微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

1、課題1 1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識(shí)，進(jìn)行無 菌技術(shù)的操作，進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。 一、課題目標(biāo)： 掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和 平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范 地進(jìn)行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。 無菌技術(shù)的操作。 二、課題重點(diǎn)和難點(diǎn)： 三、技能目標(biāo)： 課題1 1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 一、基礎(chǔ)知識(shí) 微生物: : 1.1.特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單, ,個(gè)體多數(shù)十分微小. .通常要 用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒 有細(xì)胞結(jié)構(gòu). .且體內(nèi)一般不含有葉綠素. .不能進(jìn)行光 合作用. . 2.微生物包括五類 病 毒 細(xì) 菌 放線菌 真 菌 原生動(dòng)物 菌落： 單個(gè)或少數(shù)

2、細(xì)菌在固體培養(yǎng) 基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成 一個(gè)肉眼可見的，具有一定 形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫 做菌落。 不同的細(xì)菌的菌落特征不同 菌落是鑒定菌種的重要依據(jù) 固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔 1、定義 為人工培養(yǎng)微生物而制備的、提供適合微生 物生長(zhǎng)、繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。 2、分類 天然培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中化學(xué)成分分： 合成培養(yǎng)基 半合成培養(yǎng)基 (二)、培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基 按物理形態(tài)分： 固體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基 、常用的固體培養(yǎng)基: 瓊脂固體培養(yǎng)基. 、微生物在固體培養(yǎng) 基表面生長(zhǎng),可以形成 肉眼可見的菌落. 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 按培養(yǎng)基功能分： 選擇培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基 加入青霉素的培養(yǎng)基: :

3、 分離酵母菌、霉菌等真菌 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: : 分離金黃色葡萄球菌 不加氮源的無氮培養(yǎng)基: : 分離固氮菌 不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基: : 分離自養(yǎng)型微生物 加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: : 分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞 加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的 培養(yǎng)基: : 分離雜交瘤細(xì)胞 3、培養(yǎng)基內(nèi)所含的基本物質(zhì) (1)、水 (2)、碳源 (3)、氮源 (4)、無機(jī)鹽 (2)碳源 可作為碳源的物質(zhì)有: 含碳無機(jī)物: 、 、 含碳有機(jī)物： 蛋白質(zhì) 脂肪酸 返回 不同微生物所利用的碳源不同 異養(yǎng)型微生物的碳源為 自養(yǎng)型微生物的碳源為 碳酸鹽碳酸氫鹽二氧化碳 糖類（主要） 含碳有機(jī)物（

4、有機(jī)碳） 含碳無機(jī)物（無機(jī)碳） (3)氮源 可作為氮源的物質(zhì)有: 含氮無機(jī)物： 、 、 、 含氮有機(jī)物： 蛋白胨 牛肉膏 尿素 返回 固氮微生物所利用的氮源是 氮?dú)?氨氣硝酸鹽氨鹽 氮?dú)?(1)、pH值 如:培養(yǎng)霉菌需酸性、培養(yǎng)細(xì)菌需中性或微堿性 (2)、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)- ? 如：培養(yǎng)乳酸桿菌需要在培養(yǎng)基中添加維生素 (3)、氧氣的含量 如:培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)需要提供無氧的條件 4、培養(yǎng)基內(nèi)所需的其他條 件 生長(zhǎng)因子 無菌技術(shù)包括的四大方面 1、對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn) 行清潔和消毒。 2、將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng) 基等器具進(jìn)行滅菌。 3、為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，

5、實(shí)驗(yàn)操作 應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。 4、實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的餓材料用 具與周圍的物品相接觸。 返回 (三)、無菌技術(shù) 1、獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵: 2、無菌技術(shù)包括的四大方面 3、消毒與滅菌 (1)消毒： 概念：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體 表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物。包括芽孢 和孢子嗎？ 方法: 煮沸消毒法 巴氏消毒法:如牛奶的消毒 化學(xué)藥劑消毒:酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等 紫外線消毒 (不包括芽孢和孢子) 防止外來雜菌的入侵 （2）滅菌 概念：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的 微生物，包括芽孢和孢子。 方法：a 灼燒滅菌 b 干熱滅菌 c 高壓蒸汽滅 菌

6、 灼燒滅菌 微生物的接種工具 (接 種環(huán)、接種針)或其 他金屬用具直接在火 焰的充分燃燒層灼燒 注意適用范圍 干熱滅菌 160170 ；12h 能耐高溫的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿) 高壓蒸汽滅菌 100kPa 121 15-30min 通常用于培養(yǎng)基的滅 以手提式滅菌鍋?zhàn)顬槌Ｓ?. 1.1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他 外來微生物污染外，還有什么目的？ 2.2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。 如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。 （1 1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 （2 2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管 （3 3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手 答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被

7、微生物感染。 答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。 思考: 1)無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微 生物污染外，還有什么目的？ 2)消毒和滅菌有何不同？ 3)為什么消毒牛奶要用巴氏消毒法? 4)請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果 需要，請(qǐng)選擇合適的方法。 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿 玻棒、試管、燒瓶和吸管 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手 消毒滅菌 條件溫和強(qiáng)烈 作用 范圍 物體表面或內(nèi)部一部 分,不包括芽孢和孢子 物體內(nèi)外所有微生物, 包括芽孢和孢子 無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。 滅菌 滅菌 消毒 營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞 二、實(shí) 驗(yàn) 操 作 制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)

8、基 1.1.牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基配方 物質(zhì)牛肉膏蛋白胨NaClNaCl瓊脂水 重量5g5g10g10g5g5g20g20g 定溶至 1000mL1000mL 2.2.稱量 按比例稱取各種物質(zhì)。 注意：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨 都易吸潮，稱取時(shí)動(dòng)作要迅速，稱后及時(shí)蓋上瓶蓋。 3.3.溶化： 4.4.滅菌： 5.5.倒平板： 制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少量 水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃 棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪 拌使之溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶解后，加水 定溶至100mL100mL。 將配制好培養(yǎng)基放到錐

9、形瓶中（瓶口加棉塞，包 上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（3 35 5套，用幾層報(bào)紙包好） 一起放到高壓鍋內(nèi)滅菌。 待培養(yǎng)基冷卻到5050左右時(shí)倒平板。 倒平板操作的討論 1. 1.培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到5050時(shí)倒平板。 用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？ 2. 2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手 時(shí)即可開始倒平板。 通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培 養(yǎng)基。 3.3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ 4.4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在 皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生 物嗎？為什么？ 平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后 的培養(yǎng)基表面

10、的濕度也比較高，將平板倒置， 既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可 以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的 培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng) 微生物。 倒平板操作的討論 純化大腸桿菌 微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀 釋涂布平板法。 1.1.平板劃線法 通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃 線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng) 基的表面。 在數(shù)次劃線后可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖 而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體稱菌落。 1、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種 環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)？ 第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種

11、環(huán)上可能存在 的微生物污染培養(yǎng)物； 平板劃線法的討論 每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束 后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán) 上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線 次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以 便得到菌落。 劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種 環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。 2.2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再 進(jìn)行劃線？ 平板劃線法的討論 3.3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么 總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。 劃線后，線條末端細(xì)菌數(shù)比線條起始處 要少，每次從上一次劃線末

12、端開始，能使細(xì) 菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少， 最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。 2.2.稀釋涂布平板法 2.2.稀釋涂布平板法 將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不 同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的 表面進(jìn)行培養(yǎng)。 在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的 微生物將分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表 面形成單個(gè)的菌落。 稀釋涂布平板法操作過程分兩個(gè)步驟: : 系列稀釋操作 涂布平板操作 系列稀釋操作 101102103104 105106 (1)(1)將分別盛有9mL9mL水的試管滅菌并編號(hào)。 (2)(2)用移液管吸取1mL1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中， 輕壓橡皮頭，吹吸

13、三次使之充分混勻。 (3)(3)從10101 1倍稀釋的試管中吸取1mL1mL稀釋液，注入第三支 試管中，重復(fù)步驟2 2，直至到第六支試管。 涂布平板操作 (1)(1)將涂布器浸在盛有7070的酒精的燒杯中。 (2)(2)取少量菌液（不超0.1mL0.1mL），滴加到培養(yǎng)基表 面。 (3)(3)將沾有酒精的涂布器 在火焰上引燃，火熄 后冷卻8 810s10s。 (4)(4)用涂布器將菌液均勻 地涂布在培養(yǎng)基表面。 2.2.稀釋涂布平板法 涂布平板操作討論 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。 結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想 一想，第二步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？ 將接種后和未接種（作為對(duì)照組）的培養(yǎng)基 均放到3737的恒溫箱中，培養(yǎng)121224h24h后觀察并 記錄結(jié)果。 應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。如: :酒 精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸 任何其他物體、吸管要