5谷氨酸發(fā)酵機(jī)制

1、教案首頁授課順序?qū)W時 日期 2012年 月 日 班級：課題第五章谷氨酸發(fā)酵機(jī)制目 的 要 求1、了解谷氨酸生產(chǎn)菌的種類。2、掌握谷氨酸的生物合成途徑及生物素對谷氨酸發(fā)酵的影響，3、掌握細(xì)胞膜的通透性與谷氨酸的積累及生物合成的代謝控制機(jī) 制。重占八、難 占重點：谷氨酸的合成機(jī)理及生物素對發(fā)酵的影響。 難點：細(xì)胞膜通透性對氨基酸積累的影響。教 學(xué) 過 程I .復(fù)習(xí)引入 n.講授新課 川.總結(jié)教 具/、 掛 圖無課 后 分 析備 授 課 內(nèi) 容注I. 復(fù)習(xí)引入復(fù)習(xí)上節(jié)課我們講了空氣滅菌技術(shù)及氨基酸的生產(chǎn)過程， 由氨基酸的生產(chǎn)過程導(dǎo)入本節(jié)主題n.講授新課第五章谷氨酸發(fā)酵機(jī)制教 學(xué) 過 程一、谷氨酸生產(chǎn)

2、菌的種類現(xiàn)在經(jīng)過鑒定和命名的谷氨酸產(chǎn)生菌很多，其中主要是棒桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬和 節(jié)桿菌屬中的細(xì)菌（如表5-1 ）。目前，我國企業(yè)使用的谷氨酸生產(chǎn)菌主要是北京棒桿菌AS 1.299、鈍齒棒桿菌AS 1.542和天津短桿菌T&13以及它們的各種突變株。二、谷氨酸發(fā)酵機(jī)制生物體內(nèi)合成谷氨酸的前體物質(zhì)是 a -酮戊二酸，是三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）的中間產(chǎn)物， 因此，由糖質(zhì)原料生物合成谷氨酸的途徑包括糖酵解途徑（EMP途徑）、三羧酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)、CO?的固定反應(yīng)（伍德沃克曼反應(yīng)）等。1.谷氨酸生物合成途徑 由葡萄糖發(fā)酵谷氨酸的理想途徑在谷氨酸發(fā)酵時，糖酵解經(jīng)過 EMP和HMP兩個途徑進(jìn)行，生

3、物素充足菌HMP所占比例約為38%，控制生物素亞適量的結(jié)果表明在發(fā)酵產(chǎn)酸期，EMP所占比例更大，約為 74%。生成丙酮酸后，一部分氧化脫羧生成乙酰CoA，一部分固定CO?生成草酰乙酸或蘋果酸，草酰乙酸與乙酰CoA在檸檬酸合成酶催化作用下，縮合成檸檬酸，在經(jīng)過氧化還原共軛的氨基化反應(yīng)生 成谷氨酸，如圖5-1所示。coEMP為主HMP約占26%氧化還原共軛的氨基化反應(yīng)葡萄糖 2丙酮酸圖5-1葡萄糖發(fā)酵谷氨酸的理想途徑 由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑葡萄糖EMP途徑為主6-磷酸葡萄糖+ 6-磷酸葡萄酸H MP途徑 約占2 6%3-磷酸甘油醛5-磷酸核糖乳酸-CO檸檬酸蘋果酸順烏頭酸延胡索酸-7*

4、7TT?廿;TT?厶 乙醛酸CO2CO2-*乙醛CoA*丙酮酸CO2CO2草酰乙酸異檸檬酸2 CO2琥珀酸4a -酮戊二酸一rNH4谷氨酸（胞外）”谷氨酸（胞內(nèi)）指導(dǎo) 學(xué)生 自己 想。圖5-2由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑2異檸檬酸脫氫酶；3異檸檬酸裂解酶；4 a -酮戊二酸脫氫酶；5谷氨酸脫氫酶100 %通過CO2固定反應(yīng)供給在生長之后，理想的發(fā)1 檸檬酸合成酶；在菌體生長之后，假如四碳二羧酸是酵按如下反應(yīng)進(jìn)行：C6H12O6 + NH3 + 1.502 T C5H9O4N + CO2 + 3H2O1471801摩爾葡萄糖可以生成 1摩爾的谷氨酸，谷氨酸對葡萄糖的重量理論轉(zhuǎn)化率為14710

5、0% = 81.7%2. 谷氨酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制微生物的代謝途徑主要有兩種，即分解代謝和合成代謝。微生物通過分解代謝從環(huán)境中攝 取營養(yǎng)物質(zhì)，把它們轉(zhuǎn)化為自身物質(zhì)，以此來提供能源和小分子中間體；通過合成代謝將 分解代謝產(chǎn)生的能量和中間體合成氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。在工業(yè)上，通過對微生物代先讓學(xué)生 總結(jié) 教師 再重 申。異檸檬酸異檸檬酸裂解酶*乙醛酸+琥珀酸謝途徑的控制，來滿足生產(chǎn)的需要，提高生產(chǎn)效益。所以，研究微生物代謝調(diào)節(jié)機(jī)制有極其重 要的意義。（1）糖代謝（EMP途徑和HMP途徑）的調(diào)節(jié) 能荷的調(diào)節(jié) 生物素對糖代謝速度的調(diào)節(jié)（2）三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）的調(diào)節(jié)（3）乙醛酸循環(huán)（DC

6、A循環(huán)）的調(diào)節(jié)乙醛酸循環(huán)（如圖 5-2 ）中關(guān)鍵酶是異檸檬酸裂解酶和蘋果酸酶。通過乙醛酸循環(huán)異檸檬 酸裂解酶的催化作用，使琥珀酸、延胡索酸和蘋果酸的量得到補(bǔ)足，其反應(yīng)如下：蘋果酸酶蘋果酸葡萄糖和琥珀酸等對異檸檬酸裂解酶起著阻遏作用。（4）CO2固定反應(yīng)的調(diào)節(jié)（5）NH4+對谷氨酸生物合成的調(diào)節(jié)3. 細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)（1）控制細(xì)胞膜的形成控制細(xì)胞膜形成的常用方法有： 利用生物素缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時，限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度。 利用生物素過量的糖蜜原料進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時，添加表面活性劑或飽和脂肪酸。 利用油酸缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，限制發(fā)酵培養(yǎng)基油酸的濃度。 利用甘油缺陷型進(jìn)行谷氨酸發(fā)

7、酵，限制發(fā)酵培養(yǎng)基甘油的濃度。（2）控制細(xì)胞壁的形成細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)是肽聚糖，因此，肽聚糖的合成及其調(diào)節(jié)控制就與細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性密切相關(guān)。對于細(xì)胞壁形成的控制，常用的方法有添加青霉素、頭孢霉素C等3內(nèi)酰胺類抗生素。青霉素是轉(zhuǎn)肽酶的抑制劑，它與轉(zhuǎn)肽酶活性部位上的Ser殘基形成了共價鍵，使轉(zhuǎn)肽酶受到了不可逆的抑制。青霉素作為糖肽末端結(jié)構(gòu)(D-Ala-D-Ala )的類似物，競爭性地抑制合成糖肽的底物，而與轉(zhuǎn)肽酶的活性中心結(jié)合，使糖肽合成不能完成，結(jié)果形成不完整的細(xì)胞壁，使 細(xì)胞膜處于無保護(hù)狀態(tài)，易于破損，增大谷氨酸的通透性。三、谷氨酸生產(chǎn)菌的選育1.自然選育微生物純種的自然選育，以基因自發(fā)突變?yōu)?/p>

8、基礎(chǔ)選育優(yōu)良性狀菌株的一種方法。這種方法 有利于谷氨酸生產(chǎn)菌保持純系良種，使谷氨酸生產(chǎn)具有相對穩(wěn)定性，提高發(fā)酵水平。但是由于 菌體自身存在著修復(fù)機(jī)制和某些酶的校正作用，使得自發(fā)突變率極低，導(dǎo)致選育耗時長、工作 量大、效率低，一般不宜單獨采用。2 誘變選育誘變的目的是通過物理因素、化學(xué)因素及其它一些因素的單一或復(fù)合處理，使谷氨酸生產(chǎn) 菌細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，通過分離篩選，可獲得具有優(yōu)良特性的變異菌株。物理因素主 要有紫外線、Co60、X射線、丫射線、快中子、a射線、3射線、超聲波、He-Ne激光輻照、離 子束等。化學(xué)因素主要有氮芥、亞硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亞硝基甲基脲、亞硝 酸、

9、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶等。其它因素主要有生物誘導(dǎo)因子，如噬菌體誘發(fā)抗性突變等。3. 雜交育種雜交育種包括常規(guī)雜交和原生質(zhì)體融合技術(shù)，其中原生質(zhì)體融合技術(shù)近年來發(fā)展較為活躍。原生質(zhì)體融合就是將兩個親株的細(xì)胞壁分別通過酶解作用加以剝除，制得原生質(zhì)體或原生質(zhì)球，在高滲條件下混合，由聚乙二醇(PEG)助融，促使原生質(zhì)體凝集、融合，兩個基因組之間接觸、交換、遺傳重組，在再生細(xì)胞中獲得重組體。4. 代謝控制選育代謝控制育種的活力在于以誘變育種為基礎(chǔ)，獲得各種解除或繞過微生物正常代謝途徑的突變株，從而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量生成積累，打破了微生物調(diào)節(jié)這一障礙。依據(jù)谷氨酸生物合成途徑及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，谷氨酸生產(chǎn)菌的代謝控制選育可從如下幾個方 面進(jìn)行。(1) 選育耐高糖、高谷氨酸的菌株(2) 選育能強(qiáng)化谷氨酸合成代謝，削弱或阻斷支路代謝的菌株 選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株 選育強(qiáng)化能量代謝的突變株 其它遺傳標(biāo)記(3)選育能提高谷氨酸通透性的菌株5.基因工程選育隨著生物工程新技術(shù)的發(fā)展，體外DNAt組的基因工程和固定化細(xì)胞技術(shù)都已應(yīng)用于谷氨酸 發(fā)酵研究?；蚬こ逃N是指利用基因工程方法對生產(chǎn)菌株，進(jìn)行改造而獲得高產(chǎn)工程菌，或者是通過微生物間的轉(zhuǎn)基因而獲得新菌種的育種方法