口蹄疫監(jiān)測(cè)診斷作業(yè)指導(dǎo)書

1、口蹄疫監(jiān)測(cè)診斷作業(yè)指導(dǎo)書一、口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)1. 適用范圍用于檢測(cè)豬、牛、羊血清中的口蹄疫病毒 VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體，與 豬、牛、羊口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒 聯(lián)合使用，可區(qū)分口蹄疫病毒感染動(dòng)物及疫苗免疫動(dòng)物。 檢測(cè)豬血清 應(yīng)用豬口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑盒； 檢測(cè)牛、羊血清應(yīng)用牛、羊口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸 附試驗(yàn)診斷試劑盒。2. 檢測(cè)試劑口蹄疫病毒 VP1 抗原包被板、 樣品稀釋液、 酶結(jié)合物、陰性對(duì)照、 VP1陽性對(duì)照、酶結(jié)合物稀釋液、TMB底物A液、TMB底物B液、終 止液（I.OMHZSQ

2、）、濃縮洗滌液、稀釋板、一次性封板膜、微孔定位 標(biāo)簽。3. 檢測(cè)步驟3.1使用前將試劑盒恢復(fù)到室溫，避免陽光直射或放置在30C以上的環(huán)境中。3.2 取出試劑盒中的樣品稀釋液。 A1、 B1 兩孔作為陰性對(duì)照，CI 、 D1 兩孔作為陽性對(duì)照孔，其余孔作檢測(cè)孔，每孔一個(gè)樣品。3.3 在稀釋板的各孔中加 200樣品稀釋液。在相應(yīng)各孔中分別加入 10 此對(duì)照血清或被檢血清樣品。用加樣器重復(fù)吹吸數(shù)次。稀釋每 個(gè)樣品時(shí)必須使用不同的吸頭。3.4 取出抗原包被板。3.5 分別從稀釋板上取稀釋后的對(duì)照血清和被檢血清各100 此，加至抗原包被板的相應(yīng)孔中，加益或封膜后，置37 士 2C下孵育60 士 5 分鐘

3、。3.6 洗滌工作液配制： 按需要量， 用去產(chǎn)離子水或雙蒸水將洗滌 液作 25 倍稀釋。3.7 用洗滌工作液洗滌抗原包被板， 每孔 300 噸，洗滌 6 次，拍 干。3.8 酶結(jié)合物工作液配制：用酶結(jié)合物稀釋液將酶結(jié)合物作 100 倍稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.9每孔加入100此酶結(jié)合物工作液，加蓋或封膜后，置37 士 2C 下孵育 30 2 分鐘。3.10 重復(fù) 3.7。3.1仃MB底物工作液配制：將TMB底物B液和TMB底物A液等量 混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.12每孔加入100此底物工作液，加蓋或封膜后，置37 士 2C下 孵育 15士 1 分鐘。3.13 每孔加入 100此終止液，并輕輕振蕩混勻。3.

4、14在15分鐘內(nèi)，用酶聯(lián)讀數(shù)儀測(cè)定在450nln波長下的OD直。結(jié)果判定 4.1 豬口蹄疫病毒 vPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果判定：4.1.1陰性對(duì)照孔平均0D值應(yīng)續(xù)0.15，每個(gè)陽性對(duì)照孔0D值 應(yīng)妻0.5，且簇2.0。否則，試驗(yàn)無效。臨界值=0.23X陽性對(duì)照孔 平均OD值。4.1.2被檢樣品孔OD直臨界值時(shí)、判為陰性，即為抗口蹄疫病 毒 VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。4.1.3被檢樣品孔OD直臨界值，判為陽性。4.1.4 對(duì)判定結(jié)果為陽性的樣品， 應(yīng)用 2個(gè)孔進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。 重 復(fù)檢測(cè)后，若至少有一個(gè)孔為陽性，則判為口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白 抗體陽性， 若兩孔均為陰性， 則判為口蹄疫病毒 VP

5、I 結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰 性。4.1.5 當(dāng)豬口蹄疫病毒 vPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷 試劑盒與豬口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷試劑 盒聯(lián)合使用時(shí)，按下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行最終判定 4.2 牛、羊口蹄疫病毒 VPI 結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)結(jié)果判定：4.2.1陰性對(duì)照孔平均O值應(yīng)W 0.2，每個(gè)陽性對(duì)照孔 OD直應(yīng) 0.5，且W 2.0。否則，試驗(yàn)無效。臨界值=0.23x陽性對(duì)照孔平均OD直。4.2.2被檢樣品孔OD值V臨界值時(shí)，判為陰性，即為抗口蹄疫 病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。4.2.3被檢樣品孔OD直臨界值，判為陽性。4.2.4 對(duì)判定結(jié)果為陽性的樣品， 應(yīng)用 2個(gè)孔進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。 重 復(fù)檢測(cè)后， 若至少有一個(gè)孔為陽性， 則判為口蹄疫病毒 VPI 結(jié)構(gòu)蛋白 抗體陽性，若兩孔均為陰性，則判為口蹄疫病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性。