總RNA純化試劑盒說明-中文版

1、總RNA純化試劑盒產(chǎn)品說明書此款RNA純化試劑盒提供了一種從培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞、組織樣品、血液、細(xì)菌、酵母、真菌、植物和病毒中快速提取和純化總RNA的方法，。該試劑盒可以純化所有大小的RNA，從大的 mRNA和核糖體 RNA至川、RNA（ microRNA或miRNA ）和小干涉 RNA（ siRNA ）。 RNA優(yōu)先從蛋白等的細(xì)胞組分中純化出來，而不使用抑制的苯酚或者氯仿。純化的RNA是高度完整的，可以應(yīng)用到一系列的下游應(yīng)用試驗(yàn)中，包括實(shí)時(shí)PCR, Northern免疫印跡分析，RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)和引物延伸，以及表達(dá)芯片分析。純化技術(shù)純化的基礎(chǔ)是旋轉(zhuǎn)柱色譜法，用特有的樹脂作為分離介質(zhì)。RNA優(yōu)先

2、從其他細(xì)胞組分（如蛋白質(zhì)）中分離出來，而不使用苯酚或者氯仿。 純化步驟包括首先用合適的裂解液融解 細(xì)胞或組織，然后裂解液中加入乙醇后上樣到旋轉(zhuǎn)柱中。樹脂結(jié)合RNA是基于離子的濃度,所以只有RNA結(jié)合到柱子上而所有剩余的蛋白和其他的污染物會(huì)在流動(dòng)液中而被除去或者 仍在樹脂的頂部。然后結(jié)合的RNA用試劑盒提供的洗滌液洗滌以除去所有殘余的雜質(zhì)，然后純化的總 RNA用抽提緩沖液洗滌。純化的 RNA是高度完整的，可以用于一系列的下游 實(shí)驗(yàn)分析。說明試劑盒說明書柱子結(jié)合容量50 （Jg柱子最大上樣體積600此純化RNA大小所有大小，包括小 RNA （ 200nt）起始材料最大量動(dòng)物細(xì)胞3 X106個(gè)細(xì)胞動(dòng)

3、物組織10mg （對(duì)于大部分組織*）血液100讓細(xì)菌1 X109個(gè)細(xì)胞酵母1 X108個(gè)細(xì)胞真菌50mg植物組織50mg完成10次純化時(shí)間20 min平均收率HeLa細(xì)胞（1 X106個(gè)細(xì)胞）15 jgE.coli （1 X109 個(gè)細(xì)胞）50 jg優(yōu)點(diǎn)?使用旋轉(zhuǎn)柱提取，步驟快且簡(jiǎn)單?提取總 RNA，從大的核糖體 RNA（ rRNA）到?。≧NAmicroRNA 或者miRNA）?不需要苯酚或氯仿作提取液?從多種種類來源樣品中提取高質(zhì)量的總RNA?可以提取和檢測(cè)到的 RNA組織樣品可以小到單個(gè)動(dòng)物細(xì)胞試劑盒成分成分50 preps裂解液40 mL洗滌溶液22 mL抽提緩沖液6 mL微型旋轉(zhuǎn)柱5

4、0收集管50抽提管(1.7 mL)50產(chǎn)品說明書1儲(chǔ)存條件和產(chǎn)品穩(wěn)定性所有的溶液需在室溫密閉保存。所有的試劑在不開封條件下穩(wěn)定保存1年。預(yù)防措施和警告事項(xiàng)該試劑盒只為科研目的設(shè)計(jì)，不可用于人或者臨床。需要更多信要確保有合適的實(shí)驗(yàn)服，在操作化學(xué)試劑時(shí)一次性的手套和護(hù)目鏡會(huì)磨損。 息，請(qǐng)參考適合的材料安全表（MSDSs ）。當(dāng)操作全血樣品時(shí)，所有在使用國家所有人和動(dòng)物組織的問題是要考慮到潛在的感染。 的有關(guān)當(dāng)局建議的預(yù)防措施都要執(zhí)行。用戶自備試劑和設(shè)備你需要有以下所需材料才可以使用總RNA純化試劑盒 對(duì)于所有材料的實(shí)驗(yàn)步驟?臺(tái)式離心機(jī)? 95 - 100% 乙醇? 3-巰基乙醇 對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步

5、驟? PBS （無 RNase） 對(duì)于動(dòng)物組織的實(shí)驗(yàn)步驟?液氮?研缽和研杵? 70%乙醇對(duì)于鼻喉抹片樣品的實(shí)驗(yàn)步驟 ?無菌，一次性抹片 對(duì)于細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)步驟?含溶菌酶的TE緩沖液O對(duì)于革蘭氏陽性細(xì)菌，在 TE緩沖液中1mg/mL溶菌酶O對(duì)于革蘭氏陰性細(xì)菌，在 TE緩沖液中3mg/mL溶菌酶對(duì)于酵母的實(shí)驗(yàn)步驟?含有溶細(xì)胞酶的重懸浮緩沖液50mM Tris pH 7.510mM EDTA1M山梨糖醇1單位/讓溶細(xì)胞酶對(duì)于真菌的實(shí)驗(yàn)步驟?液氮?研缽和研杵? 70%乙醇 對(duì)于植物的實(shí)驗(yàn)步驟?液氮?研缽和研杵? 70%乙醇RNA的操作RNase是降解RNA的穩(wěn)定性和活性很強(qiáng)的酶。高壓滅菌的溶液和玻璃器皿總

6、是不能有效除去 這些酶。所以當(dāng)操作 RNA準(zhǔn)備工作的第一步就是有一個(gè)無RNase的環(huán)境。下面這些預(yù)防措施是推薦的針對(duì)這些酶最好的措施。?操作RNA的地方需遠(yuǎn)離微生物實(shí)驗(yàn)地方?干凈的、一次性的手套在拿放試劑、樣品、移液管、一次性離心管等時(shí)會(huì)損壞。因此建議 經(jīng)常更換手套以避免污染?需要有RNA專用的溶液、槍尖、實(shí)驗(yàn)服、移液管等用具?所有的RNA操作用到的溶液都應(yīng)用至少 0.05%DEPC處理的高壓滅菌水或者用分子生物學(xué) 指定的無RNase水配制?用商用的除RNase的溶液清理表面?當(dāng)使用提純的RNA樣品時(shí)，在用于下游實(shí)驗(yàn)過程中確保其在冰上放置流程圖用總RNA純化試劑盒純化RNA的實(shí)驗(yàn)步驟用裂解液：

7、宋隣細(xì)胞農(nóng)紐織Aa入乙醇JA結(jié)合到柱子上詐用洗滌液洗滌三次魯用抽提液抽提I小渦X 2純化的總RN4實(shí)驗(yàn)步驟所有的離心步驟都用臺(tái)式離心機(jī)完成。不同的步驟需要不同的轉(zhuǎn)速，所以請(qǐng)查看你的離心機(jī)的說明書以保證其能提供合適的轉(zhuǎn)速。所有的理性步驟都在室溫進(jìn)行。準(zhǔn)確的rpm轉(zhuǎn)速RCF可以用下面的公式計(jì)算：RPM = /.y (1.118 X 10 5) (r)這里 如卩=需要用重力加速度（相當(dāng)于地心引力，單位是g）； r=轉(zhuǎn)子的半徑，單位是cm;而RPM達(dá)到所需地心引力時(shí)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)部分1.不同細(xì)胞類型來源的裂解液的制備實(shí)驗(yàn)前須知根據(jù)起始材料的不同裂解液的制備步驟也不同（步驟1）.然而之后的步驟則在所有情況

8、中都相同（步驟2-6）。請(qǐng)確保在從起始材料開始就要按照正確的實(shí)驗(yàn)步驟制備裂解液。14,000 x g ( 14,000 RPM )轉(zhuǎn)速所有的離心步驟都在臺(tái)式離心機(jī)上，除有注釋的地方，都以 進(jìn)行。所有的離心步驟都在室溫離心。變速離心機(jī)可以發(fā)揮試劑盒的最大性能。如果沒有變速離心機(jī)，可以用固定轉(zhuǎn)速的離心機(jī)， 然而這樣會(huì)減少收率。實(shí)驗(yàn)前保證所有的溶液都在室溫放置 所有提供的酶在使用前都應(yīng)在各自的管上內(nèi)標(biāo)示的溫度下保存 配制洗滌溶液 使用液， 在提供的裝有洗滌液的瓶?jī)?nèi)加入 50 mL 95%的乙醇（用戶自備） 。 這樣總體積為72 mL。瓶子上的標(biāo)簽有一個(gè)方框可以用來檢查是否已加入乙醇?？蛇x： 對(duì)于大部

9、分的動(dòng)物細(xì)胞組織，尤其是那些已知含較高含量 RNase 的組織（如胰 腺），以及大部分的植物組織和鼻喉抹片樣品，強(qiáng)烈建議在裂解液中加入3-巰基乙醇。而且也建議想要分離用于高靈敏度的下游實(shí)驗(yàn)的 RNA 的用戶。 每1 mL 裂解液加入 10 卩L -巰基乙醇（用戶自備）。3巰基乙醇有毒性，請(qǐng)?jiān)谕L(fēng)櫥中操作。否則，使用試劑 盒提供的裂解液。為提取完整的病毒 RNA，如果起始材料是細(xì)胞培養(yǎng)物，按照部分1A，如果起始材料是組織，按照部分1B,如果起始材料是血液，按照部分1C,如果起始材料是鼻喉抹片樣品，按照1D。對(duì)于從無毒的病毒顆粒中提取RNA，按照部分11。操作過程中動(dòng)作要迅速很重要。1A. 培養(yǎng)的

10、動(dòng)物細(xì)胞裂解液的制備使用前須知一般來建議細(xì)胞最大的起始用量是3 X106個(gè)細(xì)胞?？梢杂醚蛴?jì)和顯微鏡對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。說，普通的3.5cm培養(yǎng)皿可以有106個(gè)HeLa細(xì)胞。收集的細(xì)胞沉淀塊可以再 -70 C 保存供以后使用，或者在實(shí)驗(yàn)中直接使用。在凍存前要 對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。凍存的細(xì)胞沉淀塊不能超過 2 星期以保證不破壞 RNA 的完整性。凍存的細(xì)胞沉淀塊在實(shí)驗(yàn)步驟開始前不能融解。驟 1A（ ii ） c）。1A（i）. 單層培養(yǎng)的細(xì)胞裂解液的制備 吸棄培養(yǎng)基，然后加入一定量的PBS 沖洗細(xì)胞層。吸棄培養(yǎng)皿中直接加入 350此裂解液。輕拍培養(yǎng)皿裂解細(xì)胞，然后緩沖液在培養(yǎng)皿表面旋轉(zhuǎn)晃動(dòng) 將裂解液轉(zhuǎn)移到離心管

11、內(nèi)。裂解液中加入 200讓95-100% 乙醇（用戶自備）a.b.c.d.e.在凍存的細(xì)胞塊中直接加入裂解液 （步。渦旋混勻PBS。5min。10 秒。進(jìn)行到 步驟 2。注意： 對(duì)于起始細(xì)胞量大于 106 個(gè)細(xì)胞的樣品， 器 5-10 次，以使在上樣到柱子前切斷基因組建議將裂解液通過裝有 25 號(hào)針頭的注射DNA。1A（ii）. 懸浮培養(yǎng)的和貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞裂解液的制備a.將培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移到無 RNase的離心管中（未提供），然后以最大不超過200旳（2000RPM ）b.的轉(zhuǎn)速離心10min沉淀細(xì)胞。 小心地除去上清。留下少許幾微升（讓）的培養(yǎng)基避免細(xì)胞沉淀被吸岀。C.細(xì)胞沉淀塊中加入 沉淀塊被

12、完全溶解。350此裂解液。渦旋震蕩15秒裂解細(xì)胞，在進(jìn)行下一步之前確保所有的d.裂解液中加入20095-100% 乙醇（用戶自備）。渦旋混勻10秒。進(jìn)行到步驟2。注意：對(duì)于起始細(xì)胞量大于106個(gè)細(xì)胞的樣品,器5-10次，以使在上樣到柱子前剪斷基因組建議將裂解液通過裝有25號(hào)針頭的注射DNA。1B.動(dòng)物組織裂解液的制備使用前須知RNA的試劑盒（大部分實(shí)驗(yàn)中最總RNA純化試劑盒是用于從小量的組織樣品中提取大量達(dá)到10mg ）。動(dòng)物組織中RNA在組織獲取后，剪碎和勻漿之前是不受保護(hù)的。因此重要的是操作的 步驟要盡量快，尤其是細(xì)胞裂解液制備的步驟。新鮮組織或者凍存的組織均可。組織應(yīng)迅速放入液氮中然后盡

13、快轉(zhuǎn)入-70 C冰箱，長(zhǎng)期保存。組織在-70 C中可以保持幾個(gè)月。在研磨勻漿之前不能使凍存的組織融解以保證 RNA的完整性。組織應(yīng)在RNA穩(wěn)定液中保存，如 RNA later?可以和提取步驟兼容。在提取步驟之前用鑷子 將組織小心從儲(chǔ)存液中取岀，瀝干多余的液體。組織類型不同，組織最大用量也不同，請(qǐng)參考以下的表格1以確定最大的組織用量。如果你的組織在表格中沒有包括，我們建議初始的用量不超過 10mg。表1.不同組織的推薦最大起始用量組織最大起始用量腦25mg心臟5mg腎10mg肝10mg肺10mg脾臟10mg1B.動(dòng)物組織細(xì)胞裂解液的制備a. 從動(dòng)物中分離組織樣品b. 稱量組織重量。請(qǐng)請(qǐng)參考以下的

14、表格1以確定不同組織的最大量。對(duì)于表格中沒有包括的組織樣品我們建議初始的量不超過10mg。C.將組織轉(zhuǎn)移至有適量液氮的研缽內(nèi)，液氮應(yīng)覆蓋過組織。用研杵充分充分研磨組織。d. 使研缽內(nèi)液氮蒸發(fā)而不使組織融解。e. 組織樣品中加入 400 uL裂解液后繼續(xù)研磨直至樣品均勻。將裂解液通過裝有 25號(hào)針頭的注射器 5-10次使之均勻。f. 用吸管將裂解液轉(zhuǎn)移至無核酸酶的離心管內(nèi)（離心管未提供）。g. 離心 2min 使細(xì)胞碎片沉淀。然后上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無核酸酶的離心管。記錄上清 液的體積。/裂解h. 收集的裂解液中等體積加入 70%的乙醇（每100 uL裂解液加入100 uL乙醇）。漩渦混勻。繼續(xù)進(jìn)行

15、步驟 21C. 血液裂解液的制備實(shí)驗(yàn)前須知 所有人和動(dòng)物組織的問題是要考慮到潛在的感染。 的有關(guān)當(dāng)局建議的預(yù)防措施都要執(zhí)行 建議血液的最大用量不能超過100 uL避免堵柱。我們建議試劑盒用于從非凝集的新鮮血液中提取RNA，用EDTA作為抗凝劑。當(dāng)操作全血樣品時(shí)， 所有在使用國家實(shí)驗(yàn)過程中操作要迅速。1C. 血液樣品裂解液的制備將100 未凝集的血液樣品轉(zhuǎn)移到無 RNase的離心管中（未提供）。a.b.c.血液中加入350卩裂解液。震蕩裂解細(xì)胞15秒。在進(jìn)行到下一步之前保證整個(gè)混合物都 變透明。裂解液中加入200譏95-100%乙醇（用戶自備）。震蕩混勻10秒。進(jìn)行到步驟2。1D. 鼻喉抹片樣品

16、裂解液的制備使用前須知所有人和動(dòng)物組織的體液都是有潛在的感染性。 有關(guān)當(dāng)局建議的預(yù)防措施都要執(zhí)行 實(shí)驗(yàn)過程中操作要迅速。當(dāng)操作這些樣品時(shí)， 所有在使用國家的1D. 鼻喉抹片樣品裂解液的制備將600 ul裂解液加入到無RNase的離心管中（未提供）。 用無菌，一次性的棉簽在鼻或喉等組織內(nèi)輕輕擦。用無菌的器具剪掉收集有鼻喉細(xì)胞的棉簽頭， 放入到加有裂解液的離心管中。 蓋上管蓋， 室溫輕輕震蕩孵育 5min 。用吸管將裂解液上清轉(zhuǎn)移到無RNase的離心管內(nèi)（未提供）。記錄裂解液的體積。a.b.c.d.收集的裂解液中等體積加入70%乙醇（每100譏裂解液加入100譏乙醇）。漩渦混勻。繼續(xù)進(jìn)行步驟21E

17、.細(xì)菌裂解液的制備使用前須知?按照表格2配制含溶菌酶的TE緩沖液。該溶液需用無菌的，無核酸酶的TE緩沖液配制，然后在冰上放置備用。使用者自己提供這些試劑。?在此步驟中建議最多用109個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。用分光光度計(jì)測(cè)量細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。一般大腸桿 菌0D600 1.0，濃度是 1 X 109 cells/mL O?對(duì)于RNA提取，應(yīng)該在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期收獲細(xì)菌。TE緩沖液直接加入凍存的細(xì)菌菌?細(xì)菌沉淀塊可在-70 保存以后使用，或者直接使用。 ? 凍存的細(xì)菌菌塊在開始操作之前不能融解。將含溶菌酶的 塊中（步驟1Ec）o1E.細(xì)菌細(xì)胞裂解液的制備a. 14,000 x g （14,000 RPM）離心 1min

18、 收集細(xì)菌。b. 吸棄上清，然后盡量小心移走剩余的培養(yǎng)基。1）O見表1時(shí)間室溫溫育。C.用100卩含溶菌酶的TE緩沖液漩渦震蕩重懸細(xì)菌（見表d. 加入300 裂解液，漩渦充分震蕩至少10秒。e. 加入200 UL95-100%的乙醇（用戶自備）到裂解液中。漩渦充分震蕩至少10秒。繼續(xù)進(jìn)行步驟2表2 :不同細(xì)菌類型的孵育時(shí)間細(xì)菌類型TE緩沖液中溶菌酶濃度孵育時(shí)間革蘭氏陽性細(xì)菌1 mg/mL5min革蘭氏陰性細(xì)菌3 mg/mL10mi n1F.酵母菌裂解液的制備使用前須知制備一定量的含溶細(xì)菌酶的重懸液，考慮到每次需要100 uL的溶液。重懸液需含有以下成分：50mM Tris pH 7.5 , 1

19、0mM EDTA , 1M 山梨糖醇，1%伕巰基乙醇，1單位/山 溶 細(xì)胞酶。溶液需要用無菌，無RNase試劑制備，然后在冰上放置直至使用。這些試劑需要用戶自己提供。該實(shí)驗(yàn)建議使用的酵母菌細(xì)胞不超過107個(gè)細(xì)胞或者1mL培養(yǎng)液。對(duì)于提取RNA，需要收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母細(xì)胞。酵母可以可在-70 C保存以后使用，或者直接使用。凍存的酵母菌菌塊在開始操作之前不能融解。將含溶細(xì)胞酶的重懸液直接加入凍存的細(xì)菌菌塊中（步驟IFc）。1F.細(xì)胞裂解液的制備a. 14,000 x g （14,000 RPM）離心1min收集酵母菌菌塊。b. 吸棄上清，然后盡量小心移走剩余的培養(yǎng)基。C.用100 含溶細(xì)胞酶的重

20、懸液完全重懸酵母細(xì)胞，漩渦震蕩重懸。37 C孵育10min。d. 加入300卩裂解液，漩渦充分震蕩至少10秒。e. 加入200譏95-100%的乙醇（用戶自備）到裂解液中。漩渦充分震蕩至少10秒。繼續(xù)進(jìn)行步驟21G真菌裂解液的制備使用前須知新鮮或者凍存的真菌菌塊均可使用。真菌樣品應(yīng)迅速放入液氮中然后盡快轉(zhuǎn)入-70 C冰箱，長(zhǎng)期保存。真菌樣品組織在-70 C中可以保持幾個(gè)月。在研磨勻漿之前不能使凍存的組織融解以保證 RNA 的完整性。該實(shí)驗(yàn)中建議真菌的用量不超過50mg，以避免堵柱。1G.真菌裂解液的制備50mg用研杵充分研磨真菌細(xì)胞。RNA 提取的步驟。a. 稱重決定真菌的量。建議該實(shí)驗(yàn)步驟中

21、真菌的用量不能超過b. 將真菌塊轉(zhuǎn)移到有一定量液氮的研缽中，液氮要覆蓋過組織。注意：該步驟研磨的真菌可以在 70 保存，以后再進(jìn)行c. 使研缽內(nèi)液氮蒸發(fā)而不使組織融解。d. 組織樣品中加入 600 uL裂解液后繼續(xù)研磨直至樣品均勻。e. 用吸管將裂解液轉(zhuǎn)移至無核酸酶的離心管內(nèi)（離心管未提供）f. 離心 2min 使細(xì)胞碎片沉淀。 然后上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無核酸酶的離心管。 記錄上清 /裂解液 的體積。g. 收集的裂解液中加入等體積的70%乙醇（用戶自備），（每100 uL裂解液中加入100譏乙醇）。震蕩充分混勻。 繼續(xù)進(jìn)行步驟 21H.植物細(xì)胞裂解液的制備使用前須知建議植物組織的樣品最大量是50m

22、g或者是5 X106個(gè)植物細(xì)胞。新鮮或者凍存的植物組織均可使用。植物樣品應(yīng)迅速放入液氮中然后盡快轉(zhuǎn)入-70 C 冰箱，長(zhǎng)期保存。 植物樣品在研磨勻漿之前不能使凍存的組織融解以保證 RNA 的完整性。實(shí)驗(yàn)操作動(dòng)作要迅速。1H.植物細(xì)胞裂解液的制備a.將小于等于50mg或者5 X106的植物樣品轉(zhuǎn)移到有一定量液氮的研缽中，液氮要覆蓋過組 織。用研杵充分研磨真菌細(xì)胞。注意：如果要保存凍存的組織， 在將組織轉(zhuǎn)移到液氮之前不能使組織融解。b. 使研缽內(nèi)液氮蒸發(fā)而不使組織融解。C.植物組織樣品中加入 600 uL裂解液后繼續(xù)研磨直至樣品均勻。d. 用吸管將裂解液轉(zhuǎn)移至無核酸酶的離心管內(nèi)（離心管未提供）。e

23、. 離心 2min 使細(xì)胞碎片沉淀。 然后上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無核酸酶的離心管。 記錄上清 /裂解液 的體積。f. 收集的裂解液中加入等體積的70%乙醇（用戶自備），（每100 uL裂解液中加入100 uL乙醇）。震蕩充分混勻。 繼續(xù)進(jìn)行步驟 21I.病毒裂解液的制備使用前須知為提取完整的病毒 RNA，如果起始材料是細(xì)胞培養(yǎng)物，按照部分1A，如果起始材料是組織，按照部分1B,如果起始材料是血液，按照部分1C,如果起始材料是鼻喉抹片樣品，按照 1D。建議使用最多不超過 100 uL的病毒顆粒懸液，以避免堵柱。 實(shí)驗(yàn)操作動(dòng)作要迅速。1L.病毒裂解液的制備a.將100 uL勺病毒顆粒懸液轉(zhuǎn)移至一個(gè)無核酸

24、酶的離心管中（未提供）b.樣品中加入350卩1裂解液，振蕩15秒裂解細(xì)胞。在進(jìn)行下一步之前保證整個(gè)混合液變?yōu)橥?明。C.裂解液中加入200 uL的95-100%乙醇（用戶自備），震蕩充分混勻10秒。繼續(xù)進(jìn)行步驟2RNA 的步驟都相同。部分2. 從各種裂解液的純化總 RNA注意： 對(duì)于這之前不同類型的裂解液制備，從該步驟開始剩下的純化總2. RNA 結(jié)合到柱子上a. 用提供的收集管裝柱b. 將最多600卩L裂解液和乙醇（來自步驟1）上柱，然后離心1min注意 : 確定所有的裂解液通過柱子進(jìn)入收集管。如果裂解液沒有完全通過，再離心甩 1min。C. 棄去流動(dòng)液。用另一收集管重新裝柱。d.根據(jù)你的裂

25、解液體積，重復(fù)步驟2b和2C?？蛇x步驟：總RNA純化試劑盒提取的總 RNA帶有少量的基因組 DNA污染。然而，可以選擇附 A中進(jìn)行柱上DNA處理步驟，以最大量地除去殘余的 DNA，它可能會(huì)影響下游靈敏的實(shí)驗(yàn)。在 該實(shí)驗(yàn)中，這一步驟必須在此步驟進(jìn)行。3. 柱子洗滌a. 將400卩含有DNase 1的洗滌溶液上柱，離心 1min。注意： 確定所用的洗滌溶液通過柱子進(jìn)入收集管內(nèi)。 如果整個(gè)洗滌液沒有完全通過， 再離 心 1min。b. 棄去流動(dòng)液，用另一收集管重新裝柱。c. 重復(fù)步驟3a和3b再次洗柱。d. 再用400 洗滌液 第三次洗柱，然后離心1min。e. 棄去流動(dòng)液，用另一收集管重新裝柱。f

26、. 離心甩柱 2min 使樹脂充分變干。拋棄收集管。4. RNA 抽提a. 將柱子放入試劑盒提供的1.7 mL抽提管中。b. 柱子加入50卩抽提液。c. 200 x g (2,000 RPM)離心 2min，然后再 14,000 x g(14,000 RPM)離心 1min。注意從柱子4b 和 4c）。中流出的抽提液，如果不足總體積50 uL柱子再次14,000 x g(14,000 RPM)離心1min。注意： 為得到 RNA 最大收率，建議用不同的離心管做第二次抽提(重復(fù)步驟5. RNA 保存純化的RNA樣品可以在-20C保持?jǐn)?shù)日。建議樣品在 70C保存更長(zhǎng)時(shí)間。附錄 A可選的柱上DNA去

27、除DNA步驟總RNA純化試劑盒提取的總 RNA帶有少量的基因組 DNA污染。然而，可以選擇附 A中 進(jìn)行柱上DNA處理步驟，以最大量地除去殘余的 DNA，它可能會(huì)影響下游靈敏的實(shí)驗(yàn)。在 該實(shí)驗(yàn)中，這一步驟必須在此步驟進(jìn)行。1.按照操作手冊(cè)的說明配制 0.25 K uL無RNase的DNase 1的溶液的應(yīng)用液。每處理一根柱子 要用掉100 溶液。或者，用反應(yīng)液溶解或稀釋 DNase 1儲(chǔ)液(40 mM Tris pH 7.0 , 10 mM MgCl 2和3 mM CaCl2，無RNase制備)制成最終濃度為 0.25 K卩1。2. 從起始材料開始到 結(jié)合到柱子(步驟1和2的所有步驟)上都要正

28、確按照總RNA提取的步驟操作。3. 柱子上加入400卩1洗滌液然后離心2min。棄去流動(dòng)液。用收集管裝柱。4. 然后100卩按照步驟1配制的無RNase的DNase 1上柱，14,000 x g (14,000 RPM)離心1 minute.注意：確定所有DNase 1混合液過柱。如果需要，再次14,000 x g (14,000 RPM)離心1min。5.在步驟5離心后，將收集管中流動(dòng)液用移液管轉(zhuǎn)移到柱子頂部。注意：一定要進(jìn)行步驟5以發(fā)揮DNase最大活性和得到 RNA最大收率，尤其是小RNA的收率、6. 柱子裝置在15-30 C孵育15min。7. 不需要再進(jìn)行離心，直接進(jìn)入到柱子“洗滌步驟”（步驟3）疑難指導(dǎo)問題可能原因細(xì)胞或組織裂解不完全堵柱使用了代替的抽提液洗滌液中沒有加入乙醇RNA收率低解決方法和解釋確保一定量的細(xì)胞或者組織用適量的裂 解液起始材料的用量不要用超過建議的用量。如果柱子在建議的水平下堵柱，應(yīng) 減少起始材料的量。也可以參見下面的“堵柱”問題建議使用試劑盒提供的抽提液以得到最 大的RNA收率在結(jié)合到柱子上之前保證加入了一定量 的乙