酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法PPT課件

1、酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法 測定血清中甲胎蛋白含量測定血清中甲胎蛋白含量 Your company slogan LOGOLOGO一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?1 掌握酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（掌握酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISAELISA）的原理）的原理 2 熟悉酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的操作方法熟悉酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的操作方法 Your company slogan LOGOLOGO二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 Your company slogan LOGOLOGO Your company slogan LOGOLOGOELISAELISA的三條基本原理的三條基本原理 Your company

2、 slogan LOGOLOGO雙抗體夾心法雙抗體夾心法 Your company slogan LOGOLOGO雙抗體夾心法圖示雙抗體夾心法圖示 雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原 + +- - E E E E E E E EE E E E E EE EE E Your company slogan LOGOLOGO 三、實(shí)驗(yàn)儀器三、實(shí)驗(yàn)儀器&試劑試劑 v儀器 全自動酶標(biāo)儀、全自動酶標(biāo)洗板機(jī) Your company slogan LOGOLOGO Your company slogan LOGOLOGO四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 獲得獲得AFPAFP未標(biāo)定抗體未標(biāo)定抗體 將將AFPAFP抗

3、體與固相抗體與固相 載體連接形成固相抗體載體連接形成固相抗體 洗滌除去未結(jié)合的洗滌除去未結(jié)合的 抗體及雜質(zhì)抗體及雜質(zhì) 加入封閉蛋白溶液以封閉載體加入封閉蛋白溶液以封閉載體 表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn)表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn) 洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白 加血清形成加血清形成 固相抗體抗原復(fù)合物固相抗體抗原復(fù)合物 Your company slogan LOGOLOGO 洗滌除去其他洗滌除去其他 未結(jié)合的物質(zhì)未結(jié)合的物質(zhì) 加加HRPHRP酶標(biāo)抗體生成酶標(biāo)抗體生成 抗體抗體待測抗原待測抗原酶標(biāo)記抗體酶標(biāo)記抗體 的復(fù)合物的復(fù)合物 徹底洗滌未結(jié)合徹底洗滌未結(jié)合 的的HRPHRP酶標(biāo)抗

4、體酶標(biāo)抗體 加底物四甲基聯(lián)苯胺加底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB(TMB) 進(jìn)行酶催化反應(yīng)進(jìn)行酶催化反應(yīng) 根據(jù)顏色反應(yīng)的程度根據(jù)顏色反應(yīng)的程度 進(jìn)行進(jìn)行AFPAFP的定量測定的定量測定 Your company slogan LOGOLOGO詳細(xì)步驟詳細(xì)步驟 1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10 孔，在第一、第 二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100l，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50l ，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100l 分別加到第三孔和第四孔， 再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50l，混勻；然后在第三孔和第四 孔中先各取50l 棄掉，再各取50l 分別加到第五、第六孔中，再在第

5、 五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六中各 取50l 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀 釋液50，混勻后從第七、第八孔中分別取50l 加到第九、第十孔中， 再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50l，混勻后從第九第十孔中各取 50l 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50l，濃度分別為（1800ng/L ， 1200ng/L，600ng/L，300ng/L， 150ng/L）。 Your company slogan LOGOLOGO 2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作 相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先

6、加樣品稀釋液40l ，然后再加待測樣品10l（樣品最終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶 標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。 3. 溫育：用封板膜封板后置37溫育30 分鐘。 4. 配液：將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用 5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50l，空白孔除外。 7. 溫育：操作同3。 8. 洗滌：操作同5。 9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50l，再加入顯色劑B50l，輕輕震蕩混勻 ，37避光顯色15 分鐘. 10. 終止：每孔加終止液50l，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色

7、立轉(zhuǎn)黃色）。 11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止 液后15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。 Your company slogan LOGOLOGO辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(HRP)(HRP) 常用底物：常用底物： (1)(1)鄰苯二胺鄰苯二胺(OPD)(OPD)：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性。：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性。 (2)(2)四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(TMB)：TMBTMB是一種脂溶性較強(qiáng)的基團(tuán)，是一種脂溶性較強(qiáng)的基團(tuán)， 由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRPHRP活性活

8、性 部位產(chǎn)生粗大的、深藍(lán)色沉淀物反應(yīng)后呈藍(lán)色。酶反應(yīng)用部位產(chǎn)生粗大的、深藍(lán)色沉淀物反應(yīng)后呈藍(lán)色。酶反應(yīng)用 HCLHCL或或H2SO4H2SO4終止后，終止后，TMBTMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，最適吸收波產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，最適吸收波 長為長為 450nm450nm。 Your company slogan LOGOLOGO五、結(jié)果分析五、結(jié)果分析 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙 上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相 應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值 代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為

9、樣品的實(shí)際濃度。 Your company slogan LOGOLOGO六、思考題六、思考題 （一）固相載體 （二）抗原 （三）試驗(yàn)樣品 （四）結(jié)合物 (五）洗滌劑與稀釋劑 （六）底物 （七）作用時間 (八)試驗(yàn)的重復(fù)性（精確度） （九）對使用儀器要求 Your company slogan LOGOLOGO六、應(yīng)用六、應(yīng)用 1.內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素 、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等 2.在血液學(xué)方面可用于檢查凝固因子（如第凝固因子）、紅細(xì) 胞抗原及結(jié)合球蛋白（Hapto Globin）等 1.在寄生蟲病方面，它用于對瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲 、血吸蟲、旋毛蟲