生物相關基因工程的基本操作方法

1、生物相關基因工程的基本操作方法 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 主要包括四個步驟：主要包括四個步驟： （1）目的基因的獲?。┠康幕虻墨@取 （2） （3）將目的基因導入受體細胞）將目的基因導入受體細胞 （4）目的基因的檢測與鑒定）目的基因的檢測與鑒定 基因表達載體的構建基因表達載體的構建 生物相關基因工程的基本操作方法 一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取 生物相關基因工程的基本操作方法 1.什么叫基因文庫？什么叫基因文庫？ 基因文庫基因文庫 基因組文庫基因組文庫 部分基因文庫部分基因文庫 （如（如cDNA文庫）文庫） 將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DN

2、A片斷，片斷， 導入到導入到中，各個受體菌分別含中，各個受體菌分別含 有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。 生物相關基因工程的基本操作方法 （1）基因組文庫的構建模式圖）基因組文庫的構建模式圖 通過對通過對 受體菌受體菌 的培養(yǎng)的培養(yǎng) 而儲存而儲存 基因基因 生物相關基因工程的基本操作方法 以目的基因轉錄成的信使以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，為模板， 再反轉錄酶的催化下反轉錄成互補的單鏈再反轉錄酶的催化下反轉錄成互補的單鏈 DNA，然后在，然后在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈聚合酶的作用下合成雙鏈 DNA，即，即cDNA，從而獲得所需的基因。，從而獲得所

3、需的基因。 （2 2）cDNAcDNA構建方法構建方法-反轉錄法反轉錄法 生物相關基因工程的基本操作方法 基因組基因組DNADNA文庫文庫 cDNAcDNA文庫文庫 （3 3）基因組）基因組DNADNA文庫與文庫與cDNAcDNA文庫的構建文庫的構建 生物相關基因工程的基本操作方法 補：原核細胞的基因結構補：原核細胞的基因結構 非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū) 編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結合位點聚合酶結合位點 啟動子啟動子終止子終止子 RNARNA聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，并與聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，并與 其結合。其結合

4、。 轉錄開始后，轉錄開始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移動，并以分子移動，并以 DNADNA分子的一條鏈為模板合成分子的一條鏈為模板合成RNARNA。 轉錄完畢后，轉錄完畢后，RNARNA鏈釋放出來，緊接著鏈釋放出來，緊接著RNARNA聚合酶聚合酶 也從也從DNADNA模板鏈上脫落下來。模板鏈上脫落下來。 生物相關基因工程的基本操作方法 啟動子啟動子：位于基因首端的一段特殊的：位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，片斷， 它是它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能聚合酶識別和結合的部位，有了它才能 驅動基因轉錄出驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質。，最終獲得蛋白質。

5、終止子：是位于基因尾端的一段特殊的終止子：是位于基因尾端的一段特殊的DNA 片斷，能終止片斷，能終止mRNA的轉錄。的轉錄。 生物相關基因工程的基本操作方法 不能轉錄為信使不能轉錄為信使RNARNA，不能，不能 編碼蛋白質。編碼蛋白質。 ：能轉錄相應的信使：能轉錄相應的信使RNARNA，能，能 編碼蛋白質編碼蛋白質 編編 碼碼 區(qū)區(qū) 非非 編編 碼碼 區(qū)區(qū) 原原 核核 細細 胞胞 的的 基基 因因 結結 構構 有調控遺傳信息表達的核有調控遺傳信息表達的核 苷酸序列，在該序列中，苷酸序列，在該序列中， 最重要的是位于編碼區(qū)上最重要的是位于編碼區(qū)上 游的游的RNARNA聚合酶結合位點。聚合酶結合位

6、點。 非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū) 編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 啟動子啟動子終止子終止子 生物相關基因工程的基本操作方法 補：真核細胞的基因結構補：真核細胞的基因結構 編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū) 與與RNARNA聚合酶聚合酶 結合位點結合位點 內含子內含子 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子 啟動子啟動子 終止子終止子 編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內含子：內含子： 外顯子：外顯子： 生物相關基因工程的基本操作方法 真真 核核

7、 細細 胞胞 的的 基基 因因 結結 構構 編碼區(qū)編碼區(qū) 非編碼區(qū)非編碼區(qū) 外顯子：能編碼蛋白質的序列外顯子：能編碼蛋白質的序列 內含子：不能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列 ：有調控作用的核苷酸序列，：有調控作用的核苷酸序列， 包括位于編碼區(qū)上游的包括位于編碼區(qū)上游的RNARNA 聚合酶結合位點。聚合酶結合位點。 非編碼序列：非編碼序列： 包括非編碼區(qū)和內含子包括非編碼區(qū)和內含子 生物相關基因工程的基本操作方法 結構基因結構基因 外顯子外顯子 內含子內含子 轉錄、加工修飾轉錄、加工修飾 mRNA 生物相關基因工程的基本操作方法 原核細胞原核細胞真核細胞真核細胞 不同點不同點 編碼

8、區(qū)是編碼區(qū)是 _的的 編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、 _的的 相同點相同點 都由能夠編碼蛋白質的都由能夠編碼蛋白質的_ _ _ 和具和具 有調控作用的有調控作用的_ 區(qū)組成的區(qū)組成的 原核細胞與真核細胞的基因結構比較原核細胞與真核細胞的基因結構比較 連續(xù)連續(xù)不連續(xù)不連續(xù) 編碼區(qū)編碼區(qū) 非編碼非編碼 生物相關基因工程的基本操作方法 小小大大 無無有有 無無 有有 某種生物的部分基因某種生物的部分基因 某種生物的全部基因某種生物的全部基因 可以可以 部分基因可以部分基因可以 生物相關基因工程的基本操作方法 DNAmRNA蛋白質蛋白質 轉錄轉錄翻譯翻譯 補充資料 生物相關基因工程的基本操作方法 依

9、據：目的基因的有關信息。依據：目的基因的有關信息。 如：根據基因的核苷酸序列；如：根據基因的核苷酸序列； 基因的功能；基因的功能； 基因在染色體上的位置；基因在染色體上的位置； 基因的轉錄產物基因的轉錄產物mRNA； 基因翻譯產物蛋白質等特性。基因翻譯產物蛋白質等特性。 u基因文庫中不是直接保管相應基因，基因文庫中不是直接保管相應基因， 而是保存受體菌，菌中含基因。而是保存受體菌，菌中含基因。 生物相關基因工程的基本操作方法 （1 1）鳥槍法：）鳥槍法： 供體細胞中的供體細胞中的DNADNA 許多許多DNADNA片段片段 運載體運載體 限制酶限制酶 與載體連接與載體連接 受體細胞受體細胞 產生

10、特定性狀產生特定性狀 導入導入 外源外源DNADNA擴增擴增 目的基因目的基因 分離分離 ( (直接分離法直接分離法) ) 生物相關基因工程的基本操作方法 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復制復制_的核酸合成技術。的核酸合成技術。 多聚合酶鏈式反應多聚合酶鏈式反應 體外體外特定特定DNADNA片段片段 原理：原理：_ DNADNA復制復制 前提條件：前提條件：_； 有一段已知基因的核苷酸序有一段已知基因的核苷酸序 列列 （二）利用（二）利用PCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因 生物相關基因工程的基本操作方法 變性、退火、延伸三步曲變性、退火、延伸三步曲

11、變性：變性：加熱至加熱至9090 9595雙鏈雙鏈DNADNA解鏈成解鏈成 為單鏈為單鏈DNADNA 退火：退火：冷卻至冷卻至5555 6060部分引物與模部分引物與模 板的單鏈板的單鏈DNADNA的特定的特定 互補部位相配對和互補部位相配對和 結合結合 延伸：延伸：加熱至加熱至7070 7575以目的基因為以目的基因為 模板，合成互補的模板，合成互補的 新新DNADNA鏈鏈 變性變性 退火退火 延伸延伸 生物相關基因工程的基本操作方法 生物相關基因工程的基本操作方法 生物相關基因工程的基本操作方法 過程：過程： a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA

12、模板模板 在在_作用下，作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_ b b、退火（、退火（復性復性55-6055-60）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結合，形成局部模板結合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，從酶的作用下，從 引物的引物的55端端33端延伸，合成與模板互補端延伸，合成與模板互補 的的_。 氫鍵氫鍵 單鏈單鏈DNADNA 雙鏈雙鏈 DNADNA鏈鏈 高溫高溫 生物相關基因工程的基本操作方法 原料：原料：_、_ _ 、 _、 _。 方式：以方式：以_方式擴增，即方式擴增，即_（n n為擴增循為擴增循

13、環(huán)的次數）環(huán)的次數） 結果：結果： 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 DNADNA引物引物 熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶 指數指數2 2n n 使目的基因的片段在短時間內大量擴增使目的基因的片段在短時間內大量擴增 模板模板DNADNA 生物相關基因工程的基本操作方法 PCR的基本反應步驟的基本反應步驟 變性變性 90-95C 延伸延伸 70-75C 退火退火 55-60C PCRPCR總結：總結： 生物相關基因工程的基本操作方法 PCR技術擴增與技術擴增與DNA復制的比較復制的比較 PCRPCR技術技術DNADNA復制復制 相相 同同 點點 原理原理 原料原料 條件條件 不不 同同 點點

14、解旋解旋 方式方式 場所場所 酶酶 結果結果 堿基互補配對堿基互補配對 四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸 模板、能量、酶模板、能量、酶 DNADNA在高溫下在高溫下 變性解旋變性解旋 解旋酶催化解旋酶催化 體外復制體外復制細胞核內細胞核內 熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNADNA聚合酶聚合酶 細胞內的細胞內的DNADNA聚合酶聚合酶 大量的大量的DNADNA片段片段形成整個形成整個DNADNA分子分子 生物相關基因工程的基本操作方法 根據已知蛋白質根據已知蛋白質 的氨基酸序列，推測的氨基酸序列，推測 出相應的出相應的mRNAmRNA序列，序列， 然后按照堿基互補配然后按照堿基互補配 對原則，推測出它的對原則，

15、推測出它的 結構基因的核苷酸序結構基因的核苷酸序 列，再通過化學方法，列，再通過化學方法， 以單核苷酸為原料合以單核苷酸為原料合 成目的基因。成目的基因。 蛋白質的氨基酸序列蛋白質的氨基酸序列 mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列 結構基因的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列 推測推測 推測推測 目的基因目的基因 化學合成化學合成 （三）化學方法人工合成目的基因（三）化學方法人工合成目的基因 生物相關基因工程的基本操作方法 生物相關基因工程的基本操作方法 從基因文庫中獲取從基因文庫中獲取 利用利用PCRPCR技術擴增技術擴增 利用化學方法人工合成利用化學方法人工合成 歸納：獲取目的基因的方法歸

16、納：獲取目的基因的方法 生物相關基因工程的基本操作方法 用一定的用一定的_切割切割 質粒，使其出現一個切質粒，使其出現一個切 口，露出口，露出_。 用用_切割目切割目 的基因，使其產生的基因，使其產生_ _ _。 將切下的目的基因片段插入質粒的將切下的目的基因片段插入質粒的_處，處， 再加入適量再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組 DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒） 限制酶限制酶 黏性末端或平末黏性末端或平末 端端 同一種限制酶同一種限制酶 相同的黏性末端或平末端相同的黏性末端或平末端 切口切口 DNADNA連接酶連接酶 1.1.過程過程: : 二、構建表達載體二、構建表達載

17、體 核心核心 生物相關基因工程的基本操作方法 質粒質粒DNADNA分子分子 限制酶處理限制酶處理 一個切口一個切口 兩個黏性末端兩個黏性末端 兩個切口兩個切口 獲得目的基因獲得目的基因 DNADNA連接酶連接酶 重組重組DNADNA分子（重組質粒）分子（重組質粒） 同一種同一種 過程過程: : 生物相關基因工程的基本操作方法 2.2.構建構建基因表達載體的目的基因表達載體的目的 （1 1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在 并可以遺傳給下一代；并可以遺傳給下一代； （2 2）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。 生物相關基因工程的基本操作方

18、法 科學家在培育抗蟲棉時，經歷了多次失敗，科學家在培育抗蟲棉時，經歷了多次失敗， 才獲得成功。才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載 體質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗體質粒中，然后導入棉花的受精卵中，結果抗 蟲基因在棉花體內沒有表達。蟲基因在棉花體內沒有表達。 然后在插入抗蟲基因的質粒中插入啟動子然后在插入抗蟲基因的質粒中插入啟動子 ( (抗蟲基因首端抗蟲基因首端) )，導入棉花受精卵，長成的棉，導入棉花受精卵，長成的棉 花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W家又在有啟動花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W家又在有啟動 子、抗蟲基因的質粒中插入終止子子、抗

19、蟲基因的質粒中插入終止子( (抗蟲基因末抗蟲基因末 端端) )，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了，導入棉花受精卵，結果成長的植株，有了 抗蟲能力?？瓜x能力。 生物相關基因工程的基本操作方法 3.3.基因表達載體的組成：基因表達載體的組成： 它們有什么作用？它們有什么作用？ a、目的基因、目的基因 b、啟動子、啟動子 c、終止子、終止子 d、標記基因、標記基因 生物相關基因工程的基本操作方法 思考思考1： 表達載體為什么一定要有啟動子？表達載體為什么一定要有啟動子？ （1 1）生物之間進行基因交流，只有使）生物之間進行基因交流，只有使 用受體生物自身基因的啟動子才能有利用受體生物自身基因的啟

20、動子才能有利 于基因的表達；于基因的表達； （2 2）通過）通過cDNAcDNA文庫獲得的目的基因沒文庫獲得的目的基因沒 有啟動子，只將編碼序列導入受體細胞有啟動子，只將編碼序列導入受體細胞 無法轉錄。無法轉錄。 生物相關基因工程的基本操作方法 是為了鑒別受體細胞中是否含有目是為了鑒別受體細胞中是否含有目 的基因，從而將有目的基因的細胞篩選的基因，從而將有目的基因的細胞篩選 出來。出來。 思考思考3：標記基因有什么作用？標記基因有什么作用？ 生物相關基因工程的基本操作方法 載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和 復制原點兩部分復制原點兩部分DNADNA

21、片段。表達載體在載體基礎上片段。表達載體在載體基礎上 增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。 注意注意 用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用 到到DNADNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用 的化學鍵都是磷酸二酯鍵。的化學鍵都是磷酸二酯鍵。 啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少。啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少。 目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達 載體的方式攜帶進去。載體的方式攜帶進去。 生物相關基因工程的

22、基本操作方法 三、將目的基因導入受體細胞三、將目的基因導入受體細胞 （一）轉化：（一）轉化： 目的基因進入目的基因進入_內，并且在內，并且在 受體細胞內維持受體細胞內維持_和和_的過程的過程 受體細胞受體細胞 穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達 生物相關基因工程的基本操作方法 （二）（二） 方法方法 將目的基因導入將目的基因導入 植物細胞植物細胞 將目的基因導入將目的基因導入 動物細胞動物細胞 將目的基因導入將目的基因導入 微生物細胞微生物細胞 農桿菌轉化法（最多）農桿菌轉化法（最多） 基因槍法基因槍法 花粉管通道法花粉管通道法 顯微注射法顯微注射法 CaCa2+ 2+處理法 處理法 生物相關基因工程的基本操作

23、方法 1.1.將目的基因導入植物細胞將目的基因導入植物細胞 農桿菌轉化法農桿菌轉化法 基因槍法基因槍法 花粉管通道法花粉管通道法 生物相關基因工程的基本操作方法 （1 1）農桿菌轉化法）農桿菌轉化法 特點：特點： 易感染雙子葉植物和裸子易感染雙子葉植物和裸子 植物，對大多數單子葉植物植物，對大多數單子葉植物 沒有感染能力沒有感染能力 Ti Ti質粒上的質粒上的T-DNAT-DNA可以轉移到受體細胞，可以轉移到受體細胞， 并整合到受體細胞染色體的并整合到受體細胞染色體的DNADNA上。上。 生物相關基因工程的基本操作方法 轉化過程轉化過程: : TiTi質粒質粒 目的基因目的基因 構建構建 表表

24、 達達 載載 體體 導入導入 植植 物物 細細 胞胞 插入插入 植物細胞染植物細胞染 色體色體DNADNA 表達表達 新新 性性 狀狀 轉入轉入 農農 桿桿 菌菌 生物相關基因工程的基本操作方法 基因槍法又稱微基因槍法又稱微 彈轟擊法，是利用壓彈轟擊法，是利用壓 縮氣體產生的動力，縮氣體產生的動力， 將包裹在金屬顆粒表將包裹在金屬顆粒表 面的表達載體面的表達載體DNADNA打打 入受體細胞中，使目入受體細胞中，使目 的基因與其整合并表的基因與其整合并表 達的方法。達的方法。 （2 2）基因槍法）基因槍法 生物相關基因工程的基本操作方法 （3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱頭植物花粉在

25、柱頭 上萌發(fā)后，花粉管要上萌發(fā)后，花粉管要 穿過花柱直通胚囊。穿過花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在花粉管通道法就是在 植物受粉后，花粉形植物受粉后，花粉形 成的花粉管還未愈合成的花粉管還未愈合 前，剪去柱頭，然后，前，剪去柱頭，然后， 滴加滴加DNADNA（含目的基（含目的基 因），使目的基因借因），使目的基因借 助花粉管通道進入受助花粉管通道進入受 體細胞。體細胞。 生物相關基因工程的基本操作方法 2.2.將目的基因導入動物細胞將目的基因導入動物細胞 （1 1）方法：顯微注射法）方法：顯微注射法（將基因表達載體提（將基因表達載體提 純，用顯微儀注射到受精卵中）純，用顯微儀注射到受精卵中）

26、生物相關基因工程的基本操作方法 （2 2）操作程序）操作程序: : 提純含目的基因表達載體提純含目的基因表達載體 取受精卵取受精卵 顯微注射顯微注射 移植到子宮移植到子宮 受精卵發(fā)育受精卵發(fā)育 新性狀動物新性狀動物 生物相關基因工程的基本操作方法 常用法：常用法： 常用菌：常用菌： 微生物作受體細胞原因：微生物作受體細胞原因： 過程：過程： CaCa2+ 2+處理大 處理大 腸桿菌腸桿菌 感受態(tài)感受態(tài) 細胞細胞 表達載體表達載體 與感受態(tài)與感受態(tài) 細胞混合細胞混合 感受態(tài)感受態(tài) 細胞吸細胞吸 收收DNADNA 3.3.將目的基因導入微生物細胞將目的基因導入微生物細胞 思考：為什么要用思考：為什

27、么要用 Ca2+處理受體細胞？處理受體細胞？ 用用CaCa2 2 處理，增加細菌細胞膜的通透 處理，增加細菌細胞膜的通透 性性 CaCa2+ 2+處理 處理 大腸桿菌大腸桿菌 繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少 一定一定 溫度溫度 重組表達重組表達 載體載體DNA 溶于緩沖溶于緩沖 液液 生物相關基因工程的基本操作方法 受體生物受體生物 植物植物 動物動物 微生物微生物 受體細胞受體細胞 導入方法導入方法 受精卵受精卵 體細胞體細胞 受精卵受精卵 細胞細胞/ /個體個體 農桿菌轉化法農桿菌轉化法 基因槍法基因槍法 花粉管通道法花粉管通道法 顯微注顯微注 射技術

28、射技術 用用CaCa2+ 2+處理 處理 成感受態(tài)細成感受態(tài)細 胞胞 歸納：歸納： 生物相關基因工程的基本操作方法 四、目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定 分子檢測分子檢測: : 是否插入目的基因是否插入目的基因 是否轉錄是否轉錄 是否翻譯是否翻譯 鑒定鑒定: : 個體生物學水平鑒個體生物學水平鑒 定定 生物相關基因工程的基本操作方法 1 1、檢測轉基因生物染色體的、檢測轉基因生物染色體的DNADNA上是否插入上是否插入 了目的基因了目的基因 首先取出轉基因生物的基因組首先取出轉基因生物的基因組DNADNA； （1 1）方法）方法: :DNADNA分子雜交（分子雜交（DNA-DNA)

29、DNA-DNA) （2 2）過程）過程: : 將含目的基因的將含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等 作標記作標記, ,以此做探針；以此做探針； 使探針和基因組使探針和基因組DNADNA雜交雜交, ,若顯示出雜交帶若顯示出雜交帶, , 表明目的基因已插入染色體表明目的基因已插入染色體DNADNA中。中。 （一）檢測（一）檢測 生物相關基因工程的基本操作方法 生物相關基因工程的基本操作方法 方法方法: :分分 子子 雜雜 交交(mRNA-DNA)(mRNA-DNA) 方法方法: :抗原抗原- -抗體雜交抗體雜交 過程過程: : 用上述探針和轉基因生物的用上述探針和轉基因

30、生物的mRNAmRNA雜雜 交交, ,若出現雜交帶若出現雜交帶, ,表明目的基因轉表明目的基因轉 錄出了錄出了mRNAmRNA。 過程過程: : 從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的從轉基因生物中提取蛋白質，用相應的 抗體進行抗體進行抗原-抗體雜交，若出現雜交帶, 表明目的基因已形成蛋白質產品。 生物相關基因工程的基本操作方法 怎樣檢驗抗蟲基因在棉細胞內是否表達呢？怎樣檢驗抗蟲基因在棉細胞內是否表達呢？ 沒有抗蟲基因沒有抗蟲基因 的棉植株的棉植株 有抗蟲基因的有抗蟲基因的 棉植株棉植株 棉鈴蟲棉鈴蟲 蟲沒有死蟲沒有死 蟲被殺死蟲被殺死 沒有表達沒有表達 目的基目的基 因表達因表達 （二）鑒定（個

31、體生物學水平）（二）鑒定（個體生物學水平） 抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等 生物相關基因工程的基本操作方法 類類 型型 步驟步驟 檢測內容檢測內容方法方法結果顯示結果顯示 分分 子子 檢檢 測測 第一第一 步步 是否成功顯示是否成功顯示 出雜交帶出雜交帶 第二第二 步步 是否成功顯示是否成功顯示 出雜交帶出雜交帶 第三第三 步步 是否成功顯示是否成功顯示 出雜交帶出雜交帶 個個 體體 水水 平平 鑒鑒 定定 包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及 抗性的程度；抗性的程度； 基因工程產品與天然產品的活性比較，以確

32、定功能是基因工程產品與天然產品的活性比較，以確定功能是 否相同等。否相同等。 轉基因生物的轉基因生物的DNADNA上上 是否插入目的基因是否插入目的基因 DNADNA分子雜交分子雜交 （DNADNA和和DNADNA之間）之間） 目的基因是否轉目的基因是否轉 錄出錄出mRNAmRNA 分子雜交技術分子雜交技術 （DNADNA和和mRNAmRNA之間）之間） 目的基因是否翻譯目的基因是否翻譯 出蛋白質出蛋白質 抗原抗原抗體雜交抗體雜交 生物相關基因工程的基本操作方法 提示：提示： DNADNA分子雜交技術首先提取轉基因分子雜交技術首先提取轉基因 生物的生物的DNADNA，然后高溫或提高，然后高溫或

33、提高pHpH解成單解成單 鏈，再與同位素標記的鏈，再與同位素標記的DNADNA探針雜交；探針雜交； 抗原抗體雜交所用到的抗體是抗原抗體雜交所用到的抗體是 用表達出的蛋白質注射動物進行免疫，用表達出的蛋白質注射動物進行免疫， 產生相應的抗體，并提取出來的。產生相應的抗體，并提取出來的。 生物相關基因工程的基本操作方法 生物相關基因工程的基本操作方法 歸納歸納: 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 獲取目的基因獲取目的基因 u 從基因文庫從基因文庫 u 利用利用PCR u 化學方法人工合成化學方法人工合成 構建基因表達載體構建基因表達載體 u 目的基因、啟動子、終止子、標記基因目的基因、

34、啟動子、終止子、標記基因 將目的基因導入受體細胞將目的基因導入受體細胞 u Ca2+處理（微生物）、農桿菌轉化法（植物）、顯微注射（微生物）、農桿菌轉化法（植物）、顯微注射 法（動物）法（動物） 目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定 u 檢測：是否插入、轉錄、翻譯檢測：是否插入、轉錄、翻譯 u 個體生物學水平的鑒定個體生物學水平的鑒定 生物相關基因工程的基本操作方法 作為基因工程表達載體，作為基因工程表達載體， 只需含有目的基因就可以完成任務只需含有目的基因就可以完成任務 嗎？為什么？嗎？為什么？ 不可以。不可以。 因為目的基因在表達載體中得到表因為目的基因在表達載體中得到表 達并發(fā)揮作用

35、，還需要有其他控制元件，達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件， 如啟動子、終止子和標記基因等。如啟動子、終止子和標記基因等。 必須構建上述元件的必須構建上述元件的是：是： 生物相關基因工程的基本操作方法 （1 1） 生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自 身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達； （2 2） 通過通過cDNAcDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只 將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；將編碼序列導入受體生物中無法轉錄； （3 3） 目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標

36、記；目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記； （4 4） 為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一 些其他調控元件，如增強子（增強基因啟動子工作效率些其他調控元件，如增強子（增強基因啟動子工作效率 的順式作用序列，能夠在相對于啟動子的任何方向和任的順式作用序列，能夠在相對于啟動子的任何方向和任 何位置何位置( (上游或下游上游或下游) )上都發(fā)揮作用。）等；上都發(fā)揮作用。）等； （5 5） 有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的 什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做 成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白 基因等?；虻?。 生物相關基因工程的基本操作方法 1 1、為什么要構建基因文庫？直接從含有目的基因、為什么要構建基因文庫？直接從含有目的基因 的生物體內提取不行嗎？的生物體內提取不行嗎？ 構建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是構建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是 唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可 以通過以通過PCR