畢業(yè)論文擬南芥突變體的鑒定

1、擬南芥突變體的鑒定摘要 在真核細(xì)胞的細(xì)胞核中， 基因組dna纏繞在組蛋白上，形成核小體的結(jié)構(gòu)。核心組蛋白的末端會(huì)發(fā)生一系列翻譯后水平上的共價(jià)修飾，主要包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化和adp核糖基化等。這些共價(jià)修飾在染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能及基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面起著重要的作用。組蛋白的甲基化發(fā)生在賴氨酸和精氨酸位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的甲基化參與異染色質(zhì)形成，x染色體失活和基因轉(zhuǎn)錄的激活與沉默等許多重要的生物學(xué)功能。早先認(rèn)為組蛋白上的甲基化是不可逆的。然而近年來(lái)在哺乳動(dòng)物和酵母中相繼發(fā)現(xiàn)了許多組蛋白去甲基化酶。其中最大的一個(gè)基因家族是包含有jmjc結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶家族。在植物中還沒(méi)有報(bào)道有組蛋白去甲基

2、化酶。我們通過(guò)基因組注釋以及序列比對(duì)從擬南芥中鑒定出21個(gè)編碼包含有jmjc結(jié)構(gòu)域蛋白的基因。并從salk突變體庫(kù)中篩選鑒定了相應(yīng)的t-dna插入突變體。利用分子標(biāo)記，我們篩選出了37個(gè)純合t-dna插入株系。給我們以后分析這些基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中所起的作用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞 組蛋白密碼, 甲基化，去甲基化，t-dna插入突變體 1 背景介紹1.1 “組蛋白密碼”理論與表觀遺傳學(xué)在真核細(xì)胞的細(xì)胞核中， 基因組dna與組蛋白和非組蛋白相互結(jié)合，構(gòu)成遺傳信息的物質(zhì)載體染色質(zhì)。染色質(zhì)由其基本單位核小體重復(fù)連接而成，每個(gè)核小體包含一個(gè)組蛋白八聚體（h2a/h2b-h3/h4-h3/h4-h2a/

3、h2b）和圍繞其上的兩圈超螺旋dna（146kb），核小體之間通過(guò)不同長(zhǎng)度的超螺旋dna和h1組蛋白前后相接。組蛋白八聚體的成員作為核小體的基本組成元件，在所有真核生物中高度保守。盡管核心組蛋白均具有一個(gè)三螺旋的結(jié)構(gòu)嚴(yán)整的組蛋白折疊區(qū)，其兩個(gè)末端卻沒(méi)有形成固定結(jié)構(gòu)。然而，這些末端卻會(huì)發(fā)生一系列翻譯后水平上的共價(jià)修飾，主要包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化和adp核糖基化等。這些共價(jià)修飾在染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能及基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面起著重要的作用（1，2）。針對(duì)在組蛋白中存在的廣泛修飾作用，allis及其同事在2000年提出 “組蛋白密碼”假說(shuō)（1）。該假說(shuō)認(rèn)為：組蛋白尾部的各種修飾是具有位點(diǎn)特異性的

4、；已有修飾可影響后繼修飾；各種修飾的綜合，作為“密碼”被其它蛋白或蛋白復(fù)合體所識(shí)別，通過(guò)調(diào)節(jié)rna聚合酶ii及其它轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白分子接近dna模板，引起不同的下游反應(yīng)，影響著染色質(zhì)的不同功能，例如基因表達(dá)，dna復(fù)制和染色體分離。揭示組蛋白修飾的本質(zhì)及作用機(jī)制對(duì)于闡明真核細(xì)胞復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控具有非常重要的指導(dǎo)意義。1.2 組蛋白甲基化組蛋白甲基化是組蛋白上各種修飾中最復(fù)雜的一種。組蛋白上的甲基化已知可以發(fā)生在精氨酸和賴氨酸的氨基上。在組蛋白上有多個(gè)位點(diǎn)的精氨酸和賴氨酸上可以發(fā)生甲基化。如組蛋白h3上的第4，9，36和79位賴氨酸，第2，17，26位的精氨酸。組蛋白h4上的第3位精氨酸，第二十位

5、的賴氨酸。而且精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶可以催化加上一個(gè)或兩個(gè)甲基。賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶則可以在賴氨酸上加上一到三個(gè)甲基（3）。這些不同的組合使得組蛋白的甲基化有能力調(diào)控多種與染色質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)功能。比如組蛋白第9位的賴氨酸上的甲基化在異染色質(zhì)的形成，x染色體的失活，轉(zhuǎn)錄抑制以及指導(dǎo)dna的甲基化上起著重要的作用。又如組蛋白h4第二十位賴氨酸的甲基化參與染色質(zhì)凝集，異染色質(zhì)形成，轉(zhuǎn)錄抑制，dna損傷修復(fù)以及細(xì)胞周期等生物學(xué)過(guò)程。相反組蛋白h3第4位，第36位，第79位賴氨酸的甲基化則被認(rèn)為與基因的轉(zhuǎn)錄激活正相關(guān)（4，5）。在植物中組蛋白甲基化酶在基因沉默和植物的發(fā)育中起著重要的作用。如kyp/suvh4是d

6、na上一些cng和不對(duì)稱的c上的甲基化所必需的（6），atx1是花器官正常分化所必需的（7），efs/sdg8則是抑制植物過(guò)早開(kāi)花所必需的（2，9）。1.3 組蛋白去甲基化甲基通過(guò)穩(wěn)定的碳氮鍵與氨基共價(jià)相連。而且早先對(duì)組蛋白上的甲基的修飾半衰期的研究認(rèn)為甲基的半衰期與組蛋白的半衰期相近。因此很久以來(lái)組蛋白的甲基化被認(rèn)為是不可逆的（10）。最近的研究發(fā)現(xiàn)。單甲基化的精氨酸可以被padi4/pad4脫去氨甲基從而形成瓜氨酸，這是最早的報(bào)道能脫去甲基化的組蛋白上的甲基的酶。然而padi4/pad4不能對(duì)雙甲基化的精氨酸起作用，而且脫去甲基的產(chǎn)物并不是原來(lái)的精氨酸而成了瓜氨酸，所以該酶仍然不是真正的去

7、甲基化酶（11，12）。lsd1的發(fā)現(xiàn)打開(kāi)了對(duì)組蛋白去甲基化研究的大門(mén)。lsd1可以通過(guò)氧化反映去處組蛋白h3第4位和第9位單或雙甲基化的賴氨酸上的甲基（13，14）。然而lsd1只是很小的一個(gè)基因家族，與已知的甲基轉(zhuǎn)移酶的數(shù)量相比是很少的。同時(shí)yi zhang實(shí)驗(yàn)室通過(guò)生物化學(xué)手段跟蹤去甲基化酶的活性發(fā)現(xiàn)了含有jmjc結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶，并且證明是jmjc結(jié)構(gòu)域是去甲基化的催化中心，隨后對(duì)jmjc結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)的研究使人們確信了這一點(diǎn)（15，16）。隨后對(duì)哺乳動(dòng)物和酵母中包含jmjc結(jié)構(gòu)域的蛋白的研究又鑒定了一大批的組蛋白去甲基化酶。這些發(fā)現(xiàn)使得我們對(duì)于組蛋白上甲基的動(dòng)態(tài)平衡有了更深

8、刻的理解（16）。1.4 擬南芥中組蛋白去甲基化酶然而在植物中對(duì)組蛋白的去甲基化酶仍然沒(méi)有任何認(rèn)識(shí)。更不知道組蛋白去甲基化酶在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境的響應(yīng)中起什么樣的作用。在擬南芥中，我們通過(guò)基因組的注釋以及序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)了21個(gè)基因編碼含有jmjc結(jié)構(gòu)域的蛋白。在這21個(gè)基因中有兩個(gè)基因ref6和elf6有報(bào)道表明參與到植物開(kāi)花時(shí)間的決定中。雖然這兩個(gè)基因從編碼的蛋白質(zhì)序列上來(lái)說(shuō)非常接近。然而遺傳學(xué)的分析表明這兩個(gè)基因參與了不同的開(kāi)花時(shí)間決定的通路中（17）。不過(guò)沒(méi)有報(bào)道證明ref6和elf6具有組蛋白去甲基化酶的活性。對(duì)于其他19個(gè)包含有jmjc結(jié)構(gòu)域的功能仍然是一無(wú)所知。我們期望通過(guò)對(duì)編碼

9、包含jmjc結(jié)構(gòu)域蛋白的基因的突變體的研究來(lái)闡述組蛋白去甲基化對(duì)維持甲基化的動(dòng)態(tài)平衡以及在植物生長(zhǎng)發(fā)育中所起的作用。2 材料和方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自salk庫(kù)的擬南芥atprmtst-dna插入突變雜合子種子。包括：salk_021260（a1）、salk-021253（a2）、salk-014109（b1）、salk-048786（b2）、salk-037361（b3）、salk-037362（b4）、salk-043417（b5）、salk-043403（b6）、salk-048777（b7）、salk-089978（b8）、salk-089985（b9）、salk-019427（c1）

10、、salk-068986（c2）、salk-024168（c3）、salk-014455（d1）、salk-135712（d2）salk-136058（d3）、salk-122006（e1）、salk-001018（e2）、salk-074694（e3）、salk-024613（f1）、salk-024612（f2）、salk-109924（l1）、salk-071534（g1）、salk-029755（g2）、salk-120904（g3）、salk-103092（h1）、salk-020986（h2）、salk-092672（h3）、salk-027723（h4）、salk-056556（

11、h5）、salk-044594（h6）、salk-061686（i1）、salk-036420（i2）、salk-000651（j1）、salk-004652（k1）、salk-049065（k2）、salk-023533（k3）、salk-006042（k4）、salk-035608（k5）、salk-049697（m1）、salk-052790（m2）、salk-073422（n1）、salk-025269（p1）、salk-041728（p2）、salk-041737（p3）、salk-029530（q1）、salk-093345（q2）、salk-003313（x2-3）注： (括號(hào))

12、內(nèi)為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)種子編號(hào)。為方便說(shuō)明，以下主要以括號(hào)內(nèi)編號(hào)為主。2.2 主要藥品試劑2.2.1 常用試劑與藥品氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、國(guó)產(chǎn)分析純瓊脂糖，上海yito公司。 2.2.2 試劑配制 2.2.2.1 arabidopsis thaliana營(yíng)養(yǎng)液 大量元素 25x 3l 單位：g nah2po42h2o12.72kno3225(nh4)2so410.05mgso47h2o37.5cacl28.496鐵鹽200x 1l單位：gna2-edta7.46feso47h2o5.56微量1000x 1l 單位：mg namoo42h2o250cuso45h2o25cocl26h2o25ki750h

13、3bo33,000mnso4h2o10,000znso47h2o2,0002.2.2.2 ctab溶液配方：2 x ctab200ml 2l2%ctab4.0g40g100mm tris(ph8.0)20ml*1medta200ml*1medta20mm edta16ul*0.25moledta80ul*0.5moledta1.4m nacl16.4g164g2%pvp404.0g40g使用前加入2%的-巰基乙醇，20ul/10ml。注：ctab(十六烷基三甲基溴化銨)是一種陽(yáng)離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中，ctab可與蛋白質(zhì)和大多數(shù)酸性多

14、聚糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，但不能沉淀核酸。因此，ctab可以用于從大量產(chǎn)生粘多糖的有機(jī)體中制備純化dna.2.2.2.3 pcr 10xbuffer 配方：a.500mmol/l kcl, b.100mmol/l tris-cl(ph8.3)，c.15mmol/lmgcl2 在1.05kg/cm2高壓下蒸汽滅菌10min。分裝后貯存在-20。c。2.2.2.4 電泳緩沖液50xtae儲(chǔ)存液/l配方： a.242g tris堿，b.57.1ml冰醋酸，c.100ml0.5mol，d.ledta(ph8.0)，e.ddh2o，用時(shí)稀釋50倍用2.2.2.5 溴化乙錠貯存液：在100ml水中加入1

15、g溴化乙錠，溶解后于4棕色瓶?jī)?nèi)保存。2.2.2.6 6凝膠加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，40%(w/v)蔗糖水溶液，4保存。2.2.2.7 10mm dntp, 從-80度冷柜中取出10mm dgtp, dctp, datp&dttp, 各10ul加入60ul ddh2o混勻，配得100ul 10mm dntp,，保存于-20度，減少反復(fù)凍融。2.3 主要儀器設(shè)備電泳儀：dyy6c電泳儀，dyy7b電泳儀,北京六一儀器廠超凈工作臺(tái)：北京昌平長(zhǎng)城空氣凈化工程公司制造-80超低溫冰箱：heto ultra freeze制冰機(jī)：日本sanyo公司超純水儀：elga高速冷凍離心機(jī)：eppendorf

16、centrifuge 5417r凝膠成像系統(tǒng)：kodak,edas290,transilluminnator 2020d,coldspring.高壓滅菌鍋：江明濱江醫(yī)療設(shè)備廠，手提式壓力蒸汽消毒器，yx-280型37恒溫水浴儀：北京通達(dá)科技有限公司pcr儀：eppendorf2.4 實(shí)驗(yàn)方法及原理2.4.1 植物材料準(zhǔn)備 2.4.1.1 配制營(yíng)養(yǎng)液，160ml大量元素+ 20ml鐵鹽+ 4ml微量元素+水=12升營(yíng)養(yǎng)液 2.4.1.2 往小盆里倒入蛭石，營(yíng)養(yǎng)液浸潤(rùn)使其濕潤(rùn)，輕壓實(shí)。 2.4.1.3 將種子倒于ep管中，用移液器逐粒種于土中，每碗5顆 2.4.2 總dna提取方法（ctab法）2

17、.4.2.1 取2-3片葉片置于含液氮的研缽中，用研棒研磨。研磨的過(guò)程中加入適當(dāng)?shù)囊旱３值蜏亍?2.4.2.2 加入700ul的ctab溶液(0.2%bme), 融化后轉(zhuǎn)入ep管中。 2.4.2.3 65。c煮0.5小時(shí)（使核蛋白復(fù)合物完全解體） 2.4.2.4 離心5-10min,13000rpm 2.4.2.5 取上清加入等體積氯仿，顛倒混勻2-3min（去蛋白等雜質(zhì)） 2.4.2.6 離心5min,12000rpm 2.4.2.7 轉(zhuǎn)移上層無(wú)色水相加入等體積異丙醇，顛倒混勻2-3min，20。c 沉淀30min2.4.2.8 棄上清，75%乙醇洗滌沉淀一遍2.4.2.9 充分干燥后，加

18、100ul的純水溶解沉淀，-20保存。2.4.3 pcr篩選2.4.3.1 pcr技術(shù)的基本原理類(lèi)似于dna的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。pcr由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：變性：模板dna經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板dna雙鏈或經(jīng)pcr擴(kuò)增形成的雙鏈dna解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；退火(復(fù)性)：模板dna經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降低，由于模板dna 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞，引物與模板dna單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；延伸：dna模板-引物結(jié)合物在taqdna聚合酶的作用

19、下，以dntp為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板dna 鏈?；パa(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。pcr反應(yīng)受到很多因素的影響，如ph值、各種鹽離子的濃度等，在這些影響因素都是最適條件的情況下，即使模板和引物的條件稍差，也可擴(kuò)增出近乎完美的產(chǎn)物。在做pcr實(shí)驗(yàn)之前，最好先對(duì)實(shí)驗(yàn)做優(yōu)化設(shè)計(jì)，然后再對(duì)每一個(gè)影響因素一一進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，以確定每一個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是如何影響的。一般情況下，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)要做各個(gè)因子的正交組

20、合，通過(guò)這樣的大量的組合試驗(yàn)，來(lái)確定一個(gè)相對(duì)來(lái)說(shuō)最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，只有這樣，試驗(yàn)結(jié)果才有很大程度的重復(fù)性。2.4.3.2 pcr反應(yīng)體系和流程圖 20ul體系3 primers2 primers10xbuffer 2ul2ul10umdntp0.4ul0.4ulh2o14.2ul14.6ule.taq1ul1ulprimer10.4ul0.4ulprimer20.4ul0.4ulprimer30.4ul 無(wú)模板dna1.2ul1.2ul 表2-2 pcr 反應(yīng)體系 圖2-2 pcr反應(yīng)流程圖 2.4.4 pcr產(chǎn)物的檢測(cè) pcr產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增 ，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與

21、鑒定，才能得出正確的結(jié)論。pcr產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法。pcr產(chǎn)物電泳，eb溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。pcr產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致，特別是多重pcr，應(yīng)用多對(duì)引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)計(jì)的大小。2.4.5 t-dna單拷貝插入突變體野生型基因組t-dna單拷貝插入突變體篩選示意圖：badc 圖2-1 t-dna單拷貝突變體篩選示意圖a, b,c分別表示了野生型基因組，t-dna單拷貝插入雜合子和t-dna單拷貝插入純合子的情況。綠色部分表示可以被插入的gene，藍(lán)色部分表示插入的t-dna，a，b代表基因組上與引物結(jié)合的位點(diǎn)，i代表t

22、-dna上與引物結(jié)合的位點(diǎn)，為了解釋的方便，我們用a,b,i用來(lái)代表與a，b，i位點(diǎn)結(jié)合的引物。每組兩條帶表示同源染色體上的一對(duì)等位基因。a圖表示野生型基因組，無(wú)t-dna插入。當(dāng)反應(yīng)體系中同時(shí)加入三種引物a,b,i時(shí), 引物a,b與基因組上a，b位點(diǎn)結(jié)合，擴(kuò)出1kb左右的特異性片段。當(dāng)反應(yīng)體系中加入兩兩組合的引物時(shí)，只有同時(shí)含有a,b引物的體系才能擴(kuò)出野生型片斷。b圖表示t-dna單拷貝插入雜合子，一條同源染色體上gene無(wú)t-dna插入，可在同時(shí)含有a,b引物的體系中擴(kuò)出900bp左右的片段; 另一條同源染色體上gene有t-dna插入，此時(shí)a，b間距相對(duì)延長(zhǎng)，超過(guò)1kb，而根據(jù)反應(yīng)流程，

23、72度延伸一分鐘只能擴(kuò)出1kb以下的片段，這時(shí)，即使a，b位點(diǎn)結(jié)合引物，但由于二者距離過(guò)遠(yuǎn)，沒(méi)有辦法擴(kuò)出插有t-dna的gene全長(zhǎng)。同時(shí)，i位點(diǎn)結(jié)合引物i, 與a或b位點(diǎn)搭配，可擴(kuò)出相對(duì)較小的片段。因此，在含有三種引物的反應(yīng)體系中，雜合子的一對(duì)等位基因可擴(kuò)出大小兩個(gè)片段；而在含有兩兩組合的引物的不同反應(yīng)體系中，雜合子將在含a,b引物的體系中擴(kuò)出和野生型大小相同的片斷，在含有a,i或 b,i引物的體系中擴(kuò)出一條小于野生型的片斷。c圖表示t-dna單拷貝插入純合子。與雜合子同理。在含有三種引物的反應(yīng)體系中，雜合子的一對(duì)等位基因可擴(kuò)出一條小于野生型的片斷；而在含有兩兩組合的引物的不同反應(yīng)體系中，只

24、在含有a,i或 b,i引物的體系中擴(kuò)出一條小于野生型的片斷。因此，當(dāng)反應(yīng)體系中同時(shí)加入三種引物時(shí)，我們根據(jù)擴(kuò)出片斷大小可以反映有無(wú)t-dna插入。而當(dāng)反應(yīng)體系中加入兩兩組合的引物時(shí)，我們根據(jù)擴(kuò)出片段的引物組合可以反映t-dna插入的方向和基因組的類(lèi)型（雜合或純合）。1， d圖是通過(guò)含有三種引物的反應(yīng)體系pcr產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定植株類(lèi)型的示意圖，3 結(jié)果與討論我們從salk突變體庫(kù)中拿到了所有21個(gè)基因的37個(gè)t-dna插入突變，即t-dna 插入到基因的中間的株系。利用分子標(biāo)記，尋找純合的t-dna插入株系。然后通過(guò)分子生物學(xué)的手段檢測(cè)t-dna的插入是否破壞了基因的正常表達(dá)。基因名稱t-

25、dna插入突變體編號(hào)引物（lp rp）at1g09060salk-021260 a1cx1816 /cx1817 salk-021253a2cx1816/cx1817at1g63490salk-014109b1cx1818 /cx1819salk-048786b2cx1820 /cx1821salk-037361b3cx1820/cx1821salk-037362b4cx1820 /cx1821salk-043417b5cx1824 /cx1825salk-043403b6cx1825/cx1826salk-048777b7cx1820/cx1821salk-089978b8cx2301/cx

26、2302salk-089985b9cx2301/cx2302at4g21430salk-019427c1cx1827 /cx1828salk-068986c2cx1829/cx1830salk-024168c3cx1829 /cx1830at4g20400salk-014455d1cx1831/cx1832salk-135712d2cx1833 /cx1834salk-136058d3cx2303/cx2304at3g48430salk-122006e1cx1835 /cx1836salk-001018e2cx1837/cx1838salk-074694e3cx1803 /cx1839sail

27、-747-a07cs876460e4cx2305/cx2306at5g63080salk-024613f1cx1840/cx1841salk-024612f2cx1840 /cx1841at5g63080salk-109924l1cx1840 /cx1841at5g19840salk-071534g1cx1846/ cx1847salk-029755g2cx1846/ cx1848salk-120904g3cx1846/cx1848at4g00990salk-103092h1cx1849/cx1850salk-020986h2cx1851/ cx1852salk-092672h3cx1851/

28、 cx1852salk-027724h4cx1853/ cx1854salk-056556h5cx1855/ cx1856salk-044594h6cx1855/ cx1856at1g119501salk-061686i1cx1857/cx1858salk-036420i2cx1859/cx1860at1g78280salk-000651j1cx1861/cx1862at3g07610salk-004652k1cx1863/ cx1864salk-049065k2cx1865/cx1866salk-023533k3cx1867/cx1868salk-006042k4cx1867/ cx1868

29、salk-035608k5cx1869/cx1870at1g62310salk-049697m1cx1871/ cx1872salk-052790m2cx1872/ cx1873at1g30810salk-073422n1cx1874/ cx1875at2g38950salk-025269p1cx1876/ cx1877salk-041728p2cx1878/cx1879salk-041737p3cx1878/cx1879wiscdslox376h12cs853364p4cx2313/cx2314at1g08620salk-029530q1cx1880/ cx1881salk-093345q2

30、cx1880/ cx1881at3g20810sail-811-h12r1cx1882/cx1883at2g34880gabi-257f10s1cx1884/cx1885sail-563-f10cs874918s2cx2311/cx2312at5g06550sail-680-g02cs829824t1cx2299/cx2300at5g04240sail-371-d08cs873586u2cx2309/cx2310at3g45880salk-003312x1cx1949/cx1950salk-003313x2cx1949/ cx1950 表1 來(lái)自salk庫(kù)的擬南芥atprmts t-dna插入

31、突變體 所用引物結(jié)合位點(diǎn)所在的位置序列cx0101lbb1gcgtggaccgcttgctgcaactcx0102lba1tggttcacgtagtgggccatcgcx1816 salk_021260 rp gacttacggtgcaagagatcgcx1817 salk_021260 lpgatccgaacctgcaatttttccx1818 salk_014109 rpgattgtgggtctctgaaacatgcx1819 salk_014109 lptgctacacacttgtattcacatcgcx1820 salk_048746 rp salk-037362 cctgagtctg

32、ttaccacctgccx1821 salk_048746 lp salk-037362tgagccttttctatcagccaccx1824 salk_043417 rptctcgggaattttgtcaacagcx1825 salk_043417 lptgatggtcttacaacaccatcccx1826salk-043403 lpttgagtgctctttcttgtggttccx1827 salk_019427 rp ccatgtcacaagtttcaaaacccx1828 salk_019427 lpacgcagttcctctgttctcagcx1829 salk_024168 rp

33、tcttgagggttattcattcattcacccx1830 salk_024168 lptaccattgcagcatttaaccgcx1831salk-014455 rptggattttcagactcaaacggcx1832salk-014455 lpttgaaatccttttctttttggttagcx1833 salk_135712 rp ttgacttgcttcaaaaccgagcx1834 salk_135712 lpaagactcagcatggtttccagcx1835 salk_122006 rp ttcatgaactaccaaagactaaaaatgcx1836 salk_

34、122006 lpacacaggtctctctgcactgaccx1837salk-001018 rpaggtttggatgtcacatcaggcx1838salk-001018 lptctgatgtctcaccctaagcccx1803 salk_074694 rp tacttccaatccaatgcgatgggtaatgttgaaattccgacx1839 salk_074694 lpacgtcaatgcggtaatcattccx1840 salk_024612 rp salk-109924cgttctcttctttgttgccaccx1841 salk_024612 lp salk-10

35、9924ctttggagaactccctgtgccx1846 salk_071534 rp salk-120904ctctcttgcccgatcacataccx1847salk-071534 lpcttaggacccagttctttcggcx1848 salk_120904 lpaagttcctggtgaatgcaatgcx1849salk-103092 rpgaagaggagaggtttcgaagccx1850salk-103092 lpcacttggaggctgagattcaccx1851salk_020986 rp salk-092672taatcaaagaaaggcaatgcgcx18

36、52salk-020986 lp sa atacgacagtgatctctgccgcx1853salk-020986 rpgattgttcttcgttagctgcccx1854salk-020986 lpgctggatctggctgaagaccx1855salk-056556 rp caatgaatgagcaaaatgtagatgcx1856salk-056556 lpaatatgcagaagccatgttgccx1857salk-061686 rpttgtaaacgacgtcgtaagcccx1858salk-061686 lptgcaaaagctaggagaagcagcx1859salk-

37、036420 rpaaccggtttcttcttctctggcx1860salk-036420 lptctttgtgatgggaaagaaaaagcx1861salk-000651 rpagacaaggaaagtcgtcctcccx1862salk-000651 lpacatggaaaccaaagcgaaagcx1863salk-004652 rptcgcaatcatattcgagttttccx1864salk-004652 lpctgtaaccaatgattctcgggcx1865salk-049065 rptttgttgggaattaatgcaggcx1866salk-049065 lpc

38、tgagcacgaagaagatggagcx1867salk-006042 rptccttaagtgatccatgctggcx1868salk-006042 lpaagacgctaaagctttccctgcx1869salk-035608 rpcgaaatcctgattgaacatcccx1870salk-035608 lpcgcgtcagatagaagttctggcx1871salk-049697 rp salk-052790 acgtggtgagtatcggtgaaccx1872salk-049697 lp salk-052790 aatcttctgcaaatggattggcx1873sa

39、lk-052790 lpatggattctggagttaaattggagcx1874salk-073422 rpcttccaaggttttaggcattgcx1875salk-073422 lpgaataataaatgcccccaaaaccx1876salk-025269 rptccatcttctgcaggaagttgcx1877salk-025269 lpgcttcctcaaggactttggtccx1878salk-041737 rptataccctccacgctcaattgcx1879salk-041737 lpgaaggatgaggttttgggttccx1880salk-029530

40、 rp salk-041737aggcgacatatgaacgaacaccx1881salk-029530 lp salk-041737ttttggcgttagaagcttctgcx1882sail-811-h12 rptgttggtctcctctgaagctccx1883sail-811-h12 lptgggcaagataagtaggctcccx1884gabi-257f10 rpttgttctccaacttcctcgtccx1885gabi-257f10 lpttaaggccaaaatcttgatgccx1949salk-003313 rpccgagctttctaccatgactgcx19

41、50salk-003313 lptattcgacggttgcgttagaccx2299sail-680-g02cs829824 rp tctttgcttggtgtatttgcccx2300sa il-680-g02cs829824 lpctccagcaaacttgaatttcgcx2301salk-089978 rp salk-089985cagcttcagcccatatctttg cx1860salk-036420 lptctttgtgatgggaaagaaaaagcx1861salk-000651 rpagacaaggaaagtcgtcctcccx1862salk-000651 lpaca

42、tggaaaccaaagcgaaagcx1863salk-004652 rptcgcaatcatattcgagttttccx1864salk-004652 lpctgtaaccaatgattctcgggcx1865salk-049065 rptttgttgggaattaatgcaggcx1866salk-049065 lpctgagcacgaagaagatggagcx1867salk-006042 rptccttaagtgatccatgctggcx1868salk-006042 lpaagacgctaaagctttccctgcx1869salk-035608 rpcgaaatcctgattga

43、acatcccx1870salk-035608 lpcgcgtcagatagaagttctggcx1871salk-049697 rp sacgtggtgagtatcggtgaaccx1872salk-049697 lp aatcttctgcaaatggattggcx1873salk-052790 lpatggattctggagttaaattggagcx1874salk-073422 rpcttccaaggttttaggcattgcx1875salk-073422 lpgaataataaatgcccccaaaaccx1876salk-025269 rptccatcttctgcaggaagttg

44、cx1877salk-025269 lpgcttcctcaaggactttggtccx1878salk-041737 rptataccctccacgctcaattgcx1879salk-041737 lpgaaggatgaggttttgggttccx1880salk-029530 rp saggcgacatatgaacgaacaccx1881salk-029530 lp ttttggcgttagaagcttctgcx1882sail-811-h12 rptgttggtctcctctgaagctccx1883sail-811-h12 lptgggcaagataagtaggctcccx1884ga

45、bi-257f10 rpttgttctccaacttcctcgtccx1885gabi-257f10 lpttaaggccaaaatcttgatgccx1949salk-003313 rpccgagctttctaccatgactgcx1950salk-003313 lptattcgacggttgcgttagaccx2299sail-680-g02cs829824 rp tctttgcttggtgtatttgcccx2300sa il-680-g02cs829824 lpctccagcaaacttgaatttcgcx2301salk-089978 rp scagcttcagcccatatcttt

46、g在salk庫(kù)中拿到的種子是t-dna插入雜和子的部分子代，如果不考慮致死突變的話，其中應(yīng)同時(shí)含有野生型，t-dna插入雜和子和t-dna插入純合子。基因名稱t-dna插入突變體純合編號(hào)雜合編號(hào)at1g09060salk-021260 a1-3at1g63490salk-014109b1-2salk-048786b2-1 -3salk-037362b4-2salk-043417b5-1，-2salk-089978b8-3，-5at4g21430salk-019427c1-3-5salk-024168c3-2at4g20400salk-135712d2-1，-3salk-136058d3-1，-

47、2，-4，-5，-6at3g48430salk-122006e1-1，6，7，8salk-074694e3-2sail-747-a07cs876460e4-2at5g63080salk-024612f2-3at5g63080salk-109924l1-1at5g19840salk-071534g1-3,5salk-029755g2-2,4salk-120904g3-1,2,3,4at4g00990salk-020986h2-1,3salk-092672h3-7salk-027724h4-1,5salk-056556h5-3salk-044594h6-4at1g119501salk-061686

48、i1-3-4at1g78280salk-000651j1-2,4 j1-4-2,8at3g07610salk-004652k1-1salk-049065k2-1-1salk-023533k3-6雜，k3-6-1,6salk-006042k4-1,3,4salk-035608k5-1,4at1g62310salk-049697m1-2,4,z2,z4salk-052790m2-1,2,3,4at1g30810salk-073422n1-2at2g38950salk-025269p1-2,4,5wiscdslox376h12cs853364p4-1at1g08620salk-029530q1-4s

49、alk-093345q2-5-6,8at3g20810sail-811-h12r1-3,4at2g34880gabi-257f10s1-4,6,8,10,11,16, 17,21,29at5g06550sail-680-g02cs829824t1-4,5,6,7at5g04240sail-371-d08cs873586u2-4at3g45880salk-003313x2-3,4,a3,a6,a8表3 純合突變體和雜合突變體注：表中未列出的為同野生型一樣的經(jīng)過(guò)四個(gè)月的篩選，我們以數(shù)百棵植株為材料，雖然部分株系中出現(xiàn)了丟失的情況，總的來(lái)說(shuō)，我們已經(jīng)篩選到了從atprmt2-atprmt8的所有21

50、個(gè)基因的37個(gè)t-dna插入突變純合子，以下我們將篩選的結(jié)果總結(jié)后，發(fā)現(xiàn)atprmts的t-dna突變體可分為兩大類(lèi)：t-dna單拷貝插入和t-dna反向重復(fù)插入。以下對(duì)它們分別舉例說(shuō)明：例1 salk_037362（b4）結(jié)果與分析（單拷貝插入突變純合子）：每個(gè)反應(yīng)體系中加入三種引物。cx0101,cx1820,cx1821.其中cx1820和cx1821可與基因組上的不同位點(diǎn)結(jié)合，cx0101可與插入的t-dna上的引物結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。如圖所示 b4-1 b4-2 b4-3 b4-4 b4-5 col h2o圖 salk_037362（b4）單拷貝插入突變純合子注： col代表以野生型為模板

51、進(jìn)行pcr的產(chǎn)物，作為正對(duì)照，應(yīng)擴(kuò)出1kb左右的野生型條帶，下同。h2o代表以純水為摸班進(jìn)行pcr的產(chǎn)物，作為負(fù)對(duì)照，應(yīng)無(wú)條帶擴(kuò)出，下同。分析：從此圖可以看出b4-5擴(kuò)出一條與野生型相同大小的帶，根據(jù)以上論述，可確定它為野生型。而b4-2擴(kuò)出一條小于野生型的帶，推測(cè)它含有t-dna插入，對(duì)b4-1、b4-3、b4-4擴(kuò)出兩條帶來(lái)，可推測(cè)它們?yōu)殡s合突變體對(duì)b4-2進(jìn)一步用兩個(gè)引物一組做pcr。每個(gè)體系中加入兩種引物。如圖所示：b4-2colh2ob4-2colh2ob4-2colh2o無(wú)markercx1820+cx1821 cx1820+cx0101 cx1821+cx0101 圖 salk_037362(b4)t-dna插入突