第22章免疫學檢測技術基本原理

1、第22章免疫學檢測技術基本原理 第第22章章 免疫學檢測原理免疫學檢測原理 免疫學檢測是指借助免疫學、細胞生物學、 分子生物學等理論或方法，對抗原、抗體、 免疫細胞及細胞因子等進行定性、定量檢測。 臨床醫(yī)學中，免疫學檢測可用于免疫相關疾 病的診斷、病情檢測和療效評價等。 第22章免疫學檢測技術基本原理 第一節(jié)第一節(jié) 基于抗原基于抗原- -抗體反應的檢測方法抗體反應的檢測方法 第二節(jié)第二節(jié) 免疫細胞檢測免疫細胞檢測 第三節(jié)第三節(jié) 分子生物學技術在免疫學上的應用分子生物學技術在免疫學上的應用 本章內(nèi)容本章內(nèi)容 第22章免疫學檢測技術基本原理 第一節(jié)第一節(jié) 基于抗原基于抗原- -抗體反應的檢測方法抗

2、體反應的檢測方法 一、抗原抗體反應概念一、抗原抗體反應概念 抗原與相應抗體在體內(nèi)、外發(fā)生的高度特異性結(jié)合反應。在抗原與相應抗體在體內(nèi)、外發(fā)生的高度特異性結(jié)合反應。在 合適條件下所進行的體外反應中，抗原與相應抗體特異性結(jié)合適條件下所進行的體外反應中，抗原與相應抗體特異性結(jié) 合可呈現(xiàn)某種反應現(xiàn)象（如凝集、沉淀）。由于實驗所用抗合可呈現(xiàn)某種反應現(xiàn)象（如凝集、沉淀）。由于實驗所用抗 體存在于血清中，故又稱血清學反應。體存在于血清中，故又稱血清學反應。 第22章免疫學檢測技術基本原理 二、抗原抗體反應的特點二、抗原抗體反應的特點 高度特異性高度特異性 可精確區(qū)分物質(zhì)間極微細的差異?？删_區(qū)分物質(zhì)間極微細

3、的差異。 表示為表示為 親和力親和力：一個抗原表位與相應抗體單一抗原：一個抗原表位與相應抗體單一抗原 結(jié)合位點間的結(jié)合能力。結(jié)合位點間的結(jié)合能力。 親合力親合力：指一個抗體分子與整個抗原大分子：指一個抗體分子與整個抗原大分子 間的結(jié)合強度，與抗原表位數(shù)目有關。間的結(jié)合強度，與抗原表位數(shù)目有關。 第22章免疫學檢測技術基本原理 2.抗原抗體結(jié)合的帶現(xiàn)象與可見性抗原抗體結(jié)合的帶現(xiàn)象與可見性 抗原抗體結(jié)合存在帶現(xiàn)象（前帶、等帶、后帶），適宜的抗原抗體濃度和比例抗原抗體結(jié)合存在帶現(xiàn)象（前帶、等帶、后帶），適宜的抗原抗體濃度和比例 （等帶）決定抗原抗體結(jié)合后能否出現(xiàn)肉眼可見的反應；（等帶）決定抗原抗體結(jié)

4、合后能否出現(xiàn)肉眼可見的反應； 第22章免疫學檢測技術基本原理 3. 表面化學基團之間的可逆結(jié)合表面化學基團之間的可逆結(jié)合 抗原抗體結(jié)合除了空間結(jié)構(gòu)互補外，主要以氫鍵、范德華力抗原抗體結(jié)合除了空間結(jié)構(gòu)互補外，主要以氫鍵、范德華力 和疏水鍵等非共價結(jié)合。易受溫度、酸堿度和離子強度的影和疏水鍵等非共價結(jié)合。易受溫度、酸堿度和離子強度的影 響而解離，解離后抗原抗體仍具有原有特性，可借助親和層響而解離，解離后抗原抗體仍具有原有特性，可借助親和層 析法純化抗原或抗體。析法純化抗原或抗體。 抗原抗體反應的抗原抗體反應的2個階段個階段 第第1階段是抗原抗體特異性結(jié)合，可在數(shù)秒鐘至幾分鐘內(nèi)完階段是抗原抗體特異性

5、結(jié)合，可在數(shù)秒鐘至幾分鐘內(nèi)完 成；第成；第2階段是小的抗原抗體復合物靠正負電荷吸引形成較階段是小的抗原抗體復合物靠正負電荷吸引形成較 大復合物，所需時間從數(shù)分鐘至數(shù)日不等。大復合物，所需時間從數(shù)分鐘至數(shù)日不等。 第22章免疫學檢測技術基本原理 三、抗原抗體反應的影響因素三、抗原抗體反應的影響因素 電解質(zhì)電解質(zhì) 抗原抗體等電點分別為抗原抗體等電點分別為pH3-5和和pH5-6，在中性或，在中性或 弱堿性條件下表面帶有較多負電荷，適當濃度的電解質(zhì)會使弱堿性條件下表面帶有較多負電荷，適當濃度的電解質(zhì)會使 它們失去一部分負電荷而相互結(jié)合；它們失去一部分負電荷而相互結(jié)合； 溫度溫度 通常為通常為37，適

6、當提高反應溫度可增加抗原與抗體，適當提高反應溫度可增加抗原與抗體 分子的碰撞機會，但分子的碰撞機會，但56以上可使抗原或抗體變性失活；以上可使抗原或抗體變性失活； 1.酸堿度酸堿度 抗原抗體反應的最適抗原抗體反應的最適pH值在值在6-8之間，之間，pH值過高值過高 或過低均可直接影響抗原抗體的理化性質(zhì)。當或過低均可直接影響抗原抗體的理化性質(zhì)。當pH值接近等值接近等 電點時，抗原抗體多帶正負電荷相等，由于自身吸引而出現(xiàn)電點時，抗原抗體多帶正負電荷相等，由于自身吸引而出現(xiàn) 凝集，導致非特異性反應。凝集，導致非特異性反應。 第22章免疫學檢測技術基本原理 四、抗原抗體反應檢測技術的應用四、抗原抗體反

7、應檢測技術的應用 抗原與相應抗體在體內(nèi)、外發(fā)生的高度特異性結(jié)合反應。在合抗原與相應抗體在體內(nèi)、外發(fā)生的高度特異性結(jié)合反應。在合 適條件下所進行的體外反應中，抗原與相應抗體特異性結(jié)合可適條件下所進行的體外反應中，抗原與相應抗體特異性結(jié)合可 呈現(xiàn)某種反應現(xiàn)象（如凝集、沉淀）。由于實驗所用抗體存在呈現(xiàn)某種反應現(xiàn)象（如凝集、沉淀）。由于實驗所用抗體存在 于血清中，故又稱血清學反應。于血清中，故又稱血清學反應。 第22章免疫學檢測技術基本原理 五、抗原五、抗原-抗體反應的基本檢測方法抗體反應的基本檢測方法 第22章免疫學檢測技術基本原理 Ab Ag 高親和力 Ab Ag 低親和力 特異性特異性 結(jié)合力的

8、表示方法結(jié)合力的表示方法親和力和親合力親和力和親合力 低親合力 高親合力 Ag-Ab反應的原理反應的原理 第22章免疫學檢測技術基本原理 Ab 過剩Ag 過剩 比例適當，交聯(lián)成網(wǎng)絡 Ag-Ab反應的可見性反應的可見性 第22章免疫學檢測技術基本原理 1.凝集反應凝集反應 直接凝 集反應 1:2稀釋待測血清 1:4 1:8 1:16 細菌、細胞等顆粒性Ag或表面包被抗原的顆粒狀物質(zhì)與相應Ab在電解質(zhì)存在的情況 下直接反應，二者比例合適時，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團現(xiàn)象。 玻片法 試管法 常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定 選擇最佳稀釋濃度， 常用于檢測抗體的滴 度或效價，見于臨床 診斷傷寒或副傷寒所 用的

9、肥達氏反應和診 斷布氏菌病所用的瑞 特試驗。 第22章免疫學檢測技術基本原理 間接凝集反應間接凝集反應 將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應Ab/Ag進 行反應產(chǎn)生凝集，叫間接凝集反應。如將溶血毒素O吸附于乳膠顆粒上的抗“O” 試驗、人IgG作為Ag吸附于乳膠顆粒上的類風濕因子檢測。 凝集反應常用于溶血性疾病的診斷： + 病人的病人的RBC體內(nèi)體內(nèi)anti-Rh 由于抗體多屬于由于抗體多屬于IgG，分子，分子 量較小，抗體與紅細胞間的量較小，抗體與紅細胞間的 結(jié)合力不能克服細胞間的排結(jié)合力不能克服細胞間的排 斥力，不出現(xiàn)凝集斥力，不出現(xiàn)凝集 + 體外加入體外加入

10、 抗人抗人IgG 出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象， 叫直接庫姆試驗叫直接庫姆試驗 正常人正常人O型血型血 的的Rh+的的RBC + 患者血清內(nèi)的患者血清內(nèi)的 游離游離anti-Rh + 體外加入體外加入 抗人抗人IgG 出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象， 叫間接庫姆試驗叫間接庫姆試驗 第22章免疫學檢測技術基本原理 2.沉淀反應沉淀反應 AgAgAgAg Ab in gel 單向免疫擴散單向免疫擴散 Ag1 Ab Ag2Ag3Ag4 雙向免疫擴散雙向免疫擴散 免疫比濁免疫比濁 過量Ab Ab Ab Ab 毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應抗體反應后，出現(xiàn)肉眼可見的沉 淀物，稱為沉淀反應。沉淀

11、反應可在液體中進行，也可在半固體瓊脂凝膠中進行。 鑒定多種抗原是完全相同、鑒定多種抗原是完全相同、 部分相同或完全不同部分相同或完全不同 用于確定用于確定 抗原濃度抗原濃度 第22章免疫學檢測技術基本原理 沉淀反應沉淀反應免疫電泳免疫電泳 存在于不同區(qū)域的抗原與抗存在于不同區(qū)域的抗原與抗 體結(jié)合，在比例適宜處形成體結(jié)合，在比例適宜處形成 沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位 置和形狀與標準品相對比，置和形狀與標準品相對比， 可分析樣品的成分及其性質(zhì)。可分析樣品的成分及其性質(zhì)。 第22章免疫學檢測技術基本原理 3.免疫標記技術免疫標記技術 免疫酶測定法免疫酶測定法 免疫熒光技術免疫熒

12、光技術 放射免疫測定法放射免疫測定法 免疫膠體金技術免疫膠體金技術 第22章免疫學檢測技術基本原理 免疫酶測定法免疫酶測定法 夾心法夾心法ELISA 間接間接ELISA BASELISA 利用生物利用生物 素和抗生物素蛋白為橋梁素和抗生物素蛋白為橋梁 微粒捕獲酶免疫分析技術微粒捕獲酶免疫分析技術 將已知特異性抗體致敏的將已知特異性抗體致敏的 免疫微粒與生物素、親和免疫微粒與生物素、親和 素、酶相結(jié)合，最后酶作素、酶相結(jié)合，最后酶作 用于熒光底物發(fā)光，通過用于熒光底物發(fā)光，通過 檢測熒光強度判斷未知抗檢測熒光強度判斷未知抗 原的含量。原的含量。 a） b） 第22章免疫學檢測技術基本原理 免疫組

13、化技術免疫組化技術 定位、定性、定量檢測 第22章免疫學檢測技術基本原理 免疫熒光技術免疫熒光技術 第22章免疫學檢測技術基本原理 放射免疫測定放射免疫測定 用放射性核素標記抗原或抗體進行的免疫測定。將 同位素的敏感性與抗原抗體結(jié)合的特異性結(jié)合起來， 具有重復性好、準確性高等優(yōu)點，廣泛應用于激素、 藥物等微量物質(zhì)的檢測。常用的有131I、125I。 化學發(fā)光免疫技術化學發(fā)光免疫技術 將化學發(fā)光分析和免疫反應相結(jié)合而建立的一種新 的免疫分析技術。最常用的發(fā)光物質(zhì)是魯米諾。 靈敏度高、簡便、可實現(xiàn)自動化分析。 第22章免疫學檢測技術基本原理 免疫膠體金技術免疫膠體金技術 用膠體金顆粒標記Ab/Ag

14、，以檢測未知Ag/Ab的方法。 氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負電的 疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。 該技術可應用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。 第22章免疫學檢測技術基本原理 免疫印跡法免疫印跡法-Western blotting 第22章免疫學檢測技術基本原理 4.4.蛋白質(zhì)芯片技術蛋白質(zhì)芯片技術 又稱為蛋白質(zhì)微列陣，指固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)構(gòu)成的微列陣。 根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理，可實現(xiàn)快速、準確、高通量的檢測。 第22章免疫學檢測技術基本原理 第二節(jié)第二節(jié) 免疫細胞檢測免疫細胞檢測 淋巴細胞及其淋巴細胞及其 亞群的分離亞群

15、的分離 免疫細胞免疫細胞 功能測定功能測定 磁珠分磁珠分 離法離法 免疫吸附免疫吸附 分離法分離法 流式細流式細 胞術胞術 肽肽MHC四聚四聚 體技術體技術 T細胞功細胞功 能測定能測定 B細胞功細胞功 能測定能測定 細胞因細胞因 子檢測子檢測 T細胞增 殖試驗 遲發(fā)型超 敏反應的 檢測 抗體含 量測定 溶血空 斑試驗 巨噬細胞 吞噬試驗 細胞毒細胞毒 試驗試驗 吞噬功吞噬功 能測定能測定 51Cr釋放法 乳酸脫氫 酶釋放法 細胞染 色法 凋亡細胞 檢測法 硝基藍四 氮唑試驗 生物活性 檢測法 免疫學檢 測法 第22章免疫學檢測技術基本原理 一、免疫細胞及其亞類計數(shù)一、免疫細胞及其亞類計數(shù) 稀

16、釋 血液 淋巴細胞 分離液(葡 聚糖-泛影 葡胺 r=1.078) 離心 單 個核細 胞 (PBMC，包 括淋巴細胞、 DC和NK) 紅細胞和 粒細胞 血漿 外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞的分離 第22章免疫學檢測技術基本原理 外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞的分離 稀釋 血液 淋巴細胞分 離液(葡聚糖 -泛影葡胺 r=1.078) 離心 單 個核細胞 (PBMC，包 括淋巴細胞、 DC和NK) 紅細胞和 粒細胞 血漿 第22章免疫學檢測技術基本原理 磁珠分離法磁珠分離法 免疫吸附分離法免疫吸附分離法 流式細胞術流式細胞術 肽肽MHC四聚體技術四聚體技術 淋巴細胞及其亞群的分離淋

17、巴細胞及其亞群的分離 第22章免疫學檢測技術基本原理 免疫吸附分離法免疫吸附分離法 加入淋巴 細胞懸液 anti-CD4 anti-CD4 anti-CD4 棄上清 第22章免疫學檢測技術基本原理 磁珠分離法磁珠分離法 第22章免疫學檢測技術基本原理 流式細胞術流式細胞術 熒光抗體標 記混合細胞 噴嘴 單細胞懸液 5000-10000個/秒 細胞分選器 熒光 檢測器 第22章免疫學檢測技術基本原理 抗原肽抗原肽-MHC四聚體分離技術四聚體分離技術 親和素親和素 抗原肽抗原肽 MHC I 生物素生物素 anti-CD8 肽-四聚體 肽特異性CD8T CD4T及B 非肽特異性CD8T 熒光素熒光素

18、 第22章免疫學檢測技術基本原理 二、免疫細胞功能的測定二、免疫細胞功能的測定 T細胞功細胞功 能測定能測定 B細胞功細胞功 能測定能測定 細胞因細胞因 子檢測子檢測 T細胞增 殖試驗 遲發(fā)型超 敏反應的 檢測 抗體含 量測定 溶血空 斑試驗 巨噬細胞 吞噬試驗 細胞毒細胞毒 試驗試驗 吞噬功吞噬功 能測定能測定 51Cr釋放法 乳酸脫氫 酶釋放法 細胞染 色法 凋亡細胞 檢測法 硝基藍四 氮唑試驗 生物活性 檢測法 免疫學檢 測法 第22章免疫學檢測技術基本原理 T細胞功細胞功 能測定能測定 T細胞增 殖試驗 遲發(fā)型超 敏反應的 檢測 T細胞受到特異性抗原或有絲分裂原刺激后發(fā)生增殖，可通過以

19、下三種 方法檢測： 形態(tài)計數(shù)法：活化細胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)增多、細胞核 松散及出現(xiàn)較多核仁； 3H-TdR或125I-UdR摻入法：3H-TdR能摻入到合成的DNA中，用液 體閃爍儀檢測樣品的放射活性，特點是靈敏可靠，但須特殊儀器， 易有放射性污染。 1. MTT (四甲基偶氮唑鹽)比色法： 外來抗原刺激機體產(chǎn)生免疫應答后，再用相同的抗原作皮試， 可導致遲發(fā)型超敏反應，T細胞活化并釋放多種細胞因子，產(chǎn)生 以單個核細胞浸潤為主的炎癥，局部發(fā)生充血滲出，24-48h發(fā) 生，72h到達高峰。陽性反應表現(xiàn)為局部紅腫和硬結(jié)，反應強烈 的發(fā)生水腫甚至壞死。細胞免疫正常者出現(xiàn)陽性反應，細胞免 疫低下

20、者呈弱陽性或陰性反應。常用于檢測某些微生物感染。 第22章免疫學檢測技術基本原理 B細胞功細胞功 能測定能測定 抗體含 量測定 溶血空 斑試驗 可通過單項瓊脂擴散法、ELISA、速率比濁法等測定標本中各類Ig的含量。 綿羊紅細胞 (SRB C)免 疫動物 4天后取出動物 脾臟，在脾細胞 懸液中含有抗 SRBC的漿細胞 脾細胞與 SRBC在適量 瓊脂糖液中混 勻 在抗體形成細胞周圍出 現(xiàn)溶解的透明區(qū)，即溶 血空斑。1個空斑區(qū)代表 1個漿細胞 通過記錄溶血空斑的數(shù) 目可知抗原特異性B細胞 的數(shù)目 加入新鮮補體， 倒入平皿中培養(yǎng) 第22章免疫學檢測技術基本原理 細胞毒細胞毒 試驗試驗 51Cr釋放法

21、 乳酸脫氫 酶釋放法 細胞染 色法 靶細胞被殺傷后，向體系中加入臺盼蘭，可進入膜破損 的細胞內(nèi)，將細胞染成藍色?；罴毎苋径恢?。 第22章免疫學檢測技術基本原理 凋亡細胞 檢測法 瓊脂糖電泳法 正常細胞基因組DNA 凋亡細胞 TUNEL法 在細胞中加入末端脫氧 核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和生 物素標記的核苷酸 TdT能在游離的DNA3端 缺口連接標記的核苷酸 加入親和素-酶復合物， 在DNA斷裂處顯色 流式細胞術 Annexin V PI 凋亡 早期 凋亡 晚期 壞死 期 第22章免疫學檢測技術基本原理 巨噬細胞 吞噬試驗 吞噬功吞噬功 能測定能測定 硝基藍四氮 唑(NBT)試驗 NBT在殺菌

22、過程中產(chǎn)生反應性氧中間物，其中超氧陰離子能使被吞 噬進細胞內(nèi)的NBT還原成不溶性藍黑色甲臜顆粒，沉積于胞漿中。 光鏡下計數(shù)NBT陽性細胞可反映PMN的殺傷功能。 將待測mf與雞紅細胞混合溫育后，雞紅細胞被mf吞噬，根據(jù)吞噬 百分率確定mf吞噬能力。 吞噬百分率=吞有紅細胞的mf/mf總數(shù) 第22章免疫學檢測技術基本原理 細胞因細胞因 子檢測子檢測 生物活性 檢測法 免疫學檢 測法 夾心ELISA或ELISPOT 熒光素標記抗體染胞內(nèi)細胞因子，F(xiàn)ACS分析 細胞增殖或增殖抑制法，如細胞因子依賴性或 抑制性細胞株 細胞病變抑制法，如感干擾素抑制病毒感染性 細胞損傷 第22章免疫學檢測技術基本原理 檢測B細胞 產(chǎn)生的抗體 檢測T細胞 產(chǎn)生的CK 酶聯(lián)免疫斑點試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗- -ELISpot 第