高分辨率熔解曲線分析技術用于乙醇脫氫酶1B和乙醛脫氫酶2基因的快速分型（可編輯）

1、高分辨率熔解曲線分析技術用于乙醇脫氫酶1b和乙醛脫氫酶2基因的快速分型 南方醫(yī)科大學級碩士學位論文高分辨率熔解曲線分析技術用于乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶基因的快速分型 ?課題來源:十一五國家支撐計劃課題.和國家高技術研究發(fā)展計劃計劃,.業(yè) 稱專 名 醫(yī)學遺傳學學位申請人 袁曉文指 導 教 師 徐湘民教授周萬軍博士龔瑤琴教授答辯委員會主席鄔玲仟教授答辯委員會成員王紅艷教授袁慧軍教授趙彥艷教授論文評閱人 白曉春教授孫筱放教授日年月 深圳高分辨率熔解曲線分析技術用于乙醇脫氫酶 和乙醛脫氫酶基因的快速分型碩士研究生:袁曉文導師:徐湘民教授摘要背景與目的乙醇脫氫酶,和乙醛脫氫酶,是在人體內乙醇代謝途徑的兩個

2、關鍵酶,負責催化人體的乙醇分解代謝,即催化乙醇向乙醛轉化以及乙醛向乙酸鹽分解的關鍵酶。的活性增強可以加速乙醇向乙醛轉化,而活性的降低則使乙醛向乙酸鹽轉化受到限制,同樣使乙醛的濃度顯著增高。乙醛濃度的增加與酒精相關性疾病的發(fā)生發(fā)展有一定關系。和基因多態(tài)性具有種族特異性,在不同種族人群中分布是不一樣的。據(jù)研究顯示,亞洲人的酒精依賴性疾病主要與和基因變異密切相關?；蛭挥谔柸旧w長臂區(qū)帶,基因在第號外顯子發(fā)生變異,形成,導致亞基的第位氨基酸從精氨酸轉換為組氨酸從而形成艮,酶活性增高?；蛭挥谔柸旧w長臂區(qū)帶,基因在第號外顯子發(fā)生變異,形成,與此同時,酶的第位氨基酸由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?。野生型具有活?

3、突變型沒有酶活性。和基因的變異會使酶代謝活性改變,導致飲酒在不同種族和個體間酒精代謝發(fā)生改變。這些年來,研究發(fā)現(xiàn)這兩種變異與摘要各個組織器官的癌變,乙醇相關的肝臟病變、遲發(fā)型老人癡呆、冠心病、型糖尿病并發(fā)癥、血液中膽固醇水平都有不同程度的聯(lián)系。因此,一種準確快速的基因型分析方法對于有關的臨床研究和人群普查等廣闊研究領域是十分必要的。近年發(fā)展起來的高分辨率熔解曲線分析,技術已被證明是一種具有低成本、高通量、速度快、操作簡便、高靈敏度等優(yōu)點的用于基因突變檢測、基因分型和檢測的工具。不同核酸分子的片段長短、堿基組成、分布等是不同的,因此在加熱變性后所有的雙鏈分子都會有自己相應的熔解曲線形狀和位置。當

4、擴增目的片段含有突變/時,目的產(chǎn)物經(jīng)過變性.復性會產(chǎn)生異源雙鏈,異源雙鏈中突變/位點是不匹配的,所以雙鏈在升溫過程中先解鏈,此時熒光染料從局部解鏈的雙鏈分子上釋放出來,根據(jù)熒光強度與溫度曲線圖可以判斷是否具有突變/,同時不同的位點和雜合度都會影響熔解曲線的峰形。分析過程中,隨著雙鏈分子的擴增,由于熒光染料結合到重新產(chǎn)生的雙鏈分子,熒光信號不斷的增強。當進入擴增平臺期時,熒光信號同時也進入了平臺期。隨著溫度的不斷升高,雙鏈逐漸解開,結合上的飽和染料被釋放出來,熒光信號逐漸減弱。直到溫度升到,所有的雙鏈分子完全解開,通過檢測熒光值,建立熒光值隨溫度升高的變化過程得到熔解曲線。技術的基本原理就是根據(jù)

5、熔解曲線的差異性來對樣品進行區(qū)分。以往的變異檢測技術,限制性內切酶片段長度多態(tài)性,單鏈構象多態(tài)性分析,兩對交叉引物、 . ,擴增產(chǎn)物長度多態(tài)性,變性高效液相色譜等具有一定的局限性,如耗時長,操作繁瑣,準確度低,成本相對較高等。與這些方法相比,分析方法具有一定的優(yōu)勢:成本低,只需飽和染料不需要昂貴的探針;在反應結束后,不需要后續(xù)工作而碩士學位論文直接進行熔解曲線反應;快速、高通量,一次可以同時檢測或個樣本;閉管操,防止樣本遭受污染;經(jīng)過分析處理后的擴增產(chǎn)物還可以直接進行測序,十分方便快捷。具有較高的敏感性和特異性,目前已廣泛應用于生命科學、醫(yī)學、農(nóng)學、畜牧業(yè)等各個領域的研究工作中?；谏鲜鎏攸c,

6、本研究擬應用技術,建立和的檢測方法,對預測個體患酒精相關疾病的風險和研究酶變異與酒精相關疾病的關系提供方便,同時為中國南方酒精相關疾病患者的遺傳咨詢、臨床診斷提供有用的信息。材料與方法.標本:共收集例全血標本。采用標準的飽和酚/氯仿法提取外周血中的基因組。.分子分析方法:針對和基因以及和變異位點設計擴增體系及優(yōu)化條件。通過測序獲得和各種基因型樣品。建立檢測和基因的高分辨率熔解曲線分析技術。針對和基因以及和變異位點設計分析的引物,利用經(jīng)測序已知的基因型樣品優(yōu)化分析條件,從而建立和基因的高分辨率熔解曲線分型的分析方法。根據(jù)的分析結果,從各種基因型中選取一定數(shù)量的樣品進行測序分析,以驗證評價該方法的

7、準確性。并且選取每種和基因野生純合子和突變純合子各個樣本進行重復實驗。同時對基因的野生純合子和突變純合子樣本進行了倍稀釋法,進行個濃度檢測,探討該方法檢測敏感性。.統(tǒng)計學分析:對構建的和基因已知突變分型檢測體系進行準確性和穩(wěn)定性分析。利用部分樣本直接測序對比來驗證其準確性;采用重復性實驗以確定該體系的穩(wěn)定性與準確性。同時分析東莞地區(qū)隨機漢族人群的摘要和的基因頻率和基因型頻率,并應用矛檢驗該群體樣品是否符合?平衡。使用的統(tǒng)計學分析軟件為.。.實驗結果的綜合分析、總結。結果建立了穩(wěn)定可靠的雙重檢測體系。此體系中,所選取的擴增目的序列以及所設計的引物的特異性高。和基因的野生純合子/,雜合子/,突變純

8、合子/三種基因型能夠在上進行明顯的區(qū)分。用盲法分析對該方法進行評價,用此方法分析東莞地區(qū)份漢族人基因組樣品,從每組基因型中隨機選出部分樣品進行測序對照,結果符合率為%,證實了該方法的準確性很好;進行重復實驗,發(fā)現(xiàn)三次實驗的變異系數(shù)的范圍從.%到.%,證實了該方法的穩(wěn)定性很好。在倍稀釋試驗中,個濃度均可以準確分型,可以知道.濃度仍然可以用于此檢測體系。礦檢驗結果顯示所選群體符合平衡,與基因頻率與以前所報道的數(shù)據(jù)基本符合,從另一個方面說明了該方法的準確性。結論飲酒已被認為是危害人類健康的嚴重危險因素,容易導致多種酒精相關疾病。酒精在體內劑量效應和作用時間,不僅僅與酒量和飲酒頻率相關,還與易感基因和

9、代謝能力有強關聯(lián)性。和兩種基因的變異與酒精依賴性疾病密切相關,所以枷和兩種基因進行快速分型,在中國人群中進行快速篩查,不僅能夠對酒精相關疾病風險進行評估,還有助于研究和基因與其他相關疾病的致病機理。高分辨率熔解曲線分析技術是近幾年興起一種基于核酸的物理性質的基因突變檢測技術。這種檢測技術沒有局限于突變堿基位點與類型,不需使用序列特異性探針,在結束后直接進行高分辨率熔解曲線分析來完成對樣品基因型的分析。因其操作簡便、快速,成本低,結果準確,高通量,并且閉管碩士學位論文操作而備受關注。高分辨率熔解曲線分析技術只需要在普通基礎上增加一個飽和染料既可以進行未知突變掃描,也可以對已知突變進行基因分型,還

10、可以分析短片段重復序列。分析的這些優(yōu)勢使它具有極強的可操作性,近年來成為國內外新興的各研究領域學、方法學研究和應用熱點。本課題研究中建立的針對和基因的高分辨率熔解曲線分析檢測方法能夠快速、準確地同時對和基因進行檢測,并且實驗的重復性和穩(wěn)定性好、敏感性高、體系可靠。本研究對中國南方人群進行檢測,發(fā)現(xiàn)所檢測的人中不存在/和/組合的個體,所以推測這種基因型組合在中國南方是很少見的。有關文獻報道,等位基因會增加食道癌,肝癌等癌癥發(fā)生的風險性。同時很多的研究表明彳刪?/叼或彳刪.吲叼個體由于乙醛的積累導致其患有食道癌等癌癥的風險更大,然而同時對這兩個基因進行聯(lián)合研究的很少,因此同時納入和彳刪兩基因的病例

11、.對照研究是下一步進行疾病風險研究的重點工作。本研究為和基因的檢測建立了一種簡單、高通量、快速、經(jīng)濟和靈敏的檢測方法,有助于酒精相關疾病的遺傳學咨詢,流行病學調查,并為研究和基因與其他相關疾病的關系提供了一項常規(guī)檢測手段。本研究方法的一些處理技巧如改變擴增子長度以及加尾處理具有普遍的代表性與通用性,可為其它基因同時分型的檢測方法研究提供借鑒與參考。關鍵詞 乙醇脫氫酶:乙醛脫氫酶;高分辨率熔解曲線分析;基因分型碩士學位論文三 一 ?: .?:.。, ,. 一,. ,. 彳三舊. ., .晰 , ., , , , , .,.?.?, , . ,.,. :. ., 謝, . , . . , /, ,

12、、析,. , ,.晰 :、訪 ;加碩士學位論文? ; ;, .曲. ,., ?.: , ./. 彳加. . . , ?/,?/., ,?/./. .,? . ,.?/叼? .?產(chǎn) . . 娃; , . . % . . . % .%. / /?,., , , , .? . . . , 札.,.,碩士學位論文,. , ,. ,.,. ,. ,曲 .,/. . 彳聊 . 、 ./. . , . , , ,.: ; ;碩士學位論文目 錄摘要.第一章 引言第二章實驗材料.實驗儀器及分析軟件?.實驗試劑:.:外周血基因組提取試劑.常規(guī)試劑。.電泳試劑?。.高分辨率熔解曲線分析試劑。.外周血樣品及樣品?.已

13、知基因型樣品. .方法學評價所用基因型樣品?第三章實驗方法?.技術路線圖?.樣品基因組的提取及濃度測定.酚/氯仿法抽提基因組.基因組濃度測定:.高分辨率熔解曲線分析方法的建立和評價.高分辨率熔解曲線分析方法的建立。.雙重高分辨率熔解曲線分析方法的評價.等位基因頻率的計算和?平衡的判定?.結果分析?.統(tǒng)計學分析目錄.高分辨率熔解曲線分析檢測標本結果分析.第四章實驗結果?.雙重高分辨率熔解曲線分析方法檢測和已知基因型的結果.雙重高分辨率熔解曲線分析方法的評價。.雙重高分辨率熔解曲線分析檢測體系的靈敏度和準確性的評價.雙重高分辨率熔解曲線分析體系的重復性和穩(wěn)定性的評價.雙重高分辨率熔解曲線分析體系的

14、敏感性評價?.各等位基因頻率和.平衡的判定第五章分析與討論?.第六章結論?.參考文獻附 錄.攻讀碩士學位期間所發(fā)表論文?中英文縮略詞表?致 謝。?。學位論文原創(chuàng)性聲明統(tǒng)計學審稿證明?.碩士學位論文第一章引言年月日,參加人類基因組計劃的國美國、英國、法蘭西共和國、德意志聯(lián)邦共和國、日本和中國科學家共同宣布,人類基因組草圖的繪制工作已經(jīng)完成。年月日,這國還公布了人類基因組精細的工作框架圖及其初步的注解結果。整個人類基因組測序工作的完成,為人體生物學和醫(yī)學研究開辟了一個新紀元,它不僅對生命本質、人類進化、生物遺傳一群體差異、發(fā)病機理、疾病預防與治療、新藥開發(fā)等眾多領域具有重要意義,并且對整個生物學發(fā)

15、展產(chǎn)生巨大的影響,標志著人類生命科學進入一個新時代。然而,僅依靠測定基因組序列來詳細闡述人類基因編碼序列及非編碼序列的功能是遠遠不夠的,此時還需要通過“后基因組研究去揭示。人類基因組計劃的主要目標是解讀人類基因組的序列,而后基因組計劃是以了解基因組的功能及調控機制為目標,其核心科學問題主要包括:人類基因組的多樣性計劃,基因組的表達調控機制,蛋白質產(chǎn)物的功能,以及模式生物基因組功能研究等。單核苷酸多態(tài)性 ,主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的序列多態(tài)性。人類基因組序列已鑒定萬,其中萬多位于基因編碼區(qū),一些可以影響到個體的表面特征、疾病的風險以及對環(huán)境的反應】。隨著對檢測和分析技術的不

16、斷發(fā)展,特別是與芯片等技術相結合,現(xiàn)在已成為第三代遺傳標記,可以對疾病相關基因進行定位研究,尤其是多基因遺傳病基因的定位,并將逐漸取代目前常用的第二代遺傳標記微衛(wèi)星標記技術而進入基因應用研究的領域。長期酒精攝入可引起人體眾多系統(tǒng)損害。近年來,由于所謂的“酒桌文化的快速發(fā)展以及酒精的濫用,酒精性肝病的患者大大增加,過去比較少見的酒精性心肌病患者也呈增加了很多。酒精的過渡累積還可引起動脈粥樣硬化,消化道癌,高血壓,老人癡呆,冠心病等多種疾病。酒精的化學成分是乙醇,是第一章引言一種能與水完全互溶的極性小分子物質,口服攝入后,它很快經(jīng)口腔、食道、胃、腸等多處吸收,在消化道內可以直接從生物膜進入血液循環(huán)

17、,整個消化道對乙醇都有吸收作用,然后通過胃腸黏膜的擴散借助血液循環(huán)均勻、迅速運輸?shù)饺砀鹘M織器官進行代謝利用。肝臟是乙醇代謝的主要器官,胃和腸道吸收的酒精經(jīng)靜脈系統(tǒng)進入肝臟,大部分的乙醇都在肝臟代謝,其代謝途徑主要有以下條:乙醇脫氫酶乙醇氧化體系、微粒體乙醇氧化體系、氧化酶一過氧化氫酶體系和黃嘌呤氧化酶一過氧化氫酶體系。其中通過乙醇脫氫酶乙醇氧化體系途徑代謝的乙醇約占代謝的%【。 ,和 ,是該代謝途徑的關建酶,所以這兩種酶是人體內參與乙醇代謝的主要酶。乙醇脫氫酶是催化乙醇向乙醛轉化的關鍵酶,乙醛脫氫酶則是乙醛氧化為乙酸的關鍵酶,最終乙酸被氧化為水和二氧化碳進行代謝如圖.。是一種廣泛專一性的含鋅

18、金屬酶。以、或為輔酶在生物催化和生物醫(yī)學領域都有較為廣泛的應用。的活性增強可以加速乙醇向乙醛轉化,而活性的降低則使乙醛向乙酸鹽轉化受到限制,同樣使乙醛的濃度顯著增高,導致乙醛在人體內累積。乙醛能夠與機體多種蛋白質進行共價結合,產(chǎn)生乙醛一蛋白質復合物,引起蛋白酶失活、修復蛋白功能損害,自身抗體形成、谷胱甘肽耗竭、線粒體損傷和氧利用障礙,進而對人體組織和器官有高度的致毒,致突變,致癌的作用【】。此外,乙醛還具有擬交感活性作用,刺激肥大細胞釋放血管活性物質使血管舒張而出現(xiàn)臉紅、出汗、發(fā)音困難、心動過速、惡心和低血壓【】。因此,乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的代謝活性高低會影響到體內乙醇的代謝快慢,進而直接影

19、響到人體的健康狀態(tài)。碩士學位論文胎兒圖.乙醇在肝臟內的氧化代謝通路.人類基因位于.,可以編碼同源或異源二聚體的同工酶。同工酶是二聚體,有多種同工酶,常見的種根據(jù)其在肝臟內不同的催化動力特性和電泳泳動度以及對乙醇的不同的氧化速率,可分為型:型包括甜亞基, 亞基,.亞基,型為.亞基,型為廿亞基。型豐要在肝臟表達,它的米氏常數(shù)值最低而對乙醇的特異性最高,所以在乙醇代謝中起關鍵作用,種結構基因,分別編碼【、丫亞單位。?基因在染色體上相鄰近,它們有%的序列是一樣的,組成一個約的族群,個基岡存在高度同源性,它們的長度均約 ,而且均包含個外顯子?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引言第一章和存在基因多態(tài)現(xiàn)象,不同基因型的和同工酶催化

20、乙醇向乙醛轉化的活性有很大不同。但到目前為止的所有研究中,在任何種族中尚未發(fā)珊、彳刪鰳冊存在多態(tài)性】?；蛭稽c有三個等位基因,即彳劇宰,和,分別編碼卜、,個亞單位,他們亞基隨機組合可形成種基因型:/、/、/、/、/、/。為野生型等位基因,它的活性是極低的,是第外顯子發(fā)牛點突變,導致的第位氨基酸由精氨酸轉換為組氨酸從而形成,雖變異,這種修飾產(chǎn)牛了一個的酶切位點。等位基因個體比等位基因個體乙醇脫氫酶活性強倍【。等位基因最早是在美國印第安納波利斯市的黑人群體中發(fā)現(xiàn),以后研究表明,該等位基因在美國西北部的土著人中也有表達,但是在歐美白種人和亞洲的同本人和中國人的發(fā)牛頻率很低,均小于%。彳刪佃宰則是在第

21、外顯子發(fā)生 點突變形成的,同時導致第位氨基酸由精氨酸變?yōu)榘腚装彼?產(chǎn)生一個 的酶切位點。根據(jù)資料顯示歐美白種人的等位基因頻率在%以上,而在亞洲人中的等位基因頻率大于%。所以亞洲人飲酒后比歐美人更容易使乙醇代謝為乙醛,發(fā)生臉紅,頭暈等酒精反應。因此,在中國人群中又的研究豐要涉及和兩種等位基因。基因位于,有和兩種等位基因,分別編碼,丫亞基。是野牛型等位基因,彳劇叼黝刖,在第外顯子發(fā)牛點突變,同時的位氨基酸由纈氨酸變?yōu)榧琢虬彼嵝纬裳尽５任换騻€體比等位基因個體乙醇脫氫酶活性強.倍【。等通過對臺灣的漢族人的乙醇代謝相關酶基因變異和酗酒癥之間的關聯(lián)研究,發(fā)現(xiàn)基因變異對是否成為酗酒者基本不起作用。所以研究

22、型變異與乙醇所致疾病的關系主要是彳刖曰車,和兩種等位基因。迄今為止有種同工酶,常見的有種,位于肝細胞的線粒體內,對乙醛有較低的值,其余三個同工酶均位于包漿,對乙醛碩士學位論文的值是的一倍,因此推測他在體內對乙醛的氧化不起主要作用一。位于.,;和兩種等位基因,是野生型等位基因,是第個外顯予發(fā)生點突變,與此同時,酶的第位氨基酸由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼帷Ｒ吧鷫啪哂谢钚?突變型不具有活性。但黝三刪?/屹的活性只有/活性的%活性【】。突變型無活性的等位基因在歐洲人和非洲人中幾乎缺乏,但在亞洲人種基因頻率達到%【】。和基因位點存在多態(tài)性,不同的等位基因所編碼的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶催化活性差異很大,這種差異與酒

23、精依賴綜合癥密切相關,和基因型的個體相對有彳朋,?和不容易發(fā)展成為酗酒者,這些已被大量文獻予以報道【】。大量研究發(fā)珊朋和基因與各個組織器官的癌變、乙醇相關的肝臟病變、冠心病、遲發(fā)型老人癡呆、型糖尿病的并發(fā)癥,多發(fā)性神經(jīng)炎,血液中膽固醇的水平都有程度不同的聯(lián)系【舶】。研究還發(fā)現(xiàn)對于第一個催化反應來說,攜帶有低活性的等位基因的個體會增加癌癥的風險性,對于第二個催化反應來說,攜帶有沒有活性的個體會增加癌癥的風險性【。有關研究對此兩基因型聯(lián)合研究,各種基因型組合患病危險性如表.【,我們可以發(fā)現(xiàn)兩酶具有一定活性時候患病風險性最少。因此,又寸和基因型進行鑒定有助于酒精中毒的流行病學研究和預測個體酒精相關疾

24、病的風險,為研究這兩種基因變異與其他相關疾病的關系提供理論基礎,為遺傳病的咨詢提供了遺傳學基礎。傳統(tǒng)的檢測和基因變異的主要技術方法是限制性片段長度多態(tài)性法,和單鏈構象多態(tài)性檢測. ,【,此兩種方法經(jīng)過改進后成為分析和基因變異的常規(guī)方法。限制性內切酶分析的特異性雖高,但方法繁瑣,且其篩查突變時常出現(xiàn)酶切不全的現(xiàn)象:是通過擴增后泳動變位,發(fā)現(xiàn)異常片段后再用測序證實,檢測效率低,漏檢率高。后來又有多種檢測方法被運用于此兩個基因的分析研究,例如,第一章引言,.等方法,但由于這些技術操作方法復雜,效率低以及所需成本高等多種因素,沒有得到推廣使用。近些年來,隨著科學技術的發(fā)展,不少新的自動化的方法用于檢測

25、或基因變異,例如】、分析【、分析【】等方法,但是,上述自動化方法因為成本相對較高等原因,在大規(guī)模人群篩查或檢測多個位點突變中的應用受到一定限制。本研究主要運用高分辨率熔解曲線 ,分析方法來;不和基因同時分型。高分辨率熔解曲線分析技術是近些年新興的一種基因多態(tài)性檢測新技術。目前,已廣泛應用于突變掃描、甲基化分析、基因分型、序列匹配等諸多領域,已成為生命科學研究中的熱點技術。此方法主要是通過檢測雙鏈序列之間的解鏈差異來判斷序列之間的差異。不同核酸分子的片段長短、序列的含量和分布等是不同的,因此在加熱變性復性后所有的雙鏈分子都會有自己相應的熔解曲線形狀和位置【。技術的基本原理就是根據(jù)熔解曲線的不同來

26、對樣品各種基因型進行區(qū)分。當擴增片段存在突變/時,目的產(chǎn)物經(jīng)過變性.復性形成異源雙鏈,異源雙鏈中突變/位點因不匹配的,所以雙鏈在升溫過程中先解鏈,此時熒光染料從局部解鏈的分子上釋放出來,根據(jù)熒光強度與溫度曲線圖可以判斷是否具有突變/,同時不同的位點和雜合度都會影響熔解曲線的峰形。根據(jù)熔解溫度的改變可區(qū)分野生型和純合突變,而根據(jù)熔解曲線形狀不同可區(qū)分野生型與雜合突變型。由于富含區(qū)會比富含區(qū)熔解溫度高,所以不同樣本的熔解溫度是截然不同的。純合子樣品經(jīng)過擴增之后還是純合子,而雜合子樣品經(jīng)過擴增之后,產(chǎn)生兩種同源雙鏈和兩種異源雙鏈。分析過程中,隨著擴增,熒光染料結合到重新復制的雙鏈分子上,熒光信號逐漸

27、增強,進入擴增平臺期后,熒光信號也進入平臺期。隨著溫度的升高,雙鏈逐漸解鏈,結合的染料釋放出來,熒光值逐漸下降,直到溫度升,所有的雙鏈完全解鏈。通過檢測熒光值,得到立熒光值隨溫度升高的變化而變化的熔解曲線。當產(chǎn)物片段一定的情況下,個別堿基的差異能夠表現(xiàn)在熔碩士學位論文解曲線的差異上。高分辨率熔解曲線分析原理圖見圖.,另外,熔解溫度是指當一半的雙鏈解開時候的溫度,也是反應不同樣本的重要特性。高分辨率熔解曲線分析的豐要目的是能對單堿基的變化進行區(qū)分,因此對溫度分辨率的要求很高。目前常規(guī)熔解曲線分析使用的非飽和性染料如等不僅對有抑制作用,而且在實驗中的使用濃度非常低,不能夠完全結合到雙螺旋結構中的小

28、溝。因為非飽和染料的使用濃度未達到飽和,并且染料本身特性,即在雙鏈解鏈的過程,它能夠從已經(jīng)解鏈的雙鏈片段上脫離下來同時并且重新與還沒有解鏈的雙鏈結合,所以會導致結果不準確,不能夠真實的反映熔解情況,嚴重的影響到檢測的分辨率。熒光染料等飽和染料逐漸的取代了傳統(tǒng)的非飽和染料,這種飽和染料因為結合能力強以及抑制作用很低而熔解曲線分析分辨率更高。雙鏈飽和型熒光染料具有的這些特性使其篩查的靈敏度和特異性很高。與其他的基因多態(tài)性檢測技術相比較,具有以下優(yōu)點:成本很低,不需要昂貴的標記探針只需要飽和染料;在反應結束后可以直接進行熔解曲線反應分析,不需要任何的后續(xù)工作;具有高通量特點,單管反應可以檢測或個樣本

29、;所有反應都是閉關操作,極大的降低了樣本被污染的可能性,并且經(jīng)過分析的擴增產(chǎn)物還可以進行測序等后續(xù)工作,十分簡單方便。本研究豐要利用了基因分型中的小片段法快速、準確的對和基因同時分型的方法,有助于預測個體乙醇相關疾病的風險,并且為其他基因進行多重分析提供參考。擴增片段越小,更能體現(xiàn)目的片段的序列差異,值差異越大,分型更加明顯。小片段法要求是:.目的擴增片段大概是.。為了避免不同空間的溫度差異導致的結果偏差,加入末端封閉的高低溫內標來校正熔解曲線。.在反應之前加入雙鏈的飽和染料如 。.模板的量要比較均一,引物具有好的特異性。.反應體系為時, 的加入量為。.在反應之前應加入礦物油防止產(chǎn)物揮發(fā)。本研

30、究采用的是雙重結合小片段法基因方法快速篩查和基因型,為了避免不同片段間的值的重疊第一章 引言效應,所以通過改變擴增子大小以及通過在引物末端增加或來增大值差異,以便區(qū)分不同的目的片段。該方法可極大地提高和基因的分型率,可為中國人大規(guī)模的人群篩查和預測乙醇相關疾病風險提供有效的技術手段。?替圖.高分辨率熔解曲線分析原理圖. 受碩士學位論文表.兩基因各種基因型組合的癌癥患病風險性% :心 ./ .?. . . / .?. . .?.?.?. . . .: ,:第二章實驗材料第二章實驗材料.實驗儀器及分析軟件.凝膠成像系統(tǒng):型,英國公司產(chǎn)品產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng),英國 公司。.酸度計:型,英國公司。.水浴

31、振蕩器:.型,哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司。,美國公司。.高分辨率熔解曲線分析儀.臺式高速離心機:.型,珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司。.電泳儀:型電泳儀,北京六一儀器廠。.純水器: 型,法國公司。.基因擴增儀:型,美國公司;儀,公司。.低溫冷凍離心機:美國 公司。.醫(yī)用凈化工作臺:蘇州凈化設備廠。.和冰箱:華凌.冰箱,中國華凌集團有限公司。.分光光度計:美國公司。.凈化工作臺:上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。.低溫冰箱:美國 公司。.制冰機:北京德天佑科技發(fā)展有限公司。.鼓風干燥箱:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。.電子天平:.型,美國產(chǎn)品。.分析軟件與相關網(wǎng)站:.引物設計軟件: ,.,.。,.

32、高分辨率熔解曲線分析軟件: 碩士學位論文序列比對軟件與網(wǎng)站:. ,/:/./.?統(tǒng)計學分析軟件:.。.實驗試劑.外周血基因組提取試劑.無菌超純水:法國純水儀自制,.柵,經(jīng)高壓蒸汽滅菌,分裝后,.保存,備用。 . / :稱取. 分析純,汕頭市光華化學試劑廠產(chǎn)品;稱量前需高溫烤干置于 燒杯中,加入大約 的去離子水后攪拌溶解;溶解后繼續(xù)加去離子水并將所得溶液定容至 后,分裝后,高壓蒸汽滅菌后,保存,備用。. /胺四乙酸溶液:稱取. ?,置于 燒杯中;加入大約 的去離子水,充分攪拌溶解;然后用;調整好值后繼續(xù)加去離子水將調節(jié)值至.大約 所得溶液定容至 ;適量分成小份,高壓蒸汽滅菌后室溫保存,備用。為美

33、國公司產(chǎn)品。.緩沖液:用/.和/ .以及/ 貯存液配制成。./.溶液:稱量. 堿分裝,北京鼎國生物技術有限責任公司產(chǎn)品置于 燒杯中,加入大約 的去離子水,充分攪拌溶解,溶解后加入約的濃鹽酸調節(jié)值至.,調整好值后繼續(xù)加去離子水將所得溶液定容至 ,適量分成小份。高壓蒸汽滅菌后室溫保存,備用。.%/十二烷基硫酸鈉,美國公司產(chǎn)品:稱量高純度的置于燒杯中,加入大約的超純水,加熱溶第二章實驗材料解,溶解后滴加數(shù)滴濃鹽酸調節(jié)值至.,調整好值后繼續(xù)加去離子水將所得溶液定容至后室溫保存。.蛋白酶:美國公司產(chǎn)品。.緩沖液:用 .和貯存液配制成。.氯仿/異戊醇:分析純,按體積比:配制。./?置于燒醋酸鈉,.:稱量.

34、杯中,加入約的超純水攪拌溶解;溶解后加入冰醋酸調節(jié)值至.:調整好值后繼續(xù)加去離子水將所得溶液定容至后室溫保存。.飽和酚,.:北京鼎國生物技術有限責任公司產(chǎn)品。.無水乙醇:分析純,汕頭市光華化學試劑廠產(chǎn)品。.常規(guī)試劑.寡核苷酸引物:上海英駿生物技術有限公司合成,經(jīng)純化。.寶生物工程大連有限公司產(chǎn)品。. :寶生物大連有限公司產(chǎn)品。.普通 :北京鼎國生物技術有限責任公司產(chǎn)品。.電泳試劑.瓊脂糖:西班牙公司產(chǎn)品。.溴化乙錠:在 雙蒸水中加入 廣州威佳生/ 物公司,磁力攪拌數(shù)小時完全溶解,溶解后置棕色瓶中室溫保存,備用。.電泳上樣緩沖液:.%溴酚藍,.%甲苯腈藍,%/蔗糖溶于超純水中。.電泳緩沖液:稱量

35、堿分裝,北京鼎國生物技術./有限責任公司,硼酸汕頭市化工廠,.,置于燒杯中,加入大約的超純水溶解,溶解后繼續(xù)加去離子。水定容至. :,北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品,電泳條帶包括:, , , , , , , , 片段。碩士學位論文.高分辨率熔解曲線分析試劑.美國公司產(chǎn)品。.液體石蠟:廣東光華化學廠有限公司產(chǎn)品。.外周血樣品及樣品.已知基因型樣品對課題組所保存的隨機人群的樣品進行測序,獲得例樣本,包括扶下基因型? 。產(chǎn)。?凈。?產(chǎn)。/熟/.方法學評價所用基因型樣品.用于本研究的外周血樣本共例標本收集自東莞市婦幼保健院,全基因組提取采用經(jīng)典的苯酚/氯仿法抽提。.保存?zhèn)溆?。第三章實驗方法第三章實驗?/p>

36、法.技術路線圖鎢童瀲髓證獲得,卑,聿 ?。?年。產(chǎn).彳伽/屹和彳三她叫叼六種基因型的樣品,利用已知基因型的樣品在上優(yōu)化分析條件,進行方法的建立;利用已經(jīng)建立的方法分析隨機人群中的個個體的基因型,通過雙盲分析法和不同批次重復實驗的分析對該方法進行準確性和穩(wěn)定性評價。本研究所用到的技術主要包括:技術、產(chǎn)物測序技術、高分辨率熔解曲線分析技術等。技術路線見圖.。體系:.拖化:翌敏感性準確性 重復性 基因頻率和基因一.:疆縫.:,. ?.進綸一一 .疊撿一.一型頻垂的企托圖.技術路線.樣品基因組的提取及濃度測定.骨攘仿法抽提基因組:.吸取 抗凝的外周血置于聚丙烯離心管,加入.倍體積滅菌的雙蒸水進行溶血反

37、應,離心分鐘,棄除上清。.重復洗滌次直到看不到紅色血影,剩下的是所需的白細胞沉淀。碩士學位論文緩沖液和.向該離心管內加入蛋白酶以及.的%,同時充分混勻,混勻后水浴震搖消化 .過夜直到肉眼觀察溶液清亮并且沒有沉淀即可。.消化后將液體轉移至.離心管,加入倍體積飽和酚,充分混勻,離心分鐘,用已剪的槍頭取上清液移至另一個新的離心管中。.在上述的上清液中加入倍體積的酚/氯仿,充分混勻,離心分鐘,用已剪的槍頭取上清液移至另一個新的離心管中。.在上述的上清液中加入倍體積的氯仿/異戊醇:,充分混勻,離心分鐘,用已剪的槍頭取上清液移至另一個新的離。心管中。 .在上述的上清中加入/體積/醋酸鈉.和倍體積的異丙醇輕

38、輕混勻,一放置分鐘以上,放置后,離心分鐘,棄除上清。.在貼壁的沉淀中加入 %乙醇洗滌,然后,離心分鐘,棄除上清液,然后再重復洗滌。放置空氣中干燥或真空干燥器吹干后加入滅菌超純水溶解。溶解后.保存、備用。.基因組濃度測定:吸取“基因組樣品,然后加入 滅菌超純水稀釋倍,再用紫外分光光度計測量和,自動計算濃度和/比值,來判斷的純度如何的純度一般是/.,若.,則顯示有污染:若.,則顯示有蛋白質或酚等污染;如果比值小于.,那么需要用酚/氯仿重新抽提次;如果/,則顯示溶液沒有有機物污染。濃度計算公式為:樣品濃度./稀釋倍數(shù)/第三章實驗方法.高分辨率熔解曲線分析方法的建立和評價.高分辨率熔解曲線分析方法的建

39、立.引物的設計和基因位于,而位于.,根據(jù)多態(tài)位點,分別在外顯子和外顯子的變異位點兩端設計引物用來區(qū)分和基因的六種基因型。因為基因家族成員序列具有很高的序列同源性,所以在引物設計時需要盡量選取序列差異較大的區(qū)域結合.及 軟件進行引物設計,來確保片段擴增的準確性。高分辨率熔解曲線分析對與小片段更加敏感,片段越短,單個堿基的序列差異反映在熔解曲線的差異就越明顯。本研究中引物均小于,為了增加兩個擴增子值差異,采取改變擴增子長度以及在引物末端增加或措施,為了排除一些干擾因素分型時候在體系中加入高低溫內標。表.高低溫內標和雙重分析引物序列?.。譬墨鬻怨乏盥叢堿粥從隊訂凹丌 :? 一 :口【虹泠,.一 、。

40、” ?. ,. .叫仃?僦? .;, .?碩士學位論文 擴增體系與循環(huán)參數(shù)和同時擴增采用肛反應體系:加入基因組,和上下游引物各. 緩沖液, ,., ,., ,高溫和低溫內標各., 。循環(huán)參數(shù):預變性分鐘,然后秒,秒,延伸秒,共個循環(huán);保溫分鐘,最后變性秒,降至室溫。擴增引物序列、高低溫序列、各擴增片段引物熔解溫度見表.。.高分辨率熔解曲線分析擴增結束后在 .,上掃描,得到高分辨率熔解曲線:設定熔解的起始溫度為“和終止溫度.為“,待機溫度為。結果分析是采用。.雙重高分辨率熔解曲線分析方法的評價.雙重高分辨率熔解曲線分析檢測體系的靈敏度和準確性的評價將份待測基因組樣品在四周內分四批進行分析,每周對

41、一個批次的樣品進行基因型分析。為了檢測建立的雙重高分辨率熔解曲線分析體系的靈敏度和準確性,從檢測的每種基因型樣品中,各種基因型中選擇一定比例具有代表性的樣品進行直接測序檢驗,然后由第三方對分析和測序兩種方法所得的結果進行對比。.雙重高分辨率熔解曲線分析體系的重復性和穩(wěn)定性的評價為了排除單次實驗結果的隨機誤差,檢測所建立的雙重高分辨率熔解曲線分析體系的重復性和穩(wěn)定性,我們選取了和基因的野生純合子以及突變純合子各個樣本進行高分辨率熔解曲線分析次重復實驗,體系以及循環(huán)參數(shù)同上。.雙重高分辨率熔解曲線分析體系的敏感性評價第三章實驗方法為了評價建立的雙重高分辨率熔解曲線分析敏感性,我們對基因的野生純合子

42、和突變純合子樣本進行了倍稀釋法,進行個濃度檢測,分別是, , ,. ,. ,體系以及循環(huán)參數(shù)同上。.等位基因頻率的計算和?平衡的判定設定野生型基因頻率為,突變型基因頻率為, 。為基因型的基因型頻率;為基因型的基因型頻率,為基因型的基因型頻率。根據(jù)樣品的基因型計算各種等位基因的頻率,然后通過檢驗所選取群體樣本的和等位基因頻率和基因型頻率分布是否符合平衡。.結果分析.統(tǒng)計學分析采用.統(tǒng)計學軟件,進行以下二方面的分析:.穩(wěn)定性及重復性分析:計算和基因型純合子的熔解的變異系數(shù),看其范圍大小。.平衡的分析:假設野生型等位基因頻率為,突變型等位基因頻率為,則,依據(jù)?平衡定律,即。這里,從基因型的基因型頻率為,缸基因型的基因型頻率為,基因型的基因型頻率為。根據(jù)例無關個體的基因型頻率分布情況,可以推算出每種等位基因的基因頻率,并通過檢驗判斷所選取的隨