高分辨率熔解曲線分析技術(shù)用于乙醇脫氫酶1B和乙醛脫氫酶2基因的快速分型（可編輯）

1、高分辨率熔解曲線分析技術(shù)用于乙醇脫氫酶1b和乙醛脫氫酶2基因的快速分型 南方醫(yī)科大學(xué)級(jí)碩士學(xué)位論文高分辨率熔解曲線分析技術(shù)用于乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶基因的快速分型 ?課題來(lái)源:十一五國(guó)家支撐計(jì)劃課題.和國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃計(jì)劃,.業(yè) 稱專 名 醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)位申請(qǐng)人 袁曉文指 導(dǎo) 教 師 徐湘民教授周萬(wàn)軍博士龔瑤琴教授答辯委員會(huì)主席鄔玲仟教授答辯委員會(huì)成員王紅艷教授袁慧軍教授趙彥艷教授論文評(píng)閱人 白曉春教授孫筱放教授日年月 深圳高分辨率熔解曲線分析技術(shù)用于乙醇脫氫酶 和乙醛脫氫酶基因的快速分型碩士研究生:袁曉文導(dǎo)師:徐湘民教授摘要背景與目的乙醇脫氫酶,和乙醛脫氫酶,是在人體內(nèi)乙醇代謝途徑的兩個(gè)

2、關(guān)鍵酶,負(fù)責(zé)催化人體的乙醇分解代謝,即催化乙醇向乙醛轉(zhuǎn)化以及乙醛向乙酸鹽分解的關(guān)鍵酶。的活性增強(qiáng)可以加速乙醇向乙醛轉(zhuǎn)化,而活性的降低則使乙醛向乙酸鹽轉(zhuǎn)化受到限制,同樣使乙醛的濃度顯著增高。乙醛濃度的增加與酒精相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。和基因多態(tài)性具有種族特異性,在不同種族人群中分布是不一樣的。據(jù)研究顯示,亞洲人的酒精依賴性疾病主要與和基因變異密切相關(guān)。基因位于號(hào)染色體長(zhǎng)臂區(qū)帶,基因在第號(hào)外顯子發(fā)生變異,形成,導(dǎo)致亞基的第位氨基酸從精氨酸轉(zhuǎn)換為組氨酸從而形成艮,酶活性增高。基因位于號(hào)染色體長(zhǎng)臂區(qū)帶,基因在第號(hào)外顯子發(fā)生變異,形成,與此同時(shí),酶的第位氨基酸由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?。野生型具有活?

3、突變型沒有酶活性。和基因的變異會(huì)使酶代謝活性改變,導(dǎo)致飲酒在不同種族和個(gè)體間酒精代謝發(fā)生改變。這些年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)這兩種變異與摘要各個(gè)組織器官的癌變,乙醇相關(guān)的肝臟病變、遲發(fā)型老人癡呆、冠心病、型糖尿病并發(fā)癥、血液中膽固醇水平都有不同程度的聯(lián)系。因此,一種準(zhǔn)確快速的基因型分析方法對(duì)于有關(guān)的臨床研究和人群普查等廣闊研究領(lǐng)域是十分必要的。近年發(fā)展起來(lái)的高分辨率熔解曲線分析,技術(shù)已被證明是一種具有低成本、高通量、速度快、操作簡(jiǎn)便、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)的用于基因突變檢測(cè)、基因分型和檢測(cè)的工具。不同核酸分子的片段長(zhǎng)短、堿基組成、分布等是不同的,因此在加熱變性后所有的雙鏈分子都會(huì)有自己相應(yīng)的熔解曲線形狀和位置。當(dāng)

4、擴(kuò)增目的片段含有突變/時(shí),目的產(chǎn)物經(jīng)過變性.復(fù)性會(huì)產(chǎn)生異源雙鏈,異源雙鏈中突變/位點(diǎn)是不匹配的,所以雙鏈在升溫過程中先解鏈,此時(shí)熒光染料從局部解鏈的雙鏈分子上釋放出來(lái),根據(jù)熒光強(qiáng)度與溫度曲線圖可以判斷是否具有突變/,同時(shí)不同的位點(diǎn)和雜合度都會(huì)影響熔解曲線的峰形。分析過程中,隨著雙鏈分子的擴(kuò)增,由于熒光染料結(jié)合到重新產(chǎn)生的雙鏈分子,熒光信號(hào)不斷的增強(qiáng)。當(dāng)進(jìn)入擴(kuò)增平臺(tái)期時(shí),熒光信號(hào)同時(shí)也進(jìn)入了平臺(tái)期。隨著溫度的不斷升高,雙鏈逐漸解開,結(jié)合上的飽和染料被釋放出來(lái),熒光信號(hào)逐漸減弱。直到溫度升到,所有的雙鏈分子完全解開,通過檢測(cè)熒光值,建立熒光值隨溫度升高的變化過程得到熔解曲線。技術(shù)的基本原理就是根據(jù)

5、熔解曲線的差異性來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行區(qū)分。以往的變異檢測(cè)技術(shù),限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性,單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析,兩對(duì)交叉引物、 . ,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度多態(tài)性,變性高效液相色譜等具有一定的局限性,如耗時(shí)長(zhǎng),操作繁瑣,準(zhǔn)確度低,成本相對(duì)較高等。與這些方法相比,分析方法具有一定的優(yōu)勢(shì):成本低,只需飽和染料不需要昂貴的探針;在反應(yīng)結(jié)束后,不需要后續(xù)工作而碩士學(xué)位論文直接進(jìn)行熔解曲線反應(yīng);快速、高通量,一次可以同時(shí)檢測(cè)或個(gè)樣本;閉管操,防止樣本遭受污染;經(jīng)過分析處理后的擴(kuò)增產(chǎn)物還可以直接進(jìn)行測(cè)序,十分方便快捷。具有較高的敏感性和特異性,目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、畜牧業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域的研究工作中?；谏鲜鎏攸c(diǎn),

6、本研究擬應(yīng)用技術(shù),建立和的檢測(cè)方法,對(duì)預(yù)測(cè)個(gè)體患酒精相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)和研究酶變異與酒精相關(guān)疾病的關(guān)系提供方便,同時(shí)為中國(guó)南方酒精相關(guān)疾病患者的遺傳咨詢、臨床診斷提供有用的信息。材料與方法.標(biāo)本:共收集例全血標(biāo)本。采用標(biāo)準(zhǔn)的飽和酚/氯仿法提取外周血中的基因組。.分子分析方法:針對(duì)和基因以及和變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增體系及優(yōu)化條件。通過測(cè)序獲得和各種基因型樣品。建立檢測(cè)和基因的高分辨率熔解曲線分析技術(shù)。針對(duì)和基因以及和變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)分析的引物,利用經(jīng)測(cè)序已知的基因型樣品優(yōu)化分析條件,從而建立和基因的高分辨率熔解曲線分型的分析方法。根據(jù)的分析結(jié)果,從各種基因型中選取一定數(shù)量的樣品進(jìn)行測(cè)序分析,以驗(yàn)證評(píng)價(jià)該方法的

7、準(zhǔn)確性。并且選取每種和基因野生純合子和突變純合子各個(gè)樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)對(duì)基因的野生純合子和突變純合子樣本進(jìn)行了倍稀釋法,進(jìn)行個(gè)濃度檢測(cè),探討該方法檢測(cè)敏感性。.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:對(duì)構(gòu)建的和基因已知突變分型檢測(cè)體系進(jìn)行準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性分析。利用部分樣本直接測(cè)序?qū)Ρ葋?lái)驗(yàn)證其準(zhǔn)確性;采用重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以確定該體系的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。同時(shí)分析東莞地區(qū)隨機(jī)漢族人群的摘要和的基因頻率和基因型頻率,并應(yīng)用矛檢驗(yàn)該群體樣品是否符合?平衡。使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件為.。.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析、總結(jié)。結(jié)果建立了穩(wěn)定可靠的雙重檢測(cè)體系。此體系中,所選取的擴(kuò)增目的序列以及所設(shè)計(jì)的引物的特異性高。和基因的野生純合子/,雜合子/,突變純

8、合子/三種基因型能夠在上進(jìn)行明顯的區(qū)分。用盲法分析對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià),用此方法分析東莞地區(qū)份漢族人基因組樣品,從每組基因型中隨機(jī)選出部分樣品進(jìn)行測(cè)序?qū)φ?結(jié)果符合率為%,證實(shí)了該方法的準(zhǔn)確性很好;進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)三次實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)的范圍從.%到.%,證實(shí)了該方法的穩(wěn)定性很好。在倍稀釋試驗(yàn)中,個(gè)濃度均可以準(zhǔn)確分型,可以知道.濃度仍然可以用于此檢測(cè)體系。礦檢驗(yàn)結(jié)果顯示所選群體符合平衡,與基因頻率與以前所報(bào)道的數(shù)據(jù)基本符合,從另一個(gè)方面說明了該方法的準(zhǔn)確性。結(jié)論飲酒已被認(rèn)為是危害人類健康的嚴(yán)重危險(xiǎn)因素,容易導(dǎo)致多種酒精相關(guān)疾病。酒精在體內(nèi)劑量效應(yīng)和作用時(shí)間,不僅僅與酒量和飲酒頻率相關(guān),還與易感基因和

9、代謝能力有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。和兩種基因的變異與酒精依賴性疾病密切相關(guān),所以枷和兩種基因進(jìn)行快速分型,在中國(guó)人群中進(jìn)行快速篩查,不僅能夠?qū)凭嚓P(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估,還有助于研究和基因與其他相關(guān)疾病的致病機(jī)理。高分辨率熔解曲線分析技術(shù)是近幾年興起一種基于核酸的物理性質(zhì)的基因突變檢測(cè)技術(shù)。這種檢測(cè)技術(shù)沒有局限于突變堿基位點(diǎn)與類型,不需使用序列特異性探針,在結(jié)束后直接進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析來(lái)完成對(duì)樣品基因型的分析。因其操作簡(jiǎn)便、快速,成本低,結(jié)果準(zhǔn)確,高通量,并且閉管碩士學(xué)位論文操作而備受關(guān)注。高分辨率熔解曲線分析技術(shù)只需要在普通基礎(chǔ)上增加一個(gè)飽和染料既可以進(jìn)行未知突變掃描,也可以對(duì)已知突變進(jìn)行基因分型,還

10、可以分析短片段重復(fù)序列。分析的這些優(yōu)勢(shì)使它具有極強(qiáng)的可操作性,近年來(lái)成為國(guó)內(nèi)外新興的各研究領(lǐng)域?qū)W、方法學(xué)研究和應(yīng)用熱點(diǎn)。本課題研究中建立的針對(duì)和基因的高分辨率熔解曲線分析檢測(cè)方法能夠快速、準(zhǔn)確地同時(shí)對(duì)和基因進(jìn)行檢測(cè),并且實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性好、敏感性高、體系可靠。本研究對(duì)中國(guó)南方人群進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的人中不存在/和/組合的個(gè)體,所以推測(cè)這種基因型組合在中國(guó)南方是很少見的。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,等位基因會(huì)增加食道癌,肝癌等癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性。同時(shí)很多的研究表明彳刪?/叼或彳刪.吲叼個(gè)體由于乙醛的積累導(dǎo)致其患有食道癌等癌癥的風(fēng)險(xiǎn)更大,然而同時(shí)對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行聯(lián)合研究的很少,因此同時(shí)納入和彳刪兩基因的病例

11、.對(duì)照研究是下一步進(jìn)行疾病風(fēng)險(xiǎn)研究的重點(diǎn)工作。本研究為和基因的檢測(cè)建立了一種簡(jiǎn)單、高通量、快速、經(jīng)濟(jì)和靈敏的檢測(cè)方法,有助于酒精相關(guān)疾病的遺傳學(xué)咨詢,流行病學(xué)調(diào)查,并為研究和基因與其他相關(guān)疾病的關(guān)系提供了一項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)手段。本研究方法的一些處理技巧如改變擴(kuò)增子長(zhǎng)度以及加尾處理具有普遍的代表性與通用性,可為其它基因同時(shí)分型的檢測(cè)方法研究提供借鑒與參考。關(guān)鍵詞 乙醇脫氫酶:乙醛脫氫酶;高分辨率熔解曲線分析;基因分型碩士學(xué)位論文三 一 ?: .?:.。, ,. 一,. ,. 彳三舊. ., .晰 , ., , , , , .,.?.?, , . ,.,. :. ., 謝, . , . . , /, ,

12、、析,. , ,.晰 :、訪 ;加碩士學(xué)位論文? ; ;, .曲. ,., ?.: , ./. 彳加. . . , ?/,?/., ,?/./. .,? . ,.?/叼? .?產(chǎn) . . 娃; , . . % . . . % .%. / /?,., , , , .? . . . , 札.,.,碩士學(xué)位論文,. , ,. ,.,. ,. ,曲 .,/. . 彳聊 . 、 ./. . , . , , ,.: ; ;碩士學(xué)位論文目 錄摘要.第一章 引言第二章實(shí)驗(yàn)材料.實(shí)驗(yàn)儀器及分析軟件?.實(shí)驗(yàn)試劑:.:外周血基因組提取試劑.常規(guī)試劑。.電泳試劑?。.高分辨率熔解曲線分析試劑。.外周血樣品及樣品?.已

13、知基因型樣品. .方法學(xué)評(píng)價(jià)所用基因型樣品?第三章實(shí)驗(yàn)方法?.技術(shù)路線圖?.樣品基因組的提取及濃度測(cè)定.酚/氯仿法抽提基因組.基因組濃度測(cè)定:.高分辨率熔解曲線分析方法的建立和評(píng)價(jià).高分辨率熔解曲線分析方法的建立。.雙重高分辨率熔解曲線分析方法的評(píng)價(jià).等位基因頻率的計(jì)算和?平衡的判定?.結(jié)果分析?.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析目錄.高分辨率熔解曲線分析檢測(cè)標(biāo)本結(jié)果分析.第四章實(shí)驗(yàn)結(jié)果?.雙重高分辨率熔解曲線分析方法檢測(cè)和已知基因型的結(jié)果.雙重高分辨率熔解曲線分析方法的評(píng)價(jià)。.雙重高分辨率熔解曲線分析檢測(cè)體系的靈敏度和準(zhǔn)確性的評(píng)價(jià).雙重高分辨率熔解曲線分析體系的重復(fù)性和穩(wěn)定性的評(píng)價(jià).雙重高分辨率熔解曲線分析體系的

14、敏感性評(píng)價(jià)?.各等位基因頻率和.平衡的判定第五章分析與討論?.第六章結(jié)論?.參考文獻(xiàn)附 錄.攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表論文?中英文縮略詞表?致 謝。?。學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明?.碩士學(xué)位論文第一章引言年月日,參加人類基因組計(jì)劃的國(guó)美國(guó)、英國(guó)、法蘭西共和國(guó)、德意志聯(lián)邦共和國(guó)、日本和中國(guó)科學(xué)家共同宣布,人類基因組草圖的繪制工作已經(jīng)完成。年月日,這國(guó)還公布了人類基因組精細(xì)的工作框架圖及其初步的注解結(jié)果。整個(gè)人類基因組測(cè)序工作的完成,為人體生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究開辟了一個(gè)新紀(jì)元,它不僅對(duì)生命本質(zhì)、人類進(jìn)化、生物遺傳一群體差異、發(fā)病機(jī)理、疾病預(yù)防與治療、新藥開發(fā)等眾多領(lǐng)域具有重要意義,并且對(duì)整個(gè)生物學(xué)發(fā)

15、展產(chǎn)生巨大的影響,標(biāo)志著人類生命科學(xué)進(jìn)入一個(gè)新時(shí)代。然而,僅依靠測(cè)定基因組序列來(lái)詳細(xì)闡述人類基因編碼序列及非編碼序列的功能是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,此時(shí)還需要通過“后基因組研究去揭示。人類基因組計(jì)劃的主要目標(biāo)是解讀人類基因組的序列,而后基因組計(jì)劃是以了解基因組的功能及調(diào)控機(jī)制為目標(biāo),其核心科學(xué)問題主要包括:人類基因組的多樣性計(jì)劃,基因組的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能,以及模式生物基因組功能研究等。單核苷酸多態(tài)性 ,主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的序列多態(tài)性。人類基因組序列已鑒定萬(wàn),其中萬(wàn)多位于基因編碼區(qū),一些可以影響到個(gè)體的表面特征、疾病的風(fēng)險(xiǎn)以及對(duì)環(huán)境的反應(yīng)】。隨著對(duì)檢測(cè)和分析技術(shù)的不

16、斷發(fā)展,特別是與芯片等技術(shù)相結(jié)合,現(xiàn)在已成為第三代遺傳標(biāo)記,可以對(duì)疾病相關(guān)基因進(jìn)行定位研究,尤其是多基因遺傳病基因的定位,并將逐漸取代目前常用的第二代遺傳標(biāo)記微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)而進(jìn)入基因應(yīng)用研究的領(lǐng)域。長(zhǎng)期酒精攝入可引起人體眾多系統(tǒng)損害。近年來(lái),由于所謂的“酒桌文化的快速發(fā)展以及酒精的濫用,酒精性肝病的患者大大增加,過去比較少見的酒精性心肌病患者也呈增加了很多。酒精的過渡累積還可引起動(dòng)脈粥樣硬化,消化道癌,高血壓,老人癡呆,冠心病等多種疾病。酒精的化學(xué)成分是乙醇,是第一章引言一種能與水完全互溶的極性小分子物質(zhì),口服攝入后,它很快經(jīng)口腔、食道、胃、腸等多處吸收,在消化道內(nèi)可以直接從生物膜進(jìn)入血液循環(huán)

17、,整個(gè)消化道對(duì)乙醇都有吸收作用,然后通過胃腸黏膜的擴(kuò)散借助血液循環(huán)均勻、迅速運(yùn)輸?shù)饺砀鹘M織器官進(jìn)行代謝利用。肝臟是乙醇代謝的主要器官,胃和腸道吸收的酒精經(jīng)靜脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟,大部分的乙醇都在肝臟代謝,其代謝途徑主要有以下條:乙醇脫氫酶乙醇氧化體系、微粒體乙醇氧化體系、氧化酶一過氧化氫酶體系和黃嘌呤氧化酶一過氧化氫酶體系。其中通過乙醇脫氫酶乙醇氧化體系途徑代謝的乙醇約占代謝的%【。 ,和 ,是該代謝途徑的關(guān)建酶,所以這兩種酶是人體內(nèi)參與乙醇代謝的主要酶。乙醇脫氫酶是催化乙醇向乙醛轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶,乙醛脫氫酶則是乙醛氧化為乙酸的關(guān)鍵酶,最終乙酸被氧化為水和二氧化碳進(jìn)行代謝如圖.。是一種廣泛專一性的含鋅

18、金屬酶。以、或?yàn)檩o酶在生物催化和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有較為廣泛的應(yīng)用。的活性增強(qiáng)可以加速乙醇向乙醛轉(zhuǎn)化,而活性的降低則使乙醛向乙酸鹽轉(zhuǎn)化受到限制,同樣使乙醛的濃度顯著增高,導(dǎo)致乙醛在人體內(nèi)累積。乙醛能夠與機(jī)體多種蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合,產(chǎn)生乙醛一蛋白質(zhì)復(fù)合物,引起蛋白酶失活、修復(fù)蛋白功能損害,自身抗體形成、谷胱甘肽耗竭、線粒體損傷和氧利用障礙,進(jìn)而對(duì)人體組織和器官有高度的致毒,致突變,致癌的作用【】。此外,乙醛還具有擬交感活性作用,刺激肥大細(xì)胞釋放血管活性物質(zhì)使血管舒張而出現(xiàn)臉紅、出汗、發(fā)音困難、心動(dòng)過速、惡心和低血壓【】。因此,乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的代謝活性高低會(huì)影響到體內(nèi)乙醇的代謝快慢,進(jìn)而直接影

19、響到人體的健康狀態(tài)。碩士學(xué)位論文胎兒圖.乙醇在肝臟內(nèi)的氧化代謝通路.人類基因位于.,可以編碼同源或異源二聚體的同工酶。同工酶是二聚體,有多種同工酶,常見的種根據(jù)其在肝臟內(nèi)不同的催化動(dòng)力特性和電泳泳動(dòng)度以及對(duì)乙醇的不同的氧化速率,可分為型:型包括甜亞基, 亞基,.亞基,型為.亞基,型為廿亞基。型豐要在肝臟表達(dá),它的米氏常數(shù)值最低而對(duì)乙醇的特異性最高,所以在乙醇代謝中起關(guān)鍵作用,種結(jié)構(gòu)基因,分別編碼【、丫亞單位。?基因在染色體上相鄰近,它們有%的序列是一樣的,組成一個(gè)約的族群,個(gè)基岡存在高度同源性,它們的長(zhǎng)度均約 ,而且均包含個(gè)外顯子?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引言第一章和存在基因多態(tài)現(xiàn)象,不同基因型的和同工酶催化

20、乙醇向乙醛轉(zhuǎn)化的活性有很大不同。但到目前為止的所有研究中,在任何種族中尚未發(fā)珊、彳刪鰳冊(cè)存在多態(tài)性】。基因位點(diǎn)有三個(gè)等位基因,即彳劇宰,和,分別編碼卜、,個(gè)亞單位,他們亞基隨機(jī)組合可形成種基因型:/、/、/、/、/、/。為野生型等位基因,它的活性是極低的,是第外顯子發(fā)牛點(diǎn)突變,導(dǎo)致的第位氨基酸由精氨酸轉(zhuǎn)換為組氨酸從而形成,雖變異,這種修飾產(chǎn)牛了一個(gè)的酶切位點(diǎn)。等位基因個(gè)體比等位基因個(gè)體乙醇脫氫酶活性強(qiáng)倍【。等位基因最早是在美國(guó)印第安納波利斯市的黑人群體中發(fā)現(xiàn),以后研究表明,該等位基因在美國(guó)西北部的土著人中也有表達(dá),但是在歐美白種人和亞洲的同本人和中國(guó)人的發(fā)牛頻率很低,均小于%。彳刪佃宰則是在第

21、外顯子發(fā)生 點(diǎn)突變形成的,同時(shí)導(dǎo)致第位氨基酸由精氨酸變?yōu)榘腚装彼?產(chǎn)生一個(gè) 的酶切位點(diǎn)。根據(jù)資料顯示歐美白種人的等位基因頻率在%以上,而在亞洲人中的等位基因頻率大于%。所以亞洲人飲酒后比歐美人更容易使乙醇代謝為乙醛,發(fā)生臉紅,頭暈等酒精反應(yīng)。因此,在中國(guó)人群中又的研究豐要涉及和兩種等位基因?；蛭挥?有和兩種等位基因,分別編碼,丫亞基。是野牛型等位基因,彳劇叼黝刖,在第外顯子發(fā)牛點(diǎn)突變,同時(shí)的位氨基酸由纈氨酸變?yōu)榧琢虬彼嵝纬裳?。等位基因個(gè)體比等位基因個(gè)體乙醇脫氫酶活性強(qiáng).倍【。等通過對(duì)臺(tái)灣的漢族人的乙醇代謝相關(guān)酶基因變異和酗酒癥之間的關(guān)聯(lián)研究,發(fā)現(xiàn)基因變異對(duì)是否成為酗酒者基本不起作用。所以研究

22、型變異與乙醇所致疾病的關(guān)系主要是彳刖曰車,和兩種等位基因。迄今為止有種同工酶,常見的有種,位于肝細(xì)胞的線粒體內(nèi),對(duì)乙醛有較低的值,其余三個(gè)同工酶均位于包漿,對(duì)乙醛碩士學(xué)位論文的值是的一倍,因此推測(cè)他在體內(nèi)對(duì)乙醛的氧化不起主要作用一。位于.,;和兩種等位基因,是野生型等位基因,是第個(gè)外顯予發(fā)生點(diǎn)突變,與此同時(shí),酶的第位氨基酸由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?。野生壟具有活?突變型不具有活性。但黝三刪?/屹的活性只有/活性的%活性【】。突變型無(wú)活性的等位基因在歐洲人和非洲人中幾乎缺乏,但在亞洲人種基因頻率達(dá)到%【】。和基因位點(diǎn)存在多態(tài)性,不同的等位基因所編碼的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶催化活性差異很大,這種差異與酒

23、精依賴綜合癥密切相關(guān),和基因型的個(gè)體相對(duì)有彳朋,?和不容易發(fā)展成為酗酒者,這些已被大量文獻(xiàn)予以報(bào)道【】。大量研究發(fā)珊朋和基因與各個(gè)組織器官的癌變、乙醇相關(guān)的肝臟病變、冠心病、遲發(fā)型老人癡呆、型糖尿病的并發(fā)癥,多發(fā)性神經(jīng)炎,血液中膽固醇的水平都有程度不同的聯(lián)系【舶】。研究還發(fā)現(xiàn)對(duì)于第一個(gè)催化反應(yīng)來(lái)說,攜帶有低活性的等位基因的個(gè)體會(huì)增加癌癥的風(fēng)險(xiǎn)性,對(duì)于第二個(gè)催化反應(yīng)來(lái)說,攜帶有沒有活性的個(gè)體會(huì)增加癌癥的風(fēng)險(xiǎn)性【。有關(guān)研究對(duì)此兩基因型聯(lián)合研究,各種基因型組合患病危險(xiǎn)性如表.【,我們可以發(fā)現(xiàn)兩酶具有一定活性時(shí)候患病風(fēng)險(xiǎn)性最少。因此,又寸和基因型進(jìn)行鑒定有助于酒精中毒的流行病學(xué)研究和預(yù)測(cè)個(gè)體酒精相關(guān)疾

24、病的風(fēng)險(xiǎn),為研究這兩種基因變異與其他相關(guān)疾病的關(guān)系提供理論基礎(chǔ),為遺傳病的咨詢提供了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的檢測(cè)和基因變異的主要技術(shù)方法是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法,和單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè). ,【,此兩種方法經(jīng)過改進(jìn)后成為分析和基因變異的常規(guī)方法。限制性內(nèi)切酶分析的特異性雖高,但方法繁瑣,且其篩查突變時(shí)常出現(xiàn)酶切不全的現(xiàn)象:是通過擴(kuò)增后泳動(dòng)變位,發(fā)現(xiàn)異常片段后再用測(cè)序證實(shí),檢測(cè)效率低,漏檢率高。后來(lái)又有多種檢測(cè)方法被運(yùn)用于此兩個(gè)基因的分析研究,例如,第一章引言,.等方法,但由于這些技術(shù)操作方法復(fù)雜,效率低以及所需成本高等多種因素,沒有得到推廣使用。近些年來(lái),隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,不少新的自動(dòng)化的方法用于檢測(cè)

25、或基因變異,例如】、分析【、分析【】等方法,但是,上述自動(dòng)化方法因?yàn)槌杀鞠鄬?duì)較高等原因,在大規(guī)模人群篩查或檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)突變中的應(yīng)用受到一定限制。本研究主要運(yùn)用高分辨率熔解曲線 ,分析方法來(lái);不和基因同時(shí)分型。高分辨率熔解曲線分析技術(shù)是近些年新興的一種基因多態(tài)性檢測(cè)新技術(shù)。目前,已廣泛應(yīng)用于突變掃描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等諸多領(lǐng)域,已成為生命科學(xué)研究中的熱點(diǎn)技術(shù)。此方法主要是通過檢測(cè)雙鏈序列之間的解鏈差異來(lái)判斷序列之間的差異。不同核酸分子的片段長(zhǎng)短、序列的含量和分布等是不同的,因此在加熱變性復(fù)性后所有的雙鏈分子都會(huì)有自己相應(yīng)的熔解曲線形狀和位置【。技術(shù)的基本原理就是根據(jù)熔解曲線的不同來(lái)

26、對(duì)樣品各種基因型進(jìn)行區(qū)分。當(dāng)擴(kuò)增片段存在突變/時(shí),目的產(chǎn)物經(jīng)過變性.復(fù)性形成異源雙鏈,異源雙鏈中突變/位點(diǎn)因不匹配的,所以雙鏈在升溫過程中先解鏈,此時(shí)熒光染料從局部解鏈的分子上釋放出來(lái),根據(jù)熒光強(qiáng)度與溫度曲線圖可以判斷是否具有突變/,同時(shí)不同的位點(diǎn)和雜合度都會(huì)影響熔解曲線的峰形。根據(jù)熔解溫度的改變可區(qū)分野生型和純合突變,而根據(jù)熔解曲線形狀不同可區(qū)分野生型與雜合突變型。由于富含區(qū)會(huì)比富含區(qū)熔解溫度高,所以不同樣本的熔解溫度是截然不同的。純合子樣品經(jīng)過擴(kuò)增之后還是純合子,而雜合子樣品經(jīng)過擴(kuò)增之后,產(chǎn)生兩種同源雙鏈和兩種異源雙鏈。分析過程中,隨著擴(kuò)增,熒光染料結(jié)合到重新復(fù)制的雙鏈分子上,熒光信號(hào)逐漸

27、增強(qiáng),進(jìn)入擴(kuò)增平臺(tái)期后,熒光信號(hào)也進(jìn)入平臺(tái)期。隨著溫度的升高,雙鏈逐漸解鏈,結(jié)合的染料釋放出來(lái),熒光值逐漸下降,直到溫度升,所有的雙鏈完全解鏈。通過檢測(cè)熒光值,得到立熒光值隨溫度升高的變化而變化的熔解曲線。當(dāng)產(chǎn)物片段一定的情況下,個(gè)別堿基的差異能夠表現(xiàn)在熔碩士學(xué)位論文解曲線的差異上。高分辨率熔解曲線分析原理圖見圖.,另外,熔解溫度是指當(dāng)一半的雙鏈解開時(shí)候的溫度,也是反應(yīng)不同樣本的重要特性。高分辨率熔解曲線分析的豐要目的是能對(duì)單堿基的變化進(jìn)行區(qū)分,因此對(duì)溫度分辨率的要求很高。目前常規(guī)熔解曲線分析使用的非飽和性染料如等不僅對(duì)有抑制作用,而且在實(shí)驗(yàn)中的使用濃度非常低,不能夠完全結(jié)合到雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小

28、溝。因?yàn)榉秋柡腿玖系氖褂脻舛任催_(dá)到飽和,并且染料本身特性,即在雙鏈解鏈的過程,它能夠從已經(jīng)解鏈的雙鏈片段上脫離下來(lái)同時(shí)并且重新與還沒有解鏈的雙鏈結(jié)合,所以會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確,不能夠真實(shí)的反映熔解情況,嚴(yán)重的影響到檢測(cè)的分辨率。熒光染料等飽和染料逐漸的取代了傳統(tǒng)的非飽和染料,這種飽和染料因?yàn)榻Y(jié)合能力強(qiáng)以及抑制作用很低而熔解曲線分析分辨率更高。雙鏈飽和型熒光染料具有的這些特性使其篩查的靈敏度和特異性很高。與其他的基因多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)相比較,具有以下優(yōu)點(diǎn):成本很低,不需要昂貴的標(biāo)記探針只需要飽和染料;在反應(yīng)結(jié)束后可以直接進(jìn)行熔解曲線反應(yīng)分析,不需要任何的后續(xù)工作;具有高通量特點(diǎn),單管反應(yīng)可以檢測(cè)或個(gè)樣本

29、;所有反應(yīng)都是閉關(guān)操作,極大的降低了樣本被污染的可能性,并且經(jīng)過分析的擴(kuò)增產(chǎn)物還可以進(jìn)行測(cè)序等后續(xù)工作,十分簡(jiǎn)單方便。本研究豐要利用了基因分型中的小片段法快速、準(zhǔn)確的對(duì)和基因同時(shí)分型的方法,有助于預(yù)測(cè)個(gè)體乙醇相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn),并且為其他基因進(jìn)行多重分析提供參考。擴(kuò)增片段越小,更能體現(xiàn)目的片段的序列差異,值差異越大,分型更加明顯。小片段法要求是:.目的擴(kuò)增片段大概是.。為了避免不同空間的溫度差異導(dǎo)致的結(jié)果偏差,加入末端封閉的高低溫內(nèi)標(biāo)來(lái)校正熔解曲線。.在反應(yīng)之前加入雙鏈的飽和染料如 。.模板的量要比較均一,引物具有好的特異性。.反應(yīng)體系為時(shí), 的加入量為。.在反應(yīng)之前應(yīng)加入礦物油防止產(chǎn)物揮發(fā)。本研

30、究采用的是雙重結(jié)合小片段法基因方法快速篩查和基因型,為了避免不同片段間的值的重疊第一章 引言效應(yīng),所以通過改變擴(kuò)增子大小以及通過在引物末端增加或來(lái)增大值差異,以便區(qū)分不同的目的片段。該方法可極大地提高和基因的分型率,可為中國(guó)人大規(guī)模的人群篩查和預(yù)測(cè)乙醇相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)提供有效的技術(shù)手段。?替圖.高分辨率熔解曲線分析原理圖. 受碩士學(xué)位論文表.兩基因各種基因型組合的癌癥患病風(fēng)險(xiǎn)性% :心 ./ .?. . . / .?. . .?.?.?. . . .: ,:第二章實(shí)驗(yàn)材料第二章實(shí)驗(yàn)材料.實(shí)驗(yàn)儀器及分析軟件.凝膠成像系統(tǒng):型,英國(guó)公司產(chǎn)品產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng),英國(guó) 公司。.酸度計(jì):型,英國(guó)公司。.水浴

31、振蕩器:.型,哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。,美國(guó)公司。.高分辨率熔解曲線分析儀.臺(tái)式高速離心機(jī):.型,珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。.電泳儀:型電泳儀,北京六一儀器廠。.純水器: 型,法國(guó)公司。.基因擴(kuò)增儀:型,美國(guó)公司;儀,公司。.低溫冷凍離心機(jī):美國(guó) 公司。.醫(yī)用凈化工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備廠。.和冰箱:華凌.冰箱,中國(guó)華凌集團(tuán)有限公司。.分光光度計(jì):美國(guó)公司。.凈化工作臺(tái):上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。.低溫冰箱:美國(guó) 公司。.制冰機(jī):北京德天佑科技發(fā)展有限公司。.鼓風(fēng)干燥箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。.電子天平:.型,美國(guó)產(chǎn)品。.分析軟件與相關(guān)網(wǎng)站:.引物設(shè)計(jì)軟件: ,.,.。,.

32、高分辨率熔解曲線分析軟件: 碩士學(xué)位論文序列比對(duì)軟件與網(wǎng)站:. ,/:/./.?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件:.。.實(shí)驗(yàn)試劑.外周血基因組提取試劑.無(wú)菌超純水:法國(guó)純水儀自制,.柵,經(jīng)高壓蒸汽滅菌,分裝后,.保存,備用。 . / :稱取. 分析純,汕頭市光華化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;稱量前需高溫烤干置于 燒杯中,加入大約 的去離子水后攪拌溶解;溶解后繼續(xù)加去離子水并將所得溶液定容至 后,分裝后,高壓蒸汽滅菌后,保存,備用。. /胺四乙酸溶液:稱取. ?,置于 燒杯中;加入大約 的去離子水,充分?jǐn)嚢枞芙?然后用;調(diào)整好值后繼續(xù)加去離子水將調(diào)節(jié)值至.大約 所得溶液定容至 ;適量分成小份,高壓蒸汽滅菌后室溫保存,備用。為美

33、國(guó)公司產(chǎn)品。.緩沖液:用/.和/ .以及/ 貯存液配制成。./.溶液:稱量. 堿分裝,北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品置于 燒杯中,加入大約 的去離子水,充分?jǐn)嚢枞芙?溶解后加入約的濃鹽酸調(diào)節(jié)值至.,調(diào)整好值后繼續(xù)加去離子水將所得溶液定容至 ,適量分成小份。高壓蒸汽滅菌后室溫保存,備用。.%/十二烷基硫酸鈉,美國(guó)公司產(chǎn)品:稱量高純度的置于燒杯中,加入大約的超純水,加熱溶第二章實(shí)驗(yàn)材料解,溶解后滴加數(shù)滴濃鹽酸調(diào)節(jié)值至.,調(diào)整好值后繼續(xù)加去離子水將所得溶液定容至后室溫保存。.蛋白酶:美國(guó)公司產(chǎn)品。.緩沖液:用 .和貯存液配制成。.氯仿/異戊醇:分析純,按體積比:配制。./?置于燒醋酸鈉,.:稱量.

34、杯中,加入約的超純水?dāng)嚢枞芙?溶解后加入冰醋酸調(diào)節(jié)值至.:調(diào)整好值后繼續(xù)加去離子水將所得溶液定容至后室溫保存。.飽和酚,.:北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。.無(wú)水乙醇:分析純,汕頭市光華化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。.常規(guī)試劑.寡核苷酸引物:上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,經(jīng)純化。.寶生物工程大連有限公司產(chǎn)品。. :寶生物大連有限公司產(chǎn)品。.普通 :北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。.電泳試劑.瓊脂糖:西班牙公司產(chǎn)品。.溴化乙錠:在 雙蒸水中加入 廣州威佳生/ 物公司,磁力攪拌數(shù)小時(shí)完全溶解,溶解后置棕色瓶中室溫保存,備用。.電泳上樣緩沖液:.%溴酚藍(lán),.%甲苯腈藍(lán),%/蔗糖溶于超純水中。.電泳緩沖液:稱量

35、堿分裝,北京鼎國(guó)生物技術(shù)./有限責(zé)任公司,硼酸汕頭市化工廠,.,置于燒杯中,加入大約的超純水溶解,溶解后繼續(xù)加去離子。水定容至. :,北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,電泳條帶包括:, , , , , , , , 片段。碩士學(xué)位論文.高分辨率熔解曲線分析試劑.美國(guó)公司產(chǎn)品。.液體石蠟:廣東光華化學(xué)廠有限公司產(chǎn)品。.外周血樣品及樣品.已知基因型樣品對(duì)課題組所保存的隨機(jī)人群的樣品進(jìn)行測(cè)序,獲得例樣本,包括扶下基因型? 。產(chǎn)。?凈。?產(chǎn)。/熟/.方法學(xué)評(píng)價(jià)所用基因型樣品.用于本研究的外周血樣本共例標(biāo)本收集自東莞市婦幼保健院,全基因組提取采用經(jīng)典的苯酚/氯仿法抽提。.保存?zhèn)溆谩５谌聦?shí)驗(yàn)方法第三章實(shí)驗(yàn)方

36、法.技術(shù)路線圖鎢童瀲髓證獲得,卑,聿 ?。?年。產(chǎn).彳伽/屹和彳三她叫叼六種基因型的樣品,利用已知基因型的樣品在上優(yōu)化分析條件,進(jìn)行方法的建立;利用已經(jīng)建立的方法分析隨機(jī)人群中的個(gè)個(gè)體的基因型,通過雙盲分析法和不同批次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的分析對(duì)該方法進(jìn)行準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)。本研究所用到的技術(shù)主要包括:技術(shù)、產(chǎn)物測(cè)序技術(shù)、高分辨率熔解曲線分析技術(shù)等。技術(shù)路線見圖.。體系:.拖化:翌敏感性準(zhǔn)確性 重復(fù)性 基因頻率和基因一.:疆縫.:,. ?.進(jìn)綸一一 .疊撿一.一型頻垂的企托圖.技術(shù)路線.樣品基因組的提取及濃度測(cè)定.骨攘仿法抽提基因組:.吸取 抗凝的外周血置于聚丙烯離心管,加入.倍體積滅菌的雙蒸水進(jìn)行溶血反

37、應(yīng),離心分鐘,棄除上清。.重復(fù)洗滌次直到看不到紅色血影,剩下的是所需的白細(xì)胞沉淀。碩士學(xué)位論文緩沖液和.向該離心管內(nèi)加入蛋白酶以及.的%,同時(shí)充分混勻,混勻后水浴震搖消化 .過夜直到肉眼觀察溶液清亮并且沒有沉淀即可。.消化后將液體轉(zhuǎn)移至.離心管,加入倍體積飽和酚,充分混勻,離心分鐘,用已剪的槍頭取上清液移至另一個(gè)新的離心管中。.在上述的上清液中加入倍體積的酚/氯仿,充分混勻,離心分鐘,用已剪的槍頭取上清液移至另一個(gè)新的離心管中。.在上述的上清液中加入倍體積的氯仿/異戊醇:,充分混勻,離心分鐘,用已剪的槍頭取上清液移至另一個(gè)新的離。心管中。 .在上述的上清中加入/體積/醋酸鈉.和倍體積的異丙醇輕

38、輕混勻,一放置分鐘以上,放置后,離心分鐘,棄除上清。.在貼壁的沉淀中加入 %乙醇洗滌,然后,離心分鐘,棄除上清液,然后再重復(fù)洗滌。放置空氣中干燥或真空干燥器吹干后加入滅菌超純水溶解。溶解后.保存、備用。.基因組濃度測(cè)定:吸取“基因組樣品,然后加入 滅菌超純水稀釋倍,再用紫外分光光度計(jì)測(cè)量和,自動(dòng)計(jì)算濃度和/比值,來(lái)判斷的純度如何的純度一般是/.,若.,則顯示有污染:若.,則顯示有蛋白質(zhì)或酚等污染;如果比值小于.,那么需要用酚/氯仿重新抽提次;如果/,則顯示溶液沒有有機(jī)物污染。濃度計(jì)算公式為:樣品濃度./稀釋倍數(shù)/第三章實(shí)驗(yàn)方法.高分辨率熔解曲線分析方法的建立和評(píng)價(jià).高分辨率熔解曲線分析方法的建

39、立.引物的設(shè)計(jì)和基因位于,而位于.,根據(jù)多態(tài)位點(diǎn),分別在外顯子和外顯子的變異位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)引物用來(lái)區(qū)分和基因的六種基因型。因?yàn)榛蚣易宄蓡T序列具有很高的序列同源性,所以在引物設(shè)計(jì)時(shí)需要盡量選取序列差異較大的區(qū)域結(jié)合.及 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),來(lái)確保片段擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。高分辨率熔解曲線分析對(duì)與小片段更加敏感,片段越短,單個(gè)堿基的序列差異反映在熔解曲線的差異就越明顯。本研究中引物均小于,為了增加兩個(gè)擴(kuò)增子值差異,采取改變擴(kuò)增子長(zhǎng)度以及在引物末端增加或措施,為了排除一些干擾因素分型時(shí)候在體系中加入高低溫內(nèi)標(biāo)。表.高低溫內(nèi)標(biāo)和雙重分析引物序列?.。譬墨鬻怨乏盥叢堿粥從隊(duì)訂凹丌 :? 一 :口【虹泠,.一 、。

40、” ?. ,. .叫仃?僦? .;, .?碩士學(xué)位論文 擴(kuò)增體系與循環(huán)參數(shù)和同時(shí)擴(kuò)增采用肛反應(yīng)體系:加入基因組,和上下游引物各. 緩沖液, ,., ,., ,高溫和低溫內(nèi)標(biāo)各., 。循環(huán)參數(shù):預(yù)變性分鐘,然后秒,秒,延伸秒,共個(gè)循環(huán);保溫分鐘,最后變性秒,降至室溫。擴(kuò)增引物序列、高低溫序列、各擴(kuò)增片段引物熔解溫度見表.。.高分辨率熔解曲線分析擴(kuò)增結(jié)束后在 .,上掃描,得到高分辨率熔解曲線:設(shè)定熔解的起始溫度為“和終止溫度.為“,待機(jī)溫度為。結(jié)果分析是采用。.雙重高分辨率熔解曲線分析方法的評(píng)價(jià).雙重高分辨率熔解曲線分析檢測(cè)體系的靈敏度和準(zhǔn)確性的評(píng)價(jià)將份待測(cè)基因組樣品在四周內(nèi)分四批進(jìn)行分析,每周對(duì)

41、一個(gè)批次的樣品進(jìn)行基因型分析。為了檢測(cè)建立的雙重高分辨率熔解曲線分析體系的靈敏度和準(zhǔn)確性,從檢測(cè)的每種基因型樣品中,各種基因型中選擇一定比例具有代表性的樣品進(jìn)行直接測(cè)序檢驗(yàn),然后由第三方對(duì)分析和測(cè)序兩種方法所得的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。.雙重高分辨率熔解曲線分析體系的重復(fù)性和穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)為了排除單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的隨機(jī)誤差,檢測(cè)所建立的雙重高分辨率熔解曲線分析體系的重復(fù)性和穩(wěn)定性,我們選取了和基因的野生純合子以及突變純合子各個(gè)樣本進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析次重復(fù)實(shí)驗(yàn),體系以及循環(huán)參數(shù)同上。.雙重高分辨率熔解曲線分析體系的敏感性評(píng)價(jià)第三章實(shí)驗(yàn)方法為了評(píng)價(jià)建立的雙重高分辨率熔解曲線分析敏感性,我們對(duì)基因的野生純合子

42、和突變純合子樣本進(jìn)行了倍稀釋法,進(jìn)行個(gè)濃度檢測(cè),分別是, , ,. ,. ,體系以及循環(huán)參數(shù)同上。.等位基因頻率的計(jì)算和?平衡的判定設(shè)定野生型基因頻率為,突變型基因頻率為, 。為基因型的基因型頻率;為基因型的基因型頻率,為基因型的基因型頻率。根據(jù)樣品的基因型計(jì)算各種等位基因的頻率,然后通過檢驗(yàn)所選取群體樣本的和等位基因頻率和基因型頻率分布是否符合平衡。.結(jié)果分析.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用.統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,進(jìn)行以下二方面的分析:.穩(wěn)定性及重復(fù)性分析:計(jì)算和基因型純合子的熔解的變異系數(shù),看其范圍大小。.平衡的分析:假設(shè)野生型等位基因頻率為,突變型等位基因頻率為,則,依據(jù)?平衡定律,即。這里,從基因型的基因型頻率為,缸基因型的基因型頻率為,基因型的基因型頻率為。根據(jù)例無(wú)關(guān)個(gè)體的基因型頻率分布情況,可以推算出每種等位基因的基因頻率,并通過檢驗(yàn)判斷所選取的隨