第五講分子克隆載體

1、 目的基因目的基因 載體載體 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 DNA ligase 重組體重組體 載體自連載體自連 目的基因目的基因 自連自連 基因操作的基本步驟基因操作的基本步驟 載 體 單獨(dú)一個(gè)包括啟動(dòng)子、編碼區(qū)和終止子的基因， 或者組成基因的某個(gè)元件，一般是不易進(jìn)入受體細(xì) 胞的，即使采用理化方法進(jìn)入細(xì)胞后，也不容易在 受體細(xì)胞內(nèi)維持。 載體載體(vector): 能攜帶外源基因（或能攜帶外源基因（或 DNA片段）進(jìn)入細(xì)胞復(fù)制、整合或表達(dá)片段）進(jìn)入細(xì)胞復(fù)制、整合或表達(dá) 的工具。的工具。 作為克隆載體的DNA分子具備的條件： 1 具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，能攜帶外源基因

2、進(jìn)入宿主細(xì)胞； 2 能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，并實(shí)現(xiàn)外源基因的 增殖； 3 具有由單一限制酶識(shí)別位點(diǎn)組成的多克隆位點(diǎn) (MCS）； 4 克隆載體必須具有用于選擇克隆子的標(biāo)記基因； 5 克隆載體必須是安全的，不應(yīng)含有對(duì)受體細(xì)胞 有害的基因，并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入除受體細(xì)胞以 外的其他生物的細(xì)胞，尤其是人的細(xì)胞。 MCS 按功能分： 克隆載體 表達(dá)載體 質(zhì)粒克隆載體 (plasmid cloning vector) 質(zhì)粒(plasmid):是一種寓于宿主細(xì)胞中染色體外裸露 的dsDNA分子。 一個(gè)質(zhì)粒就是一個(gè)DNA分子。 存在于細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻和綠藻的細(xì)胞中，存在于細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻和綠藻的細(xì)胞中， 在細(xì)菌

3、細(xì)胞中最多。在細(xì)菌細(xì)胞中最多。 質(zhì)粒的存在形式： 一般以超螺旋共價(jià)閉環(huán)DNA分子(ccc-DNA)的 形式存在。 也可以開環(huán)DNA分子(oc-DNA)和線性DNA分子 (L-DNA)的形式存在。 質(zhì)粒DNA的大小 質(zhì)粒 宿主 大?。╧b） pPbs 藍(lán)藻 1.5 CoLE1 大腸桿菌 6.4 PV21 三葉草根瘤菌 700 多數(shù)在10kb左右 質(zhì)粒的基本性質(zhì)： 1 復(fù)制 按照質(zhì)粒控制拷貝數(shù)的程度，可以將質(zhì)粒分為: 1）嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stringent plasmid) 2 ）松散型質(zhì)粒(relaxed plasmid) 某種質(zhì)粒屬于嚴(yán)謹(jǐn)型或是松散型的，與宿主 有一定的關(guān)系。 例子：質(zhì)粒ColE1

4、-K30在大腸桿菌中屬于松 散型的，在奇異變形桿菌中是嚴(yán)謹(jǐn)型的。 一般來(lái)說(shuō)，希望構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體是松散 型的，所以在構(gòu)建的克隆載體中應(yīng)含有松散型的 復(fù)制起始位點(diǎn)和調(diào)控復(fù)制拷貝數(shù)的基因。 2 質(zhì)粒的不相容性(incompatibility): 兩種質(zhì)粒在同一宿主細(xì)胞中不能共存的現(xiàn)象。 親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒一般屬于不親和性質(zhì)粒。 野生型質(zhì)粒與其衍生的重組質(zhì)粒屬于不親和性質(zhì) 粒。 當(dāng)質(zhì)粒載體承載目的基因轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞時(shí)，考慮 受體細(xì)胞內(nèi)原有的質(zhì)粒與作為克隆載體的質(zhì)粒是否屬 于親和性質(zhì)粒。 作為受體細(xì)胞最好不含內(nèi)源質(zhì)粒。 3 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性 接合型質(zhì)粒 (conjugative plasmid)： 轉(zhuǎn)

5、移基因tra：指令宿主細(xì)胞產(chǎn)生菌毛、合成細(xì)胞 表面物質(zhì)，促使宿主細(xì)胞與受體細(xì)胞的結(jié)合，使質(zhì)粒 從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。 非接合型質(zhì)粒(non-conjugative plasmid)： 順式作用元件： bom位點(diǎn) 移動(dòng)基因：mob基因 (分子質(zhì)量小、拷貝數(shù)多、被動(dòng)遷移) 構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則 1 選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒 必備元件： A 復(fù)制起始點(diǎn) B 選擇標(biāo)記基因 C 克隆位點(diǎn) D 啟動(dòng)子 E 終止子 等等. 構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則 2 正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒載體克隆元件 一般用限制酶切割出發(fā)質(zhì)粒DNA分子，獲得含有 某種元件的DNA片段。 為了獲得含某種元件的DNA片段，選用的切割位 點(diǎn)既要保證

6、元件完整無(wú)缺，又要使DNA片段愈小愈 好，盡可能不含或少含不必要的序列，使構(gòu)建的載 體盡可能小。 構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則 組裝合適的選擇標(biāo)記基因 構(gòu)建供轉(zhuǎn)化大腸桿菌用的質(zhì)粒載體，可組裝藍(lán)/ 白顏色進(jìn)行選擇的(B-半乳糖苷酶基因)lacz基因。 但構(gòu)建供轉(zhuǎn)化藍(lán)藻用的質(zhì)粒載體不能用這個(gè)基因。 因?yàn)樗{(lán)藻含有大量的藻藍(lán)蛋白。 構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則 4 選用合適的啟動(dòng)子 如果用真核生物基因的啟動(dòng)子作為原核生物 表達(dá)克隆載體的啟動(dòng)子，其功效下降； 原核生物和病毒基因的啟動(dòng)子用作真核生物表 達(dá)克隆載體的啟動(dòng)子，可保留其原來(lái)的功效。 構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則 5 在能達(dá)到預(yù)期目的的情況下，構(gòu)建過(guò)程要力求簡(jiǎn) 單

7、。 構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略 1.構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體應(yīng)該是能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì) 胞中進(jìn)行有效的復(fù)制，并作為質(zhì)粒克隆載體， 希望在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。 2.構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體必須含有允許外源DNA片 段克隆的位點(diǎn)，并這樣的克隆位點(diǎn)應(yīng)盡可能多。 3.構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體必須含有供選擇克隆子的 標(biāo)記基因。 4.構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體DNA分子應(yīng)盡可能小。 5.根據(jù)特殊需要，使構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體中組裝 各種元件，構(gòu)建成不同用途的質(zhì)粒克隆載體。 質(zhì)粒的命名 用小寫字母用小寫字母p代表質(zhì)粒（代表質(zhì)粒（plasmid），在），在p字母后用字母后用 兩個(gè)或三個(gè)大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒?yàn)兩個(gè)或三個(gè)大寫字

8、母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒?yàn) 室名稱，再加上質(zhì)粒編號(hào)。室名稱，再加上質(zhì)粒編號(hào)。 如：如：pBR322：p表示一種質(zhì)粒，而表示一種質(zhì)粒，而“BR”則是分別取自則是分別取自 該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F. Bolivar和和R. L. Rodriguez， 322為編號(hào)。為編號(hào)。 選擇標(biāo)記基因：(用于鑒別目的DNA的存在，將成功 轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來(lái)） (1)(1)氨芐青霉素抗性基因氨芐青霉素抗性基因 (amp(ampr r ap apr r) ) (2) (2)卡那霉素抗性基因卡那霉素抗性基因 (kan(kanr r km kmr r) ) (3) (3)四環(huán)素抗性基因四

9、環(huán)素抗性基因 （tctcr r tet tetr r） (4)(4)氯霉素抗性基因氯霉素抗性基因 (cmp(cmpr r cm cmr r) ) (5) (5)新霉素抗性基因（新霉素抗性基因（neoneor r） rr pBR322pBR322 BamBamHIHI SalSalI I HinHindIIIdIII PstPstI I ScaScaI I AmpAmp r r oriori (4.36 kb)(4.36 kb) pBR322 如何篩選？ 利用Tetr基因內(nèi)部的BamHI位點(diǎn)來(lái)插入外源 DNA片段，可以通過(guò)插入失活進(jìn)行篩選。 BamHI G/GATTC 經(jīng)重組DNA分子轉(zhuǎn)化處理的

10、受體菌在不含標(biāo) 記藥物tc的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則含或不含重組 DNA分子的受體菌都能長(zhǎng)出菌落。 然后取菌落的一部分接種在含tc 的瓊脂培養(yǎng) 基上，不會(huì)長(zhǎng)出菌落的原菌落才是真正在tcr基因 區(qū)插入外源DNA片段的克隆子。 pUC 18 pU C1 9 含四個(gè)部分：含四個(gè)部分： （1）來(lái)自）來(lái)自pBR322的質(zhì)粒的質(zhì)粒 復(fù)制起點(diǎn)（復(fù)制起點(diǎn)（ori）；）； （2）ampr ; （3）大腸桿菌大腸桿菌半乳糖苷酶半乳糖苷酶 基因（基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其）的啟動(dòng)子及其 編碼編碼-肽鏈的肽鏈的DNA序列；序列； （4）多克隆位點(diǎn)）多克隆位點(diǎn)（MCS） lacZ Ori A m pr M C S Blu

11、e White amprampr Insert Insert No insert Lac Z Lac Z T2噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖 溶菌途徑：噬菌體感染宿主細(xì)胞后，其DNA不插入染色 體DNA，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的潛伏期，就大量增殖新的病 毒顆粒，使宿主細(xì)胞破裂，釋放的病毒顆粒又感染其 他細(xì)胞。（左圖示） 裂解循環(huán)裂解循環(huán)溶源態(tài)溶源態(tài) 1 它是一種溫和噬菌體。 2 能承載比較大的外源DNA片段。 野生型的頭部能包裝DNA分子大小75% 105%的DNA片段，約36.451kb。 3 在DNA分子上有許多限制性酶識(shí)別位點(diǎn)。 DNA DNA的限制性核酸內(nèi)切酶譜（的限制性核酸內(nèi)切酶譜（KbKb

12、） 1 去除非必須區(qū)，建立外源DNA片段的克隆或替換位點(diǎn)； 2 在 當(dāng)兩個(gè)突變株分別感染受體細(xì)胞時(shí)，兩者都可復(fù) 制 噬菌體的主要類型 1 插入型載體(insertion vector): 通過(guò)特定酶切位點(diǎn)允許外源DNA片段插入 的載體。外源DNA片段大小0 6 kb。 2 置換型載體(replacement vector): 允許外源DNA片段替換非必須DNA片段的 載體。外源DNA片段大小923kb。 插入型載體 主要用于cDNA克隆，允許插入的外源 DNA片段大小為06kb?；騝I內(nèi)的E.coRI 位點(diǎn)作為唯一位點(diǎn)，可以用于外源DNA的插 入。 主要用于cDNA文庫(kù)、基因組文庫(kù)和表達(dá) 融

13、合蛋白。允許插入的外源DNA片段的大小 為07.2kb。基因lac5編碼區(qū)終止密碼子之 前有一個(gè)E.coRI，可以用于外源DNA的插入。 置換型載體 在填充片段兩端有對(duì)稱分布的MCS，這兩 個(gè)載體的差別是MCS位點(diǎn)的排列位置相反。 M13噬菌體載體 基因工程中常對(duì)單鏈DNA測(cè)序、制備探針或?qū)嵤┒?點(diǎn)突變，應(yīng)用此載體就可以獲得單鏈DNA。 黏粒載體(cosmid vector) 基本特征： 1 是質(zhì)粒的衍生物，是帶有cos位點(diǎn)的質(zhì)粒。 2 其組成有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(ColE1)、抗性基因、 cos位點(diǎn)、MCS。 3 大小為57kb 4 能克隆的外源DNA片段最大達(dá)40kb。 黏粒載體的特點(diǎn)： （1

14、）具有噬菌體的特性（但因不含噬菌體的全 部必需基因，因此不能通過(guò)溶菌周期，無(wú)法形成 子代噬菌體顆粒）； （2）具有質(zhì)粒的特性（有質(zhì)粒復(fù)制子及抗菌素基 因）； （3）具有高容量的克隆能力（本身僅5-7kb, 克隆 極限可達(dá)40kb左右）； （4）具有與同源序列質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。 廣泛應(yīng)用于基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建。 部分柯斯質(zhì)粒的基本特性部分柯斯質(zhì)粒的基本特性 人工染色體載體 (artificial chromosome vector) 人工染色體載體： 利用染色體的復(fù)制功能來(lái)驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制 的載體。 1 酵母人工染色體載體(YAC) 2 細(xì)菌人工染色體載體(BAC) 利用釀酒酵母染色體

15、的復(fù)制元件構(gòu)建的載體。利用釀酒酵母染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體。 復(fù)制的必須元件：復(fù)制的必須元件： 1自主復(fù)制序列自主復(fù)制序列(autonomously replication sequences,ARS) 是一段特殊的序列，含有酵母菌中是一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的 信號(hào)。信號(hào)。 2 著絲粒著絲粒（centromere ,CEN） 有絲分裂過(guò)程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過(guò)程中能有絲分裂過(guò)程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過(guò)程中能 正確分配到子細(xì)胞中。正確分配到子細(xì)胞中。 3 端粒重復(fù)序列端粒重復(fù)序列（telomeric repeat , TEL） 用于保護(hù)線狀用于保護(hù)線狀DNA不被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降降，以形成穩(wěn)定的結(jié)不被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降降，以形成穩(wěn)定的結(jié) 構(gòu)。構(gòu)。 酵母人工染色體載體酵母人工染色體載體(YAC) YAC 載體的選擇標(biāo)記：載體的選擇標(biāo)記： 營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因 如色氨酸、亮氨酸合成缺陷型基因trp 1、 leu 2 和his3 尿嘧啶合成缺陷基因ura3 赭石突變抑制基因sup4 赭石突變抑制基因su