生物化學(xué)與分子生物學(xué)試驗(yàn)課件

生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1、實(shí)驗(yàn)前需預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和有關(guān)理論，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、預(yù)期的結(jié)果、操作關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)。2、實(shí)驗(yàn)要嚴(yán)肅認(rèn)真地按照操作規(guī)程進(jìn)行，注意觀察實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果，并把實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果及時(shí)如實(shí)記錄在實(shí)驗(yàn)記錄本上，課后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)分析。3、實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)臺(tái)應(yīng)保持整潔。公用試劑用畢，立即蓋嚴(yán)并還原。實(shí)驗(yàn)完畢，儀器洗凈放好。4、注意節(jié)約藥品、試劑和各種物品，愛(ài)護(hù)儀器，按規(guī)程操作儀器，以免損壞。5、實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)禁吸煙！乙醇、丙酮等易燃物品不能直接加熱，并遠(yuǎn)離火源。實(shí)驗(yàn)結(jié)束離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室之前，關(guān)好窗戶，切斷電源，水源，確保安全。6、若發(fā)生酸堿灼燒事故，應(yīng)用大量自來(lái)水沖洗，酸灼傷者用飽和NaHCO3溶液中和，堿灼傷者用飽和H3BO3溶液中和，氧化劑傷害者用Na2S2O4處理。7、所有固體廢棄物如：廢紙、固體廢棄物、沉淀物等必須棄于垃圾桶中。強(qiáng)酸、強(qiáng)堿必須倒入玻璃器皿中，用水稀釋后倒入水槽。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1、實(shí)驗(yàn)前需預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和有關(guān)理論，明確實(shí)2實(shí)驗(yàn)考試和考核方法實(shí)驗(yàn)分?jǐn)?shù)占總分的15％，其中理論考試占5分，見(jiàn)理論考試試卷。每次實(shí)驗(yàn)為2.5分，其中：1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告占1分（實(shí)驗(yàn)的報(bào)告占0.5分，分析討論0.5分。）。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果占0.4分（結(jié)果的正確度），操作考核占0.4分：包括分光光度法測(cè)試，離心機(jī)使用，層析法，電泳法等基本操作。實(shí)驗(yàn)態(tài)度占0.7分。實(shí)驗(yàn)考試和考核方法實(shí)驗(yàn)分?jǐn)?shù)占總分的15％，其中理論考試占5分3實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1、實(shí)驗(yàn)題目，時(shí)間，實(shí)驗(yàn)者姓名2、目的3、原理（簡(jiǎn)單明了）4、操作不寫(xiě)5、結(jié)果，定性要分析，定量要列表6、結(jié)論：總結(jié)分析實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1、實(shí)驗(yàn)題目，時(shí)間，實(shí)驗(yàn)者姓名4試劑使用規(guī)則1、使用試劑前應(yīng)該仔細(xì)辨認(rèn)標(biāo)簽，看清名稱及濃度，是否為本實(shí)驗(yàn)所需。2、取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，放回原位；未用完的試劑決不可倒回原瓶。3、取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，應(yīng)該將標(biāo)準(zhǔn)溶液倒入干試管中，再用干凈吸管吸取標(biāo)準(zhǔn)液，以免污染瓶中的標(biāo)準(zhǔn)液體。4、使用滴管時(shí)，滴管尖端朝下，避免試劑流入橡皮帽內(nèi)。5、使用有毒試劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿時(shí)，盡可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。試劑使用規(guī)則1、使用試劑前應(yīng)該仔細(xì)辨認(rèn)標(biāo)簽，看清名稱及濃度，5使用過(guò)的玻璃儀器的清洗1、一般非計(jì)量玻璃儀器或粗容量?jī)x器，如燒杯、試管、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自來(lái)水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗1－2次，倒置晾干。2、容量分析儀器，如滴定管、容量瓶等先用自來(lái)水沖洗，瀝干后，浸于鉻酸洗液浸泡數(shù)小時(shí)。然后用自來(lái)水反復(fù)沖洗干凈，干燥備用。3、用完比色杯后，立即用自來(lái)水反復(fù)沖洗。切忌用刷子、粗糙的布或紙擦拭。洗凈后，倒置晾干備用。使用過(guò)的玻璃儀器的清洗6吸量管的種類和使用

1、分類1）奧氏吸量管供準(zhǔn)確量取0.50、1.0、2.0、3.0ml液體所用。這種吸量管只有一個(gè)刻度，當(dāng)放出所量取的液體時(shí)，管尖余留的液體必須吹入容器內(nèi)。2）移液管常用量取50.0、25.0、10.0、5.0、2.0、1.0ml的液體，這種吸量管只有一個(gè)刻度，放液時(shí)，量取的液體自然流出后，管尖需在容器內(nèi)滯留15秒。注意管尖殘留的液體不要吹出。3）刻度吸量管供量取10ml以下任意體積的溶液。一般刻度包括尖端部分。將所量液體全部放出后，還需要吹出殘留于管尖的溶液。此類吸量管為“吹出式”，吸量管上端標(biāo)有“吹”字。未標(biāo)“吹”字的吸量管，則不必吹出管尖的殘留液體。2、使用原則量取整數(shù)量液體，并且取量要求準(zhǔn)確時(shí)，應(yīng)該選用奧氏吸量管。量取大體積時(shí)要用移液管。同一定量實(shí)驗(yàn)中，如欲加同種試劑于不同的管中，并且取量不多時(shí)，應(yīng)選擇一支與最大取液量接近的刻度吸量管。吸量管的種類和使用

1、分類7吸量管的使用

1、正確拿法中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂端2、取液用橡皮球吸液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸完后用食指頂住吸量管上端。3、調(diào)刻度吸量管與地面保持垂直，下口與試劑瓶接觸，并成一角度；用食指控制液體下降至最上一刻度處；液體凹面、刻度和視線應(yīng)在一水平面上。4、放液吸量管移入準(zhǔn)備接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接觸器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放開(kāi)食指，使液體自動(dòng)流出。奧氏吸量管和刻度到底的吸量管應(yīng)吹出尖端殘留的液體。移液管應(yīng)最后靠壁15秒。吸量管的使用

1、正確拿法中指和拇指拿住吸管上端，食指頂8一、分光光度法原理光的本質(zhì)是一種電磁波，具有不同的波長(zhǎng)，可見(jiàn)光的波長(zhǎng)范圍在400～760nm。波長(zhǎng)范圍200～400nm的光線稱為紫外光。有色物質(zhì)可以選擇性地吸收一部分可見(jiàn)光的光能量而呈現(xiàn)不同顏色，某些物質(zhì)卻能特征性地選擇吸收紫外光的能量。一、分光光度法原理9物質(zhì)吸收由光源發(fā)出的某些波長(zhǎng)的光可形成特定的吸收光譜。由于物質(zhì)的吸收光譜與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且在一定的條件下其吸收程度與該物質(zhì)的濃度成正比，所以可利用物質(zhì)的特定吸收光譜對(duì)其進(jìn)行定性和定量的分析。分光光度法就是利用各種物質(zhì)所具有的這種吸收特征所建立起來(lái)的分析方法。物質(zhì)吸收由光源發(fā)出的某些波長(zhǎng)的光可形成特定的吸收光譜。由于物10吸收光譜和物質(zhì)的定性分析

用各種不同波長(zhǎng)的光線作為入射光測(cè)定物質(zhì)的吸光度（Absorbance），然后以波長(zhǎng)（λ）為橫軸，相應(yīng)的吸光度（A）為縱軸，按結(jié)果作圖，可得到該物質(zhì)的吸收光譜曲線。吸收光譜曲線是物質(zhì)的特征曲線。在一定的溫度、pH值等條件下吸收光譜的曲線形狀是一定的。在吸收光譜中，往往可找到一個(gè)或幾個(gè)吸收最大值，該處的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)（λmax）。物質(zhì)不同，它們的最大吸收波長(zhǎng)也往往不同。吸收光譜和物質(zhì)的定性分析11物質(zhì)用分光分析定性主要根據(jù)是吸收光譜存在的特征吸收。

常用定性方法：

1、比較吸收光譜曲線。2、比較最大吸收波長(zhǎng)。3、比較吸光度比值。物質(zhì)用分光分析定性主要根據(jù)是吸收光譜存在的特征吸收。常用定12Beer—Lambert定律和物質(zhì)的定量分析

原理一束平行光照射至溶液時(shí)、一部分光被吸收、一部分光可透過(guò)該溶液、不同物質(zhì)光的吸收程度是不同的。物質(zhì)對(duì)單色光吸收的強(qiáng)弱以及溶液濃度與也曾厚度的關(guān)系，服從物質(zhì)對(duì)光吸收的定量定律，即Beer—Lambert定律，其表達(dá)式為：A＝KCL或LgI0/I＝KCLBeer—Lambert定律的含義為一束單色光通過(guò)溶液解質(zhì)后，光能被吸收的程度與溶液的濃度和厚度成正比。如果實(shí)驗(yàn)中的厚度不變，則A＝KCA為吸光度，T為透光度，即I/I0，A和T是負(fù)對(duì)數(shù)的關(guān)系。吸收系數(shù)K實(shí)際上式物質(zhì)在單位濃度和單位厚度下對(duì)入射光的吸光度，在一定波長(zhǎng)下，K越大，表示物質(zhì)對(duì)光的吸收越強(qiáng)。Beer—Lambert定律和物質(zhì)的定量分析原理13常用的以Beer—Lambert定律為依據(jù)的定量分析方法Beer—Lambert定律原理是討論有色溶液對(duì)單色光的吸收程度與溶液的濃度及液層厚度間的定量關(guān)系。1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法。配制一系列已知不同濃度的測(cè)定物溶液，按一定方法顯色后，分別用分光光度計(jì)測(cè)得吸光度。以吸光度為縱座標(biāo)、濃度為橫座標(biāo)，繪制A—C曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下，測(cè)定被測(cè)溶液得吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可找出相應(yīng)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與測(cè)定管的測(cè)定應(yīng)在同一儀器上進(jìn)行。常用的以Beer—Lambert定律為依據(jù)的定量分析方法Be142、標(biāo)準(zhǔn)管法。將標(biāo)準(zhǔn)品（已知濃度Cs）與樣品在相同條件下顯色并測(cè)得吸光度。因?yàn)樵诖讼?，兩者的K值相等，所以可根據(jù)

Cx＝(Cs/As)Ax

求得樣品溶液得濃度Cx。式中As和Ax分別為標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管的吸光度。

3、克分子吸光系數(shù)ε法。當(dāng)濃度為IM，溶液厚度為1cm，吸光系數(shù)用ε表示，ε亦稱為克分子吸光系數(shù)。在已知ε得情況下，可根據(jù)下式求出測(cè)定液的物質(zhì)濃度

C＝A/ε2、標(biāo)準(zhǔn)管法。將標(biāo)準(zhǔn)品（已知濃度Cs）與樣品在相同條件下顯色15分光光度計(jì)原理：分光光度計(jì)形式較多，但基本結(jié)構(gòu)和原理相似，可用下圖表示：儀器中光源經(jīng)過(guò)單色器中的單色原件（如棱鏡），所得到的單色光（入射光）進(jìn)入樣品室，透出的光被受光器（光電池或光電色）產(chǎn)生光電流，放大后在測(cè)量?jī)x上顯示出吸光度（A）或透光度（T）儀器的光電管或光電池對(duì)不同波長(zhǎng)的光敏感度不一樣，在制作吸收曲線時(shí)應(yīng)注意每換一次波長(zhǎng)，都應(yīng)將空白溶液的吸光度調(diào)整到0。光源單色器受光器測(cè)量器樣品室分光光度計(jì)原理：分光光度計(jì)形式較多，但基本結(jié)構(gòu)和原理相似，16分光光度計(jì)的類型1、單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)2、單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)3、雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)最簡(jiǎn)單常見(jiàn)的光度計(jì)是單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)，如751、721等。分光光度計(jì)的類型1、單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)17使用方法（以721為例）該機(jī)的光譜范圍在360nm-800nm。1、接通電源，打開(kāi)機(jī)器開(kāi)關(guān)，使儀器通電，打開(kāi)箱蓋，預(yù)熱10分鐘。2、將空白液或?qū)φ找杭皽y(cè)定液分別裝入比色杯3/4體積并用軟紙擦清外壁，放入樣品室。3、調(diào)節(jié)電流計(jì)上零點(diǎn)調(diào)節(jié)器，使讀書(shū)盤(pán)上指針的吸光度為∝或透光率為0。調(diào)節(jié)測(cè)定所用波長(zhǎng)。4、蓋上箱蓋，光徑開(kāi)關(guān)自動(dòng)打開(kāi)。轉(zhuǎn)動(dòng)光量調(diào)節(jié)器使空白或?qū)φ展艿奈舛葹?，或透光率為100％，待讀數(shù)指針?lè)€(wěn)定后，逐步拉出樣品盒滑干，通過(guò)讀數(shù)指針，讀取測(cè)定管上的吸光度。有時(shí)需調(diào)節(jié)靈敏度開(kāi)關(guān)，才能正確讀得吸光度。此時(shí)應(yīng)重新轉(zhuǎn)動(dòng)零點(diǎn)調(diào)節(jié)器至吸光度為∝。5、讀數(shù)完畢，打開(kāi)儀器蓋板，關(guān)閉開(kāi)關(guān)，將比色杯沖洗干凈。6、溶液定量測(cè)定時(shí)，應(yīng)注意吸光度在0.1～1.0范圍，濃度太大時(shí)應(yīng)適當(dāng)稀釋。*注意事項(xiàng)：1）用手拿比色杯的磨砂面。2）液體的體積裝滿比色杯的3/4。3）不要將比色杯放在分光光度計(jì)上。使用方法（以721為例）該機(jī)的光譜范圍在36018可見(jiàn)光紫外光光度計(jì)該種機(jī)采用兩個(gè)光源，可在可見(jiàn)和紫外區(qū)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分析，鎢絲燈發(fā)出光的適宜范圍在360－1000nm，氫燈發(fā)出光的適宜范圍在150－400nm。通過(guò)兩種光源的切換，可以在兩種波長(zhǎng)范圍內(nèi)使用?？梢?jiàn)光紫外光光度計(jì)該種機(jī)采用兩個(gè)光源，可在可見(jiàn)和紫外區(qū)對(duì)物19實(shí)驗(yàn)一高錳酸鉀吸收曲線的繪制原理高錳酸鉀水溶液對(duì)于不同波長(zhǎng)的光線可有不同的吸收程度。用721分光光度計(jì)測(cè)定相應(yīng)波長(zhǎng)下的高錳酸鉀吸光度并作圖，可得到吸收曲線。實(shí)驗(yàn)一高錳酸鉀吸收曲線的繪制原理20實(shí)驗(yàn)二雙縮脲（Biuret）法測(cè)定蛋白質(zhì)含量原理在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子能與銅離子結(jié)合生成紫紅色的化合物（雙縮脲反應(yīng)），在一定的濃度范圍內(nèi)，顏色的深淺與蛋白質(zhì)含量呈線形關(guān)系。因此可用比色法測(cè)定蛋白的含量。實(shí)驗(yàn)二雙縮脲（Biuret）法測(cè)定蛋白質(zhì)含量原理21生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)22生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1、實(shí)驗(yàn)前需預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和有關(guān)理論，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、原理、預(yù)期的結(jié)果、操作關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)。2、實(shí)驗(yàn)要嚴(yán)肅認(rèn)真地按照操作規(guī)程進(jìn)行，注意觀察實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果，并把實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果及時(shí)如實(shí)記錄在實(shí)驗(yàn)記錄本上，課后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)分析。3、實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)臺(tái)應(yīng)保持整潔。公用試劑用畢，立即蓋嚴(yán)并還原。實(shí)驗(yàn)完畢，儀器洗凈放好。4、注意節(jié)約藥品、試劑和各種物品，愛(ài)護(hù)儀器，按規(guī)程操作儀器，以免損壞。5、實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)禁吸煙！乙醇、丙酮等易燃物品不能直接加熱，并遠(yuǎn)離火源。實(shí)驗(yàn)結(jié)束離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室之前，關(guān)好窗戶，切斷電源，水源，確保安全。6、若發(fā)生酸堿灼燒事故，應(yīng)用大量自來(lái)水沖洗，酸灼傷者用飽和NaHCO3溶液中和，堿灼傷者用飽和H3BO3溶液中和，氧化劑傷害者用Na2S2O4處理。7、所有固體廢棄物如：廢紙、固體廢棄物、沉淀物等必須棄于垃圾桶中。強(qiáng)酸、強(qiáng)堿必須倒入玻璃器皿中，用水稀釋后倒入水槽。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1、實(shí)驗(yàn)前需預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和有關(guān)理論，明確實(shí)23實(shí)驗(yàn)考試和考核方法實(shí)驗(yàn)分?jǐn)?shù)占總分的15％，其中理論考試占5分，見(jiàn)理論考試試卷。每次實(shí)驗(yàn)為2.5分，其中：1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告占1分（實(shí)驗(yàn)的報(bào)告占0.5分，分析討論0.5分。）。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果占0.4分（結(jié)果的正確度），操作考核占0.4分：包括分光光度法測(cè)試，離心機(jī)使用，層析法，電泳法等基本操作。實(shí)驗(yàn)態(tài)度占0.7分。實(shí)驗(yàn)考試和考核方法實(shí)驗(yàn)分?jǐn)?shù)占總分的15％，其中理論考試占5分24實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1、實(shí)驗(yàn)題目，時(shí)間，實(shí)驗(yàn)者姓名2、目的3、原理（簡(jiǎn)單明了）4、操作不寫(xiě)5、結(jié)果，定性要分析，定量要列表6、結(jié)論：總結(jié)分析實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1、實(shí)驗(yàn)題目，時(shí)間，實(shí)驗(yàn)者姓名25試劑使用規(guī)則1、使用試劑前應(yīng)該仔細(xì)辨認(rèn)標(biāo)簽，看清名稱及濃度，是否為本實(shí)驗(yàn)所需。2、取出試劑后，立即將瓶塞蓋好，放回原位；未用完的試劑決不可倒回原瓶。3、取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，應(yīng)該將標(biāo)準(zhǔn)溶液倒入干試管中，再用干凈吸管吸取標(biāo)準(zhǔn)液，以免污染瓶中的標(biāo)準(zhǔn)液體。4、使用滴管時(shí)，滴管尖端朝下，避免試劑流入橡皮帽內(nèi)。5、使用有毒試劑及強(qiáng)酸強(qiáng)堿時(shí)，盡可能用量筒取，若用吸管只能用吸耳球取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。試劑使用規(guī)則1、使用試劑前應(yīng)該仔細(xì)辨認(rèn)標(biāo)簽，看清名稱及濃度，26使用過(guò)的玻璃儀器的清洗1、一般非計(jì)量玻璃儀器或粗容量?jī)x器，如燒杯、試管、量筒等先用肥皂水刷洗，再用自來(lái)水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗1－2次，倒置晾干。2、容量分析儀器，如滴定管、容量瓶等先用自來(lái)水沖洗，瀝干后，浸于鉻酸洗液浸泡數(shù)小時(shí)。然后用自來(lái)水反復(fù)沖洗干凈，干燥備用。3、用完比色杯后，立即用自來(lái)水反復(fù)沖洗。切忌用刷子、粗糙的布或紙擦拭。洗凈后，倒置晾干備用。使用過(guò)的玻璃儀器的清洗27吸量管的種類和使用

1、分類1）奧氏吸量管供準(zhǔn)確量取0.50、1.0、2.0、3.0ml液體所用。這種吸量管只有一個(gè)刻度，當(dāng)放出所量取的液體時(shí)，管尖余留的液體必須吹入容器內(nèi)。2）移液管常用量取50.0、25.0、10.0、5.0、2.0、1.0ml的液體，這種吸量管只有一個(gè)刻度，放液時(shí)，量取的液體自然流出后，管尖需在容器內(nèi)滯留15秒。注意管尖殘留的液體不要吹出。3）刻度吸量管供量取10ml以下任意體積的溶液。一般刻度包括尖端部分。將所量液體全部放出后，還需要吹出殘留于管尖的溶液。此類吸量管為“吹出式”，吸量管上端標(biāo)有“吹”字。未標(biāo)“吹”字的吸量管，則不必吹出管尖的殘留液體。2、使用原則量取整數(shù)量液體，并且取量要求準(zhǔn)確時(shí)，應(yīng)該選用奧氏吸量管。量取大體積時(shí)要用移液管。同一定量實(shí)驗(yàn)中，如欲加同種試劑于不同的管中，并且取量不多時(shí)，應(yīng)選擇一支與最大取液量接近的刻度吸量管。吸量管的種類和使用

1、分類28吸量管的使用

1、正確拿法中指和拇指拿住吸管上端，食指頂住吸量管頂端2、取液用橡皮球吸液體至刻度上，眼睛看著液面上升；吸完后用食指頂住吸量管上端。3、調(diào)刻度吸量管與地面保持垂直，下口與試劑瓶接觸，并成一角度；用食指控制液體下降至最上一刻度處；液體凹面、刻度和視線應(yīng)在一水平面上。4、放液吸量管移入準(zhǔn)備接受溶液的容器中，仍使其出口尖端接觸器壁，并成一角度，吸量管仍保持垂直。放開(kāi)食指，使液體自動(dòng)流出。奧氏吸量管和刻度到底的吸量管應(yīng)吹出尖端殘留的液體。移液管應(yīng)最后靠壁15秒。吸量管的使用

1、正確拿法中指和拇指拿住吸管上端，食指頂29一、分光光度法原理光的本質(zhì)是一種電磁波，具有不同的波長(zhǎng)，可見(jiàn)光的波長(zhǎng)范圍在400～760nm。波長(zhǎng)范圍200～400nm的光線稱為紫外光。有色物質(zhì)可以選擇性地吸收一部分可見(jiàn)光的光能量而呈現(xiàn)不同顏色，某些物質(zhì)卻能特征性地選擇吸收紫外光的能量。一、分光光度法原理30物質(zhì)吸收由光源發(fā)出的某些波長(zhǎng)的光可形成特定的吸收光譜。由于物質(zhì)的吸收光譜與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且在一定的條件下其吸收程度與該物質(zhì)的濃度成正比，所以可利用物質(zhì)的特定吸收光譜對(duì)其進(jìn)行定性和定量的分析。分光光度法就是利用各種物質(zhì)所具有的這種吸收特征所建立起來(lái)的分析方法。物質(zhì)吸收由光源發(fā)出的某些波長(zhǎng)的光可形成特定的吸收光譜。由于物31吸收光譜和物質(zhì)的定性分析

用各種不同波長(zhǎng)的光線作為入射光測(cè)定物質(zhì)的吸光度（Absorbance），然后以波長(zhǎng)（λ）為橫軸，相應(yīng)的吸光度（A）為縱軸，按結(jié)果作圖，可得到該物質(zhì)的吸收光譜曲線。吸收光譜曲線是物質(zhì)的特征曲線。在一定的溫度、pH值等條件下吸收光譜的曲線形狀是一定的。在吸收光譜中，往往可找到一個(gè)或幾個(gè)吸收最大值，該處的波長(zhǎng)稱為最大吸收波長(zhǎng)（λmax）。物質(zhì)不同，它們的最大吸收波長(zhǎng)也往往不同。吸收光譜和物質(zhì)的定性分析32物質(zhì)用分光分析定性主要根據(jù)是吸收光譜存在的特征吸收。

常用定性方法：

1、比較吸收光譜曲線。2、比較最大吸收波長(zhǎng)。3、比較吸光度比值。物質(zhì)用分光分析定性主要根據(jù)是吸收光譜存在的特征吸收。常用定33Beer—Lambert定律和物質(zhì)的定量分析

原理一束平行光照射至溶液時(shí)、一部分光被吸收、一部分光可透過(guò)該溶液、不同物質(zhì)光的吸收程度是不同的。物質(zhì)對(duì)單色光吸收的強(qiáng)弱以及溶液濃度與也曾厚度的關(guān)系，服從物質(zhì)對(duì)光吸收的定量定律，即Beer—Lambert定律，其表達(dá)式為：A＝KCL或LgI0/I＝KCLBeer—Lambert定律的含義為一束單色光通過(guò)溶液解質(zhì)后，光能被吸收的程度與溶液的濃度和厚度成正比。如果實(shí)驗(yàn)中的厚度不變，則A＝KCA為吸光度，T為透光度，即I/I0，A和T是負(fù)對(duì)數(shù)的關(guān)系。吸收系數(shù)K實(shí)際上式物質(zhì)在單位濃度和單位厚度下對(duì)入射光的吸光度，在一定波長(zhǎng)下，K越大，表示物質(zhì)對(duì)光的吸收越強(qiáng)。Beer—Lambert定律和物質(zhì)的定量分析原理34常用的以Beer—Lambert定律為依據(jù)的定量分析方法Beer—Lambert定律原理是討論有色溶液對(duì)單色光的吸收程度與溶液的濃度及液層厚度間的定量關(guān)系。1、標(biāo)準(zhǔn)曲線法。配制一系列已知不同濃度的測(cè)定物溶液，按一定方法顯色后，分別用分光光度計(jì)測(cè)得吸光度。以吸光度為縱座標(biāo)、濃度為橫座標(biāo)，繪制A—C曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下，測(cè)定被測(cè)溶液得吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可找出相應(yīng)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與測(cè)定管的測(cè)定應(yīng)在同一儀器上進(jìn)行。常用的以Beer—Lambert定律為依據(jù)的定量分析方法Be352、標(biāo)準(zhǔn)管法。將標(biāo)準(zhǔn)品（已知濃度Cs）與樣品在相同條件下顯色并測(cè)得吸光度。因?yàn)樵诖讼?，兩者的K值相等，所以可根據(jù)

Cx＝(Cs/As)Ax

求得樣品溶液得濃度Cx。式中As和Ax分別為標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管的吸光度。

3、克分子吸光系數(shù)ε法。當(dāng)濃度為IM，溶液厚度為1cm，吸光系數(shù)用ε表示，ε亦稱為克分子吸光系數(shù)。在已知ε得情況下，可根據(jù)下式求出測(cè)定液的物質(zhì)濃度

C＝A/ε2、標(biāo)準(zhǔn)管法。將標(biāo)準(zhǔn)品（已知濃度Cs）與樣品在相同條件下顯色36分光光度計(jì)原理：分光光度計(jì)形式較多，但基本結(jié)構(gòu)和原理相似，可用下圖表示：儀器中光源經(jīng)過(guò)單色器中的單色原件（如棱鏡），所得到的單色光（入射光）進(jìn)入樣品室，透出的光被受光器（光電池或光電色）產(chǎn)生光電流，放大后在測(cè)量?jī)x上顯示出吸光度（A）或透光度（T）儀器的光電管或光電池對(duì)不同波長(zhǎng)的光敏感度不一樣，在制作吸收曲線時(shí)應(yīng)注意每換一次波長(zhǎng)，都應(yīng)將空白溶液的吸光度調(diào)整到0。光源單色器受光器測(cè)量器樣品室分光光度計(jì)原理：分光光度計(jì)形式較多，但基本結(jié)構(gòu)和原理相似，37分光光度計(jì)的類型1、單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)2、單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)3、雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)最簡(jiǎn)單常見(jiàn)的光度計(jì)是單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)，如751、721等