免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA

1、免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用 ELISAELISA 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?v了解和掌握免疫酶技術(shù)的測定原理。 v掌握酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)的操作步驟，學(xué)會(huì)利 用競爭ELISA的方法，定量測定抗體或抗原。 v了解免疫酶技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的重要意義 及應(yīng)用價(jià)值。 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 免疫標(biāo)記技術(shù)（免疫標(biāo)記技術(shù)（immunolabelling techniqueimmunolabelling technique）: : 是指用熒光素、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或是指用熒光素

2、、放射性同位素、酶、發(fā)光劑或 電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行電子致密物質(zhì)等作為示蹤劑，標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行 的抗原抗體反應(yīng)。的抗原抗體反應(yīng)。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位 分類：分類：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、 免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測定。免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測定。 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)(enzyme immunoassay)(enzyme immunoassay)： 是將抗原和抗體的特異性免疫反應(yīng)與 酶

3、的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種免疫檢 測技術(shù)。 就是利用酶標(biāo)記抗體或抗原，以檢測 相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISAELISA （enzyme linked immunosorbent assayenzyme linked immunosorbent assay） 是一類常用的免疫酶技術(shù)。是將已知是一類常用的免疫酶技術(shù)。是將已知 的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使 抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行。 常用的酶：常用的酶：辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(HRP)(HR

4、P) 堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（APAP）。）。 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA ELISAELISA檢測抗原檢測抗原 Ag +Ag + Ab Ab* * Ag-Ab Ag-Ab* * 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA ELISAELISA檢測抗體檢測抗體 Ab +Ab + Ag Ag* * Ab-Ag Ab-Ag* * 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA ELISAELISA檢測抗體檢測抗體 Ag + Ab1 Ag + Ab1 Ag-Ab1 Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2Ag-Ab1 + Ab2* * Ag-Ab1-Ab2 Ag-Ab1-Ab2* * 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 免疫酶技

5、術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 競爭競爭 ELISAELISA 檢測檢測 抗原抗原 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 固定固定OD值值 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料： 羊抗人血清白蛋白抗體（一抗）羊抗人血清白蛋白抗體（一抗） 已知含量的人血清白蛋白（作標(biāo)準(zhǔn)曲線）已知含量的人血清白蛋白（作標(biāo)準(zhǔn)曲線） 待檢人血清白蛋白待檢人血清白蛋白 辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊抗體（二抗）辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗羊抗體（二抗） 包被液包被液CBSCBS：PH9.6PH9.6，0.05mol/L0.05mol/L碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液 洗板液或稀釋液：洗板液或稀釋液：PH7.4PH7.4，0.01mo

6、l/L PBS0.01mol/L PBS 底物溶液：底物溶液：OPD-HOPD-H2 2O O2 2 終止液：終止液：2mol/L H2mol/L H2 2S0S04 4 酶標(biāo)反應(yīng)板（一條酶標(biāo)反應(yīng)板（一條/ /人）人） 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 三、操作步驟三、操作步驟 包被抗原包被抗原 抗原用包被液（CBS）稀釋至合適濃度，加入到酶標(biāo)酶標(biāo) 板板中，100l/孔，放入濕盒中，4過夜。 次日，用洗板液洗板3次（將洗板液加入每孔，1min后 傾去），以洗去未包被的游離抗原。 抗原抗原100ul/孔孔 濕盒中，4過夜 酶標(biāo)板酶標(biāo)板 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 抗原與抗體的預(yù)孵育抗原與抗體的

7、預(yù)孵育 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線： 在稀釋板中，用PBS倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)抗原，每種濃度 的抗原最終為50l，分別在各抗原孔中加入250l一定濃 度的抗體，放入37恒溫培養(yǎng)箱中30 min。 待測抗原：待測抗原： 取50l未知濃度的抗原按照同上操作。 待測抗原待測抗原 50ul50ul PBSPBS 50ul 50ul 稀釋液稀釋液 50ul 50ul 100ul 100ul 標(biāo)準(zhǔn)抗原標(biāo)準(zhǔn)抗原 250ul抗體抗體 稀釋板 37，30 min 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 3. 3. 與固相抗原的競爭結(jié)合與固相抗原的競爭結(jié)合 取稀釋板中預(yù)孵育的抗原抗體混合液100l，加入 酶標(biāo)板的抗原孔中，放入3

8、7恒溫培養(yǎng)箱中60 min。洗 板3次。 100ul 稀釋板稀釋板 酶標(biāo)板酶標(biāo)板 37，60 min 洗板3次 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 4. 4. 酶標(biāo)二抗的結(jié)合酶標(biāo)二抗的結(jié)合 酶標(biāo)抗體用稀釋液稀釋至工作濃度后，加入每孔中， 100ul/孔，置濕盒中放37 30min。洗板3次。 5. 5. 加入底物顯色液加入底物顯色液（用前再配制，并置棕色瓶內(nèi)） 每孔加入底物顯色液，100ul/孔，濕盒中37保溫一定 時(shí)間。 6. 6. 終止反應(yīng)終止反應(yīng) 待出現(xiàn)明顯顏色反應(yīng)（或一定時(shí)間）后，加入終止液， 50ul/孔以終止反應(yīng)。 7. 7. 結(jié)果測定結(jié)果測定 用酶標(biāo)儀在492nm波長下測定OD值。 以標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算未知抗原的濃度。 免疫酶技術(shù)及其應(yīng)用-ELISA 四、思考題四、思考題 在定量測定抗原時(shí)，直接ELISA與競爭ELISA有何 區(qū)別？從理論上分析一下各自的優(yōu)缺點(diǎn)。 在實(shí)