學學業(yè) 成就測量的有效途徑，試題具有一的思維能力。試題的來源有學 生實驗、教材演示實驗、教材經(jīng)典實驗等，另外，也有相當一部分 試題是來自于大學教材的學生實驗。高校教材的學生實驗科學性強、操作規(guī)范，是良好的試題素材。2019年6月學考的一道非選擇題，選用了 “利用希爾反應(yīng)測運葉 綠體活性”的實驗素材，考査了對實驗方案的理解能力，特別是對 實驗原理的理解和對實驗變量的控制。涉及的主要知識條目是光合 作用過程和滲透作用。試題：（2019年6

2、月浙江學考題）希爾反應(yīng)是測泄葉緑體活力的常用方法。希爾反應(yīng)基本原理：光照下，葉緑體釋放02，同時氧化型DCIP（2, 6 二氯酚靛酚）被還原，顏色由藍色變成無色。DC1P顏色變化引起的吸光率變化可反映葉綠體活力。研究小組利用渡菜葉進行了葉緑體活力的測定實驗?；卮鹣铝袉栴}:（1）制備葉綠體懸液：選取lOg新鮮的渡萊葉加入研缽，研熔前加入適量的0. 35mol/L NaCl溶液和pH7. 8的酸堿緩沖液等；研熔成勻漿后，用紗布過濾，取濾液進行,分離得到葉綠體：將葉緑體這于溶液中，以保證葉綠體的正常形態(tài)，獲得葉緑體懸液。（2）測;葉緑體活力：分組如下，井按下表加入試劑：測定各組吸光率。試看號敞擾沖施

3、（nU“IXIIXmlJ19.4Q-i0S2940.1S0539.90.1注：“一”表示不處理或不加入。希爾反應(yīng)模擬了光合作用中階段的部分變化，該階段在葉綠體的中進行。氧化型DCIP在希爾反應(yīng)中的作用，相當于在該階段中的作用。煮沸處理后，需向2號試管中加入一；量的 證齊試管中液體的量相等。3號試管的作用是參考答案:（1 ）離心0. 35raol/L的NaCl （或等滲）NADP蒸（2）光反應(yīng)類囊體膜測圧該濃度葉綠體懸液自身的吸光率作為對照解析:（1）制備葉緑體懸液時,先選取lOg新鮮的菠菜葉加入研缽，研磨前加入適量的0. 35 mol/LNaCl溶液（維持葉緑體形態(tài)）和pH 7. 8的酸堿緩沖

4、液（維持一定的pH）等：研磨成勻漿后，用紗布過濾，取濾液進行離心，分離得到葉綠體：將葉綠體置于0. 35 mol/L NaCl （或 等滲溶液中，以保證葉綠體的正常形態(tài)，獲得葉綠體懸液。（2）希爾反應(yīng)模擬了光合作用中光反應(yīng)階段的部分變化，該階段在葉綠體的類囊體膜中進行。氧化型DCIP （2, 6二氯酚靛酚）可被還 原，因此氧化型DCIP在希爾反應(yīng)中的作用，相當于NADP十在該光階段 中的作用。1和2號試管對照的不同是溫度處理后葉綠體的活性，其余均為無關(guān)變量。煮沸處理后，因蒸發(fā)部分水分，因此需向2號試管中補充一泄 量的蒸館水，以保證齊試管中液體的量相等。1和3號試管對照的不同是是否添加DCIP,

5、 3號試管沒有添加DCIP,作用是作為對照，測世該濃度葉綠體懸液自身的吸光率。實驗設(shè)備: 普通離心機（需帶有水平離心頭）或低溫離心機、電動搗碎器、照光 裝置、氧電極測氧裝置等。嚶驗步驟:1. 采摘新鮮菠菜或豌豆葉片渡菜要選擇嫩而厚，無顯著皺紋的葉片，最好在早晨摘取，以免日照后 在葉綠體內(nèi)積累淀粉，不利于完整葉綠體的分離。豌豆也要選擇嫩而厚 的葉片，摘取后應(yīng)盡快使用。葉片先在強光下照射1520min,用以 激活葉綠體，尤其用在完整葉緑體的以二氧化碳為底物放氧活性測；4 時，能使加縮短光合作用誘導期。為了防止強光照射下的溫度上升，可 把葉片鋪放在冰塊上，并在光源與葉片之間放隔水層。2. 葉綠體制備

6、葉片去除葉柄及中脈后，以每lOg葉片約加2030譏冰冷的提取 液。在電動搗碎器上高速搗碎，約2s/次，間隔搗碎34次，使葉片 碎成綠豆粒樣大小，然后經(jīng)4層紗布過濾，去除殘渣。注意過濾時不可用力擠壓，以免葉綠體被膜破碎。濾液以lOOOXg離 心，4C,將離心笛放入離心機后，使離心機的加速很快上升到預泄值，經(jīng)約30s后再很快使尖下降停止，整個離心程序大約用23min小心地倒出上淸液，先用少許提取介質(zhì)漂洗去沉淀表而的浮物，再加入 懸浮介質(zhì)：即把提取介質(zhì)中的MES緩沖液換成HEPES緩沖液（PH7.6）,懸浮葉綠體，在分散葉綠體沉淀時宜使用毛筆輕輕刷之，或者用手握住離心管，在冰塊之間攪動，使葉綠體由于

7、振動而分散開來, 不要用棉球吸濾，以防被膜壓破。葉綠體懸浮時要濃一些（含葉緑素2mg. ml以上），這樣有利于苴活性的保持。按照下而表格，取三支試管，分別進行不冋的操作。管號O.lMTris緩沖液葉綠體煮沸2.6二氯刪喙叮酚19.3ml0.2mlO.Sml293ml02mlSmin0.5ml39.8ml0.2ml將三支試皆中的溶液倒入對應(yīng)的比色杯中，以3號試管調(diào)零，620nm 處比色。然后將比色杯置于光源60cm處照光。每隔1分鐘快速讀下光密度的變化，連續(xù)進行5-6次讀數(shù)（如圖）O由于葉綠體是通過光反應(yīng)（希爾反應(yīng)）中產(chǎn)生的質(zhì)子還原DCIP,是原 來藍色的DCIP變?yōu)闊o色，并通過0D值的變化來反映。單位時間