菌種保存、傳代、使用、銷毀管理規(guī)程,操作規(guī)程

1、菌種管理制度1、目的 建立菌種保存、傳代、使用、銷毀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范微生物學(xué)檢定用菌種的管理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保微生物學(xué)檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。2、適用范圍 本規(guī)程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的購買、保存、傳代、使用及銷毀等。3、定義標(biāo)準(zhǔn)菌株是指由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌。傳代用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌株制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種， 用于傳代及制備工作用菌種。工作用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌株或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后， 作為日常工作使用的菌種。菌種的代是指將其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內(nèi)， 每萌發(fā)一次即稱為

2、一代， 從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第 0 代。4、職責(zé)4.1 部門主管負(fù)責(zé)菌種的申購、接收、保存分發(fā)。4.2 微生物檢驗員負(fù)責(zé)菌種的確認(rèn)、傳代、使用及銷毀。5、規(guī)程5.1 菌種的申購部門主管根據(jù)菌種的使用情況，提出年度購買計劃（包括臨時檢驗需要） ，填寫申購流程，經(jīng)審批后，向中檢所菌種保藏中心或?。ㄊ校┧帣z所購買凍干菌種（標(biāo)準(zhǔn)菌株）或傳代用菌種，購買時，需確定菌種的代數(shù)，以便控制傳代代數(shù)。5.2 菌種的接收菌種到達(dá)實驗室后， 由部門主管接收菌種， 檢查其名稱和數(shù)量， 以及每一支的完整性，同時將菌種的所有信息，填寫在標(biāo)準(zhǔn)菌株庫存記錄上，內(nèi)容包括：名稱、數(shù)量、編號（無編號者按檢定菌種的編號

3、原則編號） 、代數(shù)、來源、接收日期、接收人等，并將其暫貯存于 48冰箱中，在一周內(nèi)必須完成轉(zhuǎn)種。5.3 菌種的保存5.3.1 工作用菌種的保存工作用菌種采用斜面低溫保存法。將菌種接種在適宜的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，待菌生長充分以后，轉(zhuǎn)移至 48冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應(yīng)隨時檢查其污染雜菌和變異等情況，發(fā)現(xiàn)異常情況，經(jīng)應(yīng)滅活處理后銷毀。保存時間根據(jù)菌種種類而不同，細(xì)菌：每個月轉(zhuǎn)種一次；酵母菌及芽胞： 36 個月轉(zhuǎn)種一次；絲狀真菌每年轉(zhuǎn)種一次。5.3.2 傳代用菌種的保存采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保存法。5.3.2.1 甘油冷凍管保存法用無菌接種環(huán)輕輕刮取經(jīng)冷凍復(fù)溶增菌后并接種

4、至平板或瓊脂斜面的菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦而使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝入試管中的無菌純化水中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于 10 號比濁管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油（濃度20%），即為 10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無菌小試管，在 -30 冷凍條件下保存。此甘油冷凍管為第 2 代（G2）?？梢悦扛?2 年轉(zhuǎn)種一代。使用時，取出一支放至室溫，轉(zhuǎn)種增菌培養(yǎng)或接種至瓊脂斜面復(fù)蘇，挑取純菌落傳代或工作用。此種方法主要適用于需氧細(xì)菌和酵母菌的保藏（如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌）。5.3.2.2 液體石蠟保存法5.3.2.2.1 無菌液體石蠟

5、的制備： 選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟， 將液體石蠟分裝加塞， 用牛皮紙包好，在 121滅菌 30 分鐘 ,置 40恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。5.3.2.2.2 液體石蠟管的制備： 將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中， 在適宜條件下培養(yǎng)結(jié)束后，在層流臺下用無菌吸管吸取上述無菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約 1cm 使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于 -20冷凍或 28冰箱中保存。此法主要適用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽孢桿菌的保存（如枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。5.3.3 各菌種的保存方法、條件及期限，見下表1表 1 傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限菌

6、種名稱保存方法保存溫度保存期限大腸埃希菌 CMCC(B)44102金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26003銅綠假單胞菌（ CMCC（ B） 10104）甘油冷凍管- 302 年枯草芽孢桿菌 CMCC(B)63501乙型副傷寒沙門菌 CMCC(B)50094白色念珠菌 CMCC(F)98001液體石蠟管2- 81 年黑曲霉菌 CMCC(F)980035.4 菌種的處理和保藏5.4.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇、確認(rèn)、傳代5.4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇5.4.1.1.1 物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及 75%酒精棉球。5.4.1.1.2 培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：用于黑曲霉復(fù)蘇、復(fù)壯；液體

7、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：用于生孢梭菌復(fù)蘇、復(fù)壯；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯；改良馬丁培養(yǎng)基：用于白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯5.4.1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇操作步驟：以下操作均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。a) 在安瓿的外表面用 75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。b) 用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線， 用手輕輕將安瓿掰開 （開啟安瓿時必須小心， 因為安瓿遇熱時可能會破裂） 。c)以無菌方法用一無菌吸管從已準(zhǔn)備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.50.8 ml 到安瓿中。d) 輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。e)

8、 用無菌吸管將安瓿內(nèi)菌液全部轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基。f) 根據(jù)安瓿上所標(biāo)明的不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相應(yīng)的溫度 （細(xì)菌培養(yǎng)溫度 30 35，培養(yǎng) 1824 小時；真菌培養(yǎng)溫度 2328，培養(yǎng) 35 天。觀察是否渾濁，渾濁說明菌種復(fù)蘇生長； 若不渾濁，細(xì)菌應(yīng)延長培養(yǎng)時間至 7 天，真菌應(yīng)延長培養(yǎng)時間至 14 天，若仍未渾濁，滅菌處理。g)若黑曲霉為菌懸液，則先放置室溫待菌懸液融化后用無菌吸管吸取管內(nèi)液體12 滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置23 28培養(yǎng) 57 天，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應(yīng)有雜色，斜面?zhèn)让鏌o色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。確認(rèn)后用含有 0.05%（ ml/m

9、l ）的吐溫 -80 的 0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫到無菌試管中。h) 取經(jīng)復(fù)蘇后的上述細(xì)菌菌液 8-10ml 至液體培養(yǎng)基中按 f）項操作對菌種進(jìn)行復(fù)壯。 以無菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入 100ml20%的無菌甘油混勻， 12ml/管，分裝于凍存管。每個菌種制備 10 支，按順序進(jìn)行編號，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)，其余作為儲備管在 -30冷凍條件下保存。黑曲霉按 g）項下方法進(jìn)行復(fù)壯，制成復(fù)壯后的孢子懸液 20ml。以無菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種菌懸液中 12ml/管加石蠟高出菌種表面約 1cm 使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，封存于凍存管，置于 -20冷凍或 28冰箱中保

10、存。制備 10 支，按順序進(jìn)行編號，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲備管。 將上述制備好的凍存管逐支粘貼標(biāo)簽。 內(nèi)容包括：菌種名稱、菌種代號、 編號、代次、制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。i) 儲備菌種管制備成功，儲存于 30，有效期為兩年。5.4.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株的確認(rèn)a) 用無菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物接種到胰酪大豆胨瓊脂（ TSA）培養(yǎng)基（細(xì)菌）或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（真菌和酵母菌）平板上，或相應(yīng)的宜于該菌生長的鑒別培養(yǎng)基平板上。b) 然后在 30 35下培養(yǎng) 3 天（細(xì)菌）； 2025下培養(yǎng) 5 天（真菌和酵母菌） 。c) 培養(yǎng)后，首先觀察其是否具有典型的

11、菌落形態(tài)， 然后挑取生長旺盛的單一的純菌落， 劃線于平皿培養(yǎng)基， 每種菌劃 4 個平皿，以便收集較多的生長旺盛的典型單菌落， 進(jìn)行保存和鑒定。d) 鑒定時作革蘭氏染色、 鏡檢，觀察其染色特性及形態(tài)特征。 必要時再做生化實驗以進(jìn)一步鑒定該菌種。e) 若在該平板上發(fā)現(xiàn)有其它菌落生長，則說明操作有污染或菌種不純，應(yīng)將此被污染了的培養(yǎng)物滅活處理，并尋找原因。應(yīng)根據(jù)其原因采取措施重新分離挑選純菌落。f) 菌種的確認(rèn)結(jié)果，記錄在菌種鑒定記錄上。g) 各菌種的復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件，見菌種復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件（附件 2）。5.4.1.3 菌種的傳代5.4.1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的傳代a)按菌種說

12、明書要求復(fù)溶菌粉，轉(zhuǎn)種于適宜的增菌培養(yǎng)基內(nèi)，稱第 1 代（G1），復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間，分離單個純種菌落，此為第 2 代（ G2）。b) 菌種確認(rèn)后，挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管或液體石蠟管， 作為保存菌種（ G2），也稱傳代用菌種，同時挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌種，此為第 3 代（ W3）。c) 將第 2 代（G2）菌種管冷凍保存，將工作用菌（ W3）于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間后用于日常檢驗。d) 取一支冷凍保存的第 2 代（ G2）菌種轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上。平板上的菌種制成冷凍保存管第 3 代（G3）；斜面培養(yǎng)基的菌種經(jīng)適當(dāng)溫度下

13、培養(yǎng)適當(dāng)時間后用作工作用菌種，此仍為第 3 代（ W3）。e)將第 3 代菌種（ G3）冷凍或低溫保存，將生長、轉(zhuǎn)種后的第2 代（ G2）菌種經(jīng)高溫滅活處理后丟棄。f) 按上述規(guī)程操作，直至 G4 轉(zhuǎn)為 W5 為止，需重新開啟冷凍干燥菌種，重復(fù)上述規(guī)程操作，保存和使用菌種。g) 當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于 5 時，在規(guī)定保存期限內(nèi)， 可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。5.4.1.3.2 傳代用菌的傳代將購回?zé)o異常的傳代用菌種（一般為第 3 代），根據(jù)日常檢驗工作的需要量，挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支， 作為工作用菌種 (為第 4 代 )，同時，結(jié)合菌種的代數(shù)和最長保存期限，挑取純菌落制成濃

14、菌懸液按“5.3.2 ”的方法制備甘油冷凍管或液體石蠟管數(shù)支，作為傳代用菌種（仍為第3 代）。5.4.1.3.2.1 傳代用菌的傳代操作步驟從冰箱冷藏室（ 28）中取出菌種斜面后，應(yīng)溫室放置約30min。將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基和傳代菌種一并移入生物安全柜內(nèi)，打開紫外燈照射1 小時。關(guān)閉紫外燈。酒精燈，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種環(huán)，將接種環(huán)燒紅約 30s，5.4.1.3.2 工作用菌種的傳代當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于 5 時，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。取在冰箱 48保存的工作用菌種用普通瓊脂斜面?zhèn)鞔⑿聜鞔呐囵B(yǎng)物替代原有的菌種，作為工作用菌種。也可取用

15、“甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法 ”保存的菌種，進(jìn)行復(fù)蘇，直接作為工作用菌種。細(xì)菌每 1 個月傳代一次；酵母菌每 2 個月傳代一次；霉菌及芽胞每 3 個月傳代一次。當(dāng)超過 5 代，須用傳代用菌種傳代。5.4.4 注意事項：傳代時注意無菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丟失。同時實驗人員也要采取有效的預(yù)防措施進(jìn)行自我保護(hù)，如工作時必須穿工作服，佩帶無菌手套，實驗完成以后消毒實驗進(jìn)行的區(qū)域、實驗儀器和器具。如發(fā)生意外，如菌種泄漏或人員受傷，微生物學(xué)檢驗人員應(yīng)立即向部門主管報告以便及時進(jìn)行處理。5.4.5 傳代后，按檢定菌種的編號原則編號，并在每一支菌種管上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽內(nèi)容包括：名稱、編號、代

16、數(shù)、傳代日期、操作人、有效期。交部門主管統(tǒng)一保管。同時及時填寫菌種傳代記錄（附表 2）。5.5 檢定菌種的編號采用字母加數(shù)字表示：英文縮寫字母 代次 傳代日期 順序號菌種的英文縮寫字母：大腸埃希菌（E.c）、金黃色葡萄球菌（ S.a）、枯草芽孢桿菌（ B.s）、白色念珠菌（ C.a）、黑曲霉菌（ A.n ）、乙型副傷寒沙門菌（S.p）代數(shù)用一位帶有下標(biāo)數(shù)字的字母表示：傳代用菌種用 G 表示；工作用菌種用 W 表示；如 G3 表示傳代用菌種第3 代；W3 表示工作用菌種第 3 代。傳代日期用 6 位數(shù)字表示：年份取最后兩位數(shù)，月、日分別用兩位數(shù)。如：2015年 1月 12日傳代的第一支大腸埃希菌

17、作為傳代用菌種的編號為E.c-G3-120112-01。5.6 檢定菌種的保管5.6.1 檢定菌種設(shè)專人加雙鎖保管， 并對所保存的菌種建立 檢定菌種保存、 領(lǐng)用登記臺賬（附表 3）。5.6.2 檢定菌種的定期檢查與鑒定在菌種的保存期間，工作日應(yīng)每天檢查保存菌種冰箱的溫度、必要時檢查菌種管的塞子是否松動，是否染雜菌等，并及時填寫檢定菌種觀察記錄 （附表 4），如有異常應(yīng)及時處理。菌種在保存期內(nèi)均應(yīng)根據(jù)菌種的特性（工作用菌種每轉(zhuǎn)種兩代一次、傳代用菌種每三個月一次）檢查其菌落性狀、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)，必要時檢查生化特性等項目，若發(fā)現(xiàn)與原菌種變異較大，應(yīng)重新分離、純化、鑒定、再加以保存，并做好

18、檢定菌種鑒定記錄（附表 5）。5.6.3 所保管的菌種，不能隨意轉(zhuǎn)讓其他單位和個人，需要時應(yīng)有單位證明和批準(zhǔn)手續(xù)方可供應(yīng)。5.7 檢定菌種的使用5.7.1 微生物學(xué)檢驗人員根據(jù)檢驗需要，需到部門主管領(lǐng)取工作用菌種或傳代用菌種，同時填寫檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺賬 。5.7.2 微生物學(xué)檢驗人員從部門主管領(lǐng)取工作用菌種或傳代用菌種，用于日常檢驗或驗證試驗，使用后及時填寫檢定菌種使用登記臺賬 （附表 6），以便追蹤菌種使用歷史。5.7.3 菌液的制備：將新鮮的斜面菌種培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10-100cfu/ml的菌懸液，置于04冰箱冷藏，用于陽性對照實驗，使用期24h，

19、濃菌液放冰箱可保存一周。5.8檢定菌種（廢棄）的銷毀5.8.1 下列情況的菌種或培養(yǎng)物或被污染的器具等，必須采用 121、45 分鐘濕熱滅活處理：a、新一代菌種制備成功后的上一代菌種；b、使用完后的菌種和帶有標(biāo)準(zhǔn)菌株的器具和培養(yǎng)物；c、超過有效期的菌種；d、凡被污染、變異、可疑等異常情況菌種；e、其他應(yīng)廢棄的菌種。5.8.2 廢棄菌種的銷毀由微生物檢驗員提出申請，交部門主管批準(zhǔn)后，進(jìn)行滅活處理，并有其他人在場監(jiān)督，并填寫廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄 （附表 7）。6、相關(guān)文件：初始污染菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 、純化水檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 、中國藥典標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程等。7、注意事項：8.1、微生物檢驗人員最

20、好生物相關(guān)專業(yè)，要經(jīng)過培訓(xùn)，取證上崗。8.2、購買菌種要保留相關(guān)證明，最好讓藥檢所開個證明，說明購買菌種的名稱、菌種代數(shù)、數(shù)量等，把這個證明附在菌種接受記錄后。8.3、菌種的傳代、使用在陽性操作間，為保護(hù)菌種和人員，最好使用生物安全柜。8.4、菌種常用的是10-100cfu/ml 的菌懸液，可根據(jù)預(yù)實驗，確定制備方法。如果是細(xì)菌：可參照麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管進(jìn)行估算。從孵育 18-24 小時的非選擇性培養(yǎng)基上，挑取 3-5 個菌落，直接用肉湯或鹽制成懸液作為接種，一般將濁度調(diào)整至麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)管 10 號對應(yīng)濃度，然后稀釋。麥?zhǔn)媳葷峁芘渲品椒ǎ?.048MBaCL 2(1.17%W/VBaCL 2 2H2 O) 、 0.36NH2SO4(1%V/V)將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存，用前混勻。有效期為6 個月。應(yīng)用時，可目測或使用比濁儀即可。0號管對應(yīng)的菌濃度為30108cfu/ml ，稀釋一般用無菌生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）。8、附表附表 1：檢定菌接收記錄附表 2：檢定菌種傳代記錄附表 3：檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺賬附表 4：檢定菌種觀察記錄附表 5：檢定菌種鑒定記錄附表 6：檢定菌種使用登記臺賬附表 7：廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄附表 1：檢定菌接