基于分子生物學(xué)的長江口外海域中微生物鑒定

1、基于分子生物學(xué)的長江口外海域中微生物鑒定摘要：作為國家衛(wèi)星海洋中心組成部分，本論文主要是初步查明秋季長江口外海域海洋懸浮物中的微生物種類。2008年秋季，我們在長江口外海域采集的海洋懸浮物樣品，利用對海洋微生物16SrRNA基因的直接擴(kuò)增，克隆和測序，從而鑒定微生物的種類。通過開展本研究，我們希望能初步查明長江口外海域海洋懸浮物中的微生物種類，為建立海洋微生物分子生物學(xué)檢測的技術(shù)體系打下一定的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞： 海洋微生物，種類鑒定，16SrRNA，海洋懸浮物 Identifications of Microorganism from the Outside waters of Changjian

2、g River Estuary by Molecular Biology TechniquesAbstract: Being as a major part of Satellite Ocean Center of China , this study is trying to primarily investigate the microorganism species in the Suspended solids from the Outside waters of Changjiang River Estuary。 In fall in 2008, we collected Suspe

3、nded solids samples from the biology investigation spot 24 of Satellite Ocean Center of China, then identified the marine microorganism species by using direct amplifications of 16S rRNA gene from marine microorganism, cloning and sequencing techniques. In this study, we hope to identify the marine

4、organism species in sediment from the China East Sea near to Shanghai, which could provide basis for the establishments of marine microorganism molecular detection technique system.Key words: Marine microorganism, species identification, 16SrRNA, marine sediments基于分子生物學(xué)的長江口外海域中微生物鑒定DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成

5、線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。 電源電壓 在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大,所加電壓不得超過5v/cm。 離子強(qiáng)度影響 電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。

6、在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動,在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時會引起凝膠熔化或DNA變性。 對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸,TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲于室溫.三、 瓊脂糖凝膠的制備 1、 取5TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5TBE稀釋緩沖液,待用。 2、 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或

7、電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。 3、 膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。 向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5g /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5g/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的

8、膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入0.5TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。 4.微生物種類的鑒定方法4.1微生物的鑒定技術(shù)分類分類鑒定方法包括表型鑒定法和分子遺傳學(xué)鑒定法兩大類,分成4個水平：細(xì)菌形態(tài)和生理生化水平、細(xì)胞組分水平、蛋白質(zhì)水平和核酸水平。4.1.1 表型鑒定法它是對前3個水平的鑒定,包括常規(guī)鑒定法、數(shù)值分類鑒定法和化學(xué)分類鑒定法。（1）細(xì)菌常規(guī)鑒定法：它是細(xì)菌形態(tài)和生理生化

9、水平及蛋白質(zhì)水平的鑒定,前者是最經(jīng)典、最常用的分類鑒定指標(biāo),也是現(xiàn)代化分類鑒定的依據(jù),后者包括免疫診斷技術(shù)、蛋白質(zhì)圖譜分析和氨基酸序列分析等。(2)細(xì)菌的數(shù)值分類和自動化鑒定：它應(yīng)用大量已知菌對相關(guān)生化試驗(yàn)反應(yīng)出現(xiàn)的頻率得出數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,優(yōu)化組合數(shù)10項(xiàng)生理生化指標(biāo)集合成套試劑,根據(jù)相似系數(shù)大小判斷細(xì)菌種屬間的親源性。自動化微生物鑒定系統(tǒng)即采用數(shù)值分類原理。微生物數(shù)值分類鑒定集數(shù)學(xué)、電子、信息及自動分析技術(shù)于一體,具有系統(tǒng)化、標(biāo)準(zhǔn)化、微量化和簡易化等優(yōu)點(diǎn),采用商品化的鑒定測試卡,將未知菌鑒定到屬、種、亞種或生物型,可對不同來源的臨床標(biāo)本進(jìn)行針對性鑒定,所得結(jié)果以數(shù)字方式表達(dá),與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)(手冊

10、或軟件)對比得出鑒定結(jié)果。(3)化學(xué)分類鑒定法：它主要通過細(xì)菌細(xì)胞壁化學(xué)成分即氨基酸和糖的分析進(jìn)行分類鑒定,屬的分類主要測定各種氨基酸組分,種的鑒定主要是對糖的分析.另外,還有全細(xì)胞水解液糖型分析、脂肪酸分析、磷酸類脂成分分析、枝菌酸分析、醌類分析和光合色素成分分析等,常使用紅外光譜、氣相色譜、高效液相色譜和質(zhì)譜等新技術(shù)。4.1.2.分子遺傳學(xué)分類鑒定法分子遺傳學(xué)鑒定法是核酸水平的鑒定,對細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析,包括G+Cmol%含量測定、核酸雜交、PCR 技術(shù)、16SrRNA和1623SrRNA序列分析、全基因組測序等,此類方法使細(xì)菌種屬定位和親源關(guān)系判別由表型特征深化為基因型鑒定。

11、隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子遺傳學(xué)分類鑒定方法逐漸成為微生物鑒定的主要手段，其鑒定結(jié)果更具有說服力。下面我們主要對16SrRNA序列分析進(jìn)行詳細(xì)介紹。4.216SrRNA序列分析4.2.116SrRNA 的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)16SrRNA為原核生物核糖體中一種核糖體RNA。目前,在細(xì)菌的系統(tǒng)分類學(xué)研究中最有用的和最常用的分子鐘是rRNA,其種類少,含量大(約占細(xì)菌RNA含量的80%),分子大小適中,存在于所有的生物中,特別是其進(jìn)化具有良好的時鐘性質(zhì),在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性,素有“細(xì)菌化石”之稱。核糖體是細(xì)菌唯一的細(xì)胞器,是蛋白質(zhì)合成的場所,它的RNA含有3種類型:23S、16S和5SrRNA

12、,它們分別含有的核苷酸約2900、1540和120個。60年代末,Woese開始采用寡核苷酸編目法對生物進(jìn)行分類,他通過比較各類生物細(xì)胞的核糖體RNA(rRNA)特征序列,認(rèn)為16SrRNA及其類似的rRNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)最為合適。其主要依據(jù)是:它們?yōu)榧?xì)胞所共有,其功能同源且最為古老既含有保守序列又含可變序列,分子大小適合操作:它的序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)(陳文新1998)。5SrRNA雖易分析,但由于核苷酸少,沒有足夠的遺傳信息用于分類研究。而23SrRNA含有的核苷酸數(shù)幾乎是16SrRNA的兩倍,分析較困難。16SrRNA的相對分子量適中,作為研究對象較理想。細(xì)胞核糖體RNA

13、可將遺傳信息得以表達(dá),轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì),因此可以想象這些分子具有作為種系發(fā)生的指示所必不可少的性質(zhì)。在相當(dāng)長的進(jìn)化過程中,rRNA分子的功能幾乎保持恒定,而且其分子排列順序有些部位變化非常緩慢,以致保留了古老祖先的一些序列。也就是說,從這種排列順序可以檢測出種系發(fā)生上的深遠(yuǎn)關(guān)系。rRNA結(jié)構(gòu)既具有保守性,又具有高變性。保守性能夠反映生物物種的親緣關(guān)系,為系統(tǒng)發(fā)育重建提供線索;高變性則能揭示出生物物種的特征核酸序列,是屬種鑒定的分子基礎(chǔ)?？勺儏^(qū)序列因不同細(xì)菌而異,恒定區(qū)序列基本保守,所以可以利用恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物將16SrRNA片段擴(kuò)增出來,利用可變區(qū)序列的差異來對不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類。rR

14、NA在細(xì)胞中含量大,一個典型的細(xì)菌中含有1000020000個核糖體,易于提取,可以獲得足夠的使用量供比較研究之用。選用的PCR擴(kuò)增引物及測序引物對應(yīng)的序列是16SrRNA中高度保守的序列,其中PCR引物827位的16(+)和15121492位的16(-)擴(kuò)增分離物的16SrRNA全基因,選擇位于827位的16(+)、683702N3R和15121492位的16(-)保守序列作為測序引物,可準(zhǔn)確測定16SrDNA的一部分序列。根據(jù)核糖體16SrRNA結(jié)構(gòu)變化規(guī)律,在所測定的區(qū)域中包括了V1、V2、V3和V44個高變區(qū),尤其是V2這一高變區(qū),由于進(jìn)化速度相對較快,其中所包含的信息,足夠用于物種屬

15、及屬以上分類單位的比較分析。因此,測定16SrDNA部分序列即可達(dá)到對分離物的分子鑒定的目的。4.2.2.16SrRNA序列分析的基本原理和技術(shù)步驟通過比較各類生物16SrRNA的基因序列,從序列差異計(jì)算它們之間的進(jìn)化距離,可以繪出生物進(jìn)化樹。因此,16SrRNA序列分析技術(shù)的基本原理就是從微生物樣本中的16SrRNA的基因片段,通過克隆、測序或酶切、探針雜交獲得16SrRNA序列信息,再與16SrRNA數(shù)據(jù)庫中的序列數(shù)據(jù)或其他數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,確定其在進(jìn)化樹中位置,從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類。其技術(shù)主要包括以下3個步驟。（1）基因組DNA的獲得首先從微生物樣品中直接提取總DNA,對易于培

16、養(yǎng)的微生物可通過培養(yǎng)富集后再進(jìn)行提取。另一種選擇是提取微生物細(xì)胞中的核糖體RNA。一個典型的細(xì)菌含有10000 20000個核糖體,而基因組DNA中rrn操縱子(即rDNA序列)的拷貝數(shù)相對較少(原核生物一般為110個左右),因此rRNA在細(xì)胞中的含量很高,易于獲得較多的模板,但是RNA易于降解,RNA的提取技術(shù)相對于DNA的提取較為復(fù)雜,一般研究多采用提取細(xì)胞總DNA,但也可根據(jù)情況選擇提取rRNA。由于rRNA在死亡的細(xì)胞中很快降解,提取rRNA通過反轉(zhuǎn)錄釣取16SrDNA序列的方法能夠區(qū)分被檢測的細(xì)胞是否為活體細(xì)胞(Ku rabachew,1998)。（2）16SrRNA基因片段的獲得過

17、去常常將提取的總DNA經(jīng)酶切后克隆到K噬菌體中建立DNA庫,進(jìn)一步通過16SrRNA通用探針進(jìn)行雜交,篩選含有16SrDNA序列的克隆(鳥槍法)。由于PCR技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展,現(xiàn)在一般采用16SrRNA引物PCR擴(kuò)增總DNA中的rRNA序列,或通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得CrDNA序列后再進(jìn)行分析。采用PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于不僅一次性從混合DNA或RNA樣品中擴(kuò)增出16SrRNA序列,而且方便了后面的克隆和測序。但也同樣會出現(xiàn)PCR所固有的缺點(diǎn),尤其是采用16SrRNA保守序列的通用引物對多種微生物混合樣品進(jìn)行擴(kuò)增,可能出現(xiàn)嵌合產(chǎn)物(Chimericproduct)和擴(kuò)增偏嗜性現(xiàn)象,影響結(jié)果的分析。（3）

18、通過16SrRNA基因片段分析對微生物進(jìn)行分類鑒定16SrRNA基因片段的分析方法主要包括以下3種:一是將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒載體上進(jìn)行測序,與16SrRNA數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較,確定其在進(jìn)化樹中的位置,從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類,該方法獲得的信息最全面,但在樣品成分復(fù)雜的情況下需要大量的測序工作。二是通過16SrRNA種屬特異性的探針與PCR產(chǎn)物雜交以獲得微生物組成信息。此外探針也可以直接與樣品進(jìn)行原位雜交檢測,通過原位雜交不僅可以測定微生物的形態(tài)特征和豐度,而且能夠分析它們的空間分布。該方法簡單快速,主要應(yīng)用于快速檢測,但可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。三是對PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性片段

19、長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphisms,RFLP)分析,通過觀察酶切電泳圖譜、數(shù)值分析,確定微生物基因的核糖體型,再同核糖體庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析樣品中微生物組成或不同微生物的種屬關(guān)系。4.3微生物多樣性與DNA指紋技術(shù)環(huán)境樣品中的微生物DNA提取物通常是不同微生物的DNA混合物,經(jīng)過PCR后,其產(chǎn)物是序列等長但不同源DNA片段的混合物?；旌衔镏行蛄械亩鄻有院筒煌蛄械呢S度在一定程度上反映了原始樣品中微生物種群的多樣性和不同物種的豐度。如果可以將這些序列等長但不同源DNA片段分離開,則可對樣品中微生物群落的組成進(jìn)行初步的分析。經(jīng)過多年的研

20、究,現(xiàn)在已經(jīng)有多種DNA指紋技術(shù),又稱為多態(tài)性分析,可以用于上述DNA片段的分離,它們包括如變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Elec-trophoresis,DGGE),溫度梯度凝膠電(Temperature Gradient Gel Electrophoresis,TGGE),單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Single Strain Conformation Polymorphism,SSCP),限制性片段長度多態(tài)性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP),末端限制性片段長度多態(tài)性分析(Terminal Res

21、triction Fragment Length Polymorphism,T2RFLP)等。DGGE的原理是:在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時需要不同的變性劑濃度,DNA雙鏈一旦解鏈,其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會急劇下降;因此,將PCR擴(kuò)增得到的等長的DNA片段加入到含有變性劑梯度的凝膠中進(jìn)行電泳,序列不同的DNA片段就會在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性,發(fā)生空間構(gòu)型的變化,導(dǎo)致電泳速度的急劇下降,以至停留在其相應(yīng)的不同變性劑梯度位置,染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分開的條帶。每個條帶代表一個特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的條帶,一般可視為具有相同的DNA序列。盡管D

22、GGE凝膠上的條帶可以在回收后用于測序,以便進(jìn)行更詳盡的微生物分類分析,但研究者一般僅利用DGGE等技術(shù)進(jìn)行微生物群落的初步分析,而用建立細(xì)菌16SrDNA文庫的方法進(jìn)行更為深入的分析。4.4.DNA測序及微生物分類鑒定對微生物16SrDNA進(jìn)行測序時最好進(jìn)行全長測序,尤其是所測序列將要用于探針設(shè)計(jì)和新物種確定時。另外,采用正反向引物對所測序列進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證可以確保序列的準(zhǔn)確性。但由于目前測序費(fèi)用還比較高昂,因此許多研究者也采用測16SrDNA部分序列的方法進(jìn)行微生物多樣性分析和平行樣品比較。研究表明,400600堿基的序列足以對環(huán)境中微生物的多樣性和種群分類進(jìn)行初步的估計(jì),但這樣短的序列通常不

23、能用于新物種鑒定和探針設(shè)計(jì)。有了微生物16SrDNA序列,不論是全長還是部分,都可以提交到GenBank采用BLAST程序與已知序列進(jìn)行相似性分析。Gen Bank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應(yīng)的微生物種類,但更為精確的微生物分類還取決于系統(tǒng)發(fā)育分析(phylogeneticanalysis)。系統(tǒng)發(fā)育分析,就是根據(jù)能反映微生物親緣關(guān)系的生物大分子(如16SrDNA、ATP酶基因)的序列同源性,計(jì)算不同物種之間的遺傳距離,然后采用聚類分析等方法,將微生物進(jìn)行分類,并將結(jié)果用系統(tǒng)發(fā)育樹(phylogenetictree)表示。計(jì)算菌屬、菌種之間的遺傳距

24、離可以采用不同方法,如Jukes-Cantor方法。在計(jì)算遺傳距離之后,構(gòu)建進(jìn)化樹時有許多種方法,其中以NeighborJoin法最為常用。在進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析時常用到的一些軟件包括MEGA2.1和ARB。5.材料與方法5.1材料5.1.1樣品的采集調(diào)查區(qū)域范圍為長江口沖淡水與外海水團(tuán)交匯的鋒面區(qū)域，有沿岸向東外海海域共設(shè)置兩條斷面，斷面1范圍為3000N， 12230-12400E間設(shè)置10個調(diào)查站位；斷面2范圍為3100N， 12210-12400E間設(shè)置12個調(diào)查站位；另外在3020 N， 12400E；3040 N，12400E設(shè)置2個站點(diǎn)，共計(jì)設(shè)置調(diào)查站位24個。樣品采集時間為200

25、8年秋季。樣品暫放于4冰箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室。帶回實(shí)驗(yàn)室后立即準(zhǔn)備后續(xù)的海洋懸浮物的微生物培養(yǎng)工作。具體采樣地點(diǎn)如圖1。29.53030.53131.5121121.5122122.5123123.5124124.51251 圖1 樣品采樣的地點(diǎn)說明：我們這次的調(diào)查范圍是在靠近長江口的杭州灣附近，是在1這個點(diǎn)位采集的樣品帶回來進(jìn)行研究的。5.1.2其它設(shè)備和儀器5.1.2.1主要試劑:(1)配制100ml的TE溶液:10Mm Tris-HCl；1mM EDTA(pH=8)；1ml Tris母液;0.2mlEDTA母液定溶到100ml,高壓滅菌4保存?zhèn)溆谩?2)抽提液I 酚:氯仿:異戊醇=25:24

26、:1(盛與棕色瓶)(3)抽提液II 氯仿:異戊醇=24:1(盛與棕色瓶)(4)70%乙醇(5)100%異丙醇（6）10%SDS溶液（7）蛋白酶K3（8）Nacl溶液（9）CTAB/ NaCl溶液（10）異丙醇5.1.2.2實(shí)驗(yàn)儀器海爾冰箱 BCD-196F青島海爾股份有限公司 ；FEB-78型雙向磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；DHG-9053A型 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器 YXQ-SG46-280S 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZF-6型三用紫外線分析儀 上海嘉鵬科技有限

27、公司；BIO-RAD電泳槽 PowerPac Basic 041BR 38252；SHZ-A水浴恒溫振蕩器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DK-8B型 電熱恒溫水槽 上海華連醫(yī)療器械有限公司；EPPENDORF PCR儀 5341 ；EPPENDORF 離心機(jī)3417R 5407 ；格蘭仕微波爐 P70D17TL-D5 佛山市順德區(qū)微爐有限公司；電子天平BS124S 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；5.2 提取DNA的步驟我們采集到的微生物沒有進(jìn)行培養(yǎng)，直接進(jìn)行微生物鑒定實(shí)驗(yàn)。本次實(shí)驗(yàn)是采用傳統(tǒng)的方法即酚、氯仿法。傳統(tǒng)法是目前最常用最可靠的DNA提取方法,所需費(fèi)用低,所提取的DNA可滿足臨床各

28、種檢測需要，但操作繁瑣,耗時長,DNA損失量大,產(chǎn)率低,且有污染和毒性作用，傳統(tǒng)法適用于初學(xué)者或經(jīng)費(fèi)有限的實(shí)驗(yàn)室。具體步驟如下：（1） 把溶液放進(jìn)離心機(jī)中離心，然后移去上清液，得到沉淀物質(zhì)。（2）加入567ulTE溶液重懸（3）加入10%SDS 30l和20mg/ml蛋白酶K3l,于37溫育1h（4）加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,412000g/min離心5min。（5）將上清液轉(zhuǎn)入另1個離心管中加等體積的酚/氯仿/異戊醇,混勻,412000g/min離心5min（6）提取上清置于另一管中,加入0.6體積異丙醇,輕柔混合,412000g/min離心5min（7）棄上清,加入70%乙醇洗滌1m

29、in,離心,棄上清（8）將沉淀的DNA溶于100l的無菌去離子水中,-20保存?zhèn)溆眉?xì)菌離心（12000g/min,4min）,10%的SDS去破壁,蛋白酶K3溶解蛋白,CTAB/NaCl溶液去多糖,氯仿/異戊醇和酚/氯仿/異戊醇抽提,異丙醇沉淀DNA,最后以70 %乙醇溶解。5.3用電泳檢測DNAA洗凈玻璃板或塑料盤并干燥備用，調(diào)節(jié)電泳槽底腳螺絲使其水平,在塑料盤兩側(cè)放置擋板。B根據(jù)擴(kuò)增片段大小所需濃度,準(zhǔn)確稱量瓊脂糖于三角瓶中,加入50ml 1TbE電泳緩沖液。緩沖液不要超過三角瓶的50%。C在三角瓶上蓋上錫箔紙,用微波爐或在沸水上加熱至瓊脂糖溶解,然后使溶液冷卻至60,此時膠濃度為1%,再

30、加入2.5ul溴化乙錠(EB)溶液(用蒸餾水配制),充分混勻(注意EB有毒,強(qiáng)誘變劑,有致癌作用,操作時務(wù)必戴上手套,小心操作)。D用加樣槍吸取少量溶液封住檔板邊緣。在距離底板0.51.0mm處放置梳子。E將剩余的溶液倒入塑料盤中。凝膠厚度為3-5mm,用槍頭將溶液中的氣泡排掉。F凝膠完全凝固(約需30-40min)后,小心拔去梳子,將塑料盤及凝膠一起放入電泳槽中,加入恰好沒過膠面1mm的1TBE,準(zhǔn)備點(diǎn)樣。G.DNA樣品和6DNA Loading buffer(含有溴酚藍(lán)和甘油等物質(zhì))以5：1比值混合后，用微量槍慢慢將混合物加至樣品槽中，最邊上的孔加Marber2-3ul對照。I.蓋上電泳槽

31、并通電，使DNA向陽極移動，采用電壓為80100V。J.溴酚藍(lán)在凝膠中移出適當(dāng)距離后切斷電流，取出玻璃板，在紫外燈下觀查凝膠。K.跑完電泳后在紫外光下觀察結(jié)果：溴化乙錠是熒光染料，該物質(zhì)含有一個特殊的堿基，會導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，由于結(jié)合了染色劑的DNA和其它物質(zhì)所發(fā)出的熒光屬于不同的發(fā)光段，因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。5.3 PCR擴(kuò)增檢測（1）PCR引物:根據(jù)細(xì)菌特有的高度保守序列16srDNA，設(shè)計(jì)合成了一對引物：27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-31492r 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3(2)PCR反應(yīng)體系（

32、50ul）：PCR反應(yīng)的基本成分包括:模板DNA(待擴(kuò)增DNA)、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩沖液其中模板DNA（提出的細(xì)菌DNA）8ul；其他的基本成分如下表1所示：表1.部分反應(yīng)體系反應(yīng)成分儲備液濃度終濃度工作液配制Reaction ComponentsStock Solution Concentration Final ConcentrationWorking Solution PreparationddH2O-29ulPCR Buffer10*PCR Buffer1*PCR Buffer5ulDNTPs25mmol/l2mmol/l4ul引物11.0umo

33、l/l0.3umol/l1.5ul引物21.0umol/l0.3umol/l1.5ulTaq酶2.5U/ul0.25U/ul0.5ul終體積-50ul說明：10Buffer是提取緩沖液；dNTP是四種脫氧核苷三磷酸；Taq酶是DNA聚合酶（3）PCR擴(kuò)增條件:PCR擴(kuò)增是通過變性(denaturation)、退火(an-nealing)和延伸(extension)三個步驟反復(fù)循環(huán)來實(shí)現(xiàn)的。因此,確定正確的PCR反應(yīng)程序參數(shù)是PCR成功的保證。熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：預(yù)變性95oC5min；95oC變性1min；53oC退火1min；72oC延伸1.5min，進(jìn)行了30個循環(huán)；72oC延伸10min；

34、4oC保存。具體反應(yīng)程序如表2.表2.反應(yīng)程序Step1預(yù)變性：955minStep2變性：951minStep3退火：531minStep4延伸：721.5minStep52-4步驟，30個循環(huán)Step6延伸：7210minStep7保溫：41-12hStep8結(jié)束PCR技術(shù)十分靈敏，少數(shù)幾個模板分子就可以檢查出來。它的括增效率非常高，通?？梢岳ㄔ?06倍。其擴(kuò)增產(chǎn)量可以按下列公式計(jì)算：y =(1+x)ny=產(chǎn)量 x=擴(kuò)增效率 n=循環(huán)次數(shù)PCR反應(yīng)在EPPENDORF PCR儀上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)脫鹽純化后,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，點(diǎn)樣量為3l。5.4割膠純化PCR產(chǎn)物A.從瓊脂糖凝

35、膠中切下DNA條帶（盡量切除多余的部分）,然后把條帶放入離心管中，稱取重量。B.向膠塊中加入4倍體積溶膠液PN，然后在50的水浴中放置10min。期間不斷上下翻轉(zhuǎn)離心管，使膠塊完全溶解。溶解完全后放置在常溫下2-3min。C.把上述溶液放入到吸附柱中，3，000rpm離心30s，重復(fù)一次，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。D.向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，然后重復(fù)一次步驟3的操作。E.向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，13，000rpm離心30s，倒掉廢液。將離心吸附柱放回收集管中，13，000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50溫箱數(shù)分鐘，徹底晾干，

36、以防止殘留的漂洗液影響下一步實(shí)驗(yàn)。（影響回收率和DNA質(zhì)量）F.將吸附柱放入一干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加25mlddH20，室溫放置2min。13，000rpm離心1min收集DNA溶液。G.可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)6。即把其室溫放置2min。13，000rpm離心1min，收集DNA溶液。H.純化后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。5.5 PCR產(chǎn)物的電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的方法。盡管瓊脂糖凝膠的分辨能力較低,但分離范圍廣。具體操作步驟如下:A洗凈玻璃板或塑料盤并干燥備用。調(diào)節(jié)電泳槽底腳螺絲使其水平,在塑料盤兩側(cè)放置擋板。B根據(jù)擴(kuò)

37、增片段大小所需濃度,準(zhǔn)確稱量瓊脂糖于三角瓶中,加入50ml1TAE電泳緩沖液。緩沖液不要超過三角瓶的50%。C在三角瓶上蓋上錫箔紙,用微波爐或在沸水上加熱至瓊脂糖溶解,然后使溶液冷卻至60,此時膠濃度為1%,再加入2.5ul溴化乙錠(EB)溶液(用蒸餾水配制),充分混勻D用加樣槍吸取少量溶液封住檔板邊緣。在距離底板0.51.0mm處放置梳子。E將剩余的溶液倒入塑料盤中。凝膠厚度為3-5mm,用槍頭將溶液中的氣泡排掉。F凝膠完全凝固(約需30-40min)后,小心拔去梳子,將塑料盤及凝膠一起放入電泳槽中,加入恰好沒過膠面1mm的1TAE,準(zhǔn)備點(diǎn)樣。G.DNA樣品和6DNA Loading buf

38、fer(含有溴酚藍(lán)和甘油等物質(zhì))以5：1比值混合后，用微量槍慢慢將混合物加至樣品槽中，最邊上的孔加Marber2-3ul對照。H蓋上電泳槽并通電,電壓為80100V,使DNA向陽極移動。I待溴酚藍(lán)和二甲苯青在凝膠中遷移出適當(dāng)?shù)木嚯x,切斷電源,小心取出凝膠在紫外燈或紫外透射儀下檢查凝膠并攝影。5.616SrDNA的測序和分析將以上PCR擴(kuò)增純化產(chǎn)物直接送至測序公司,用ABI3730全自動測序儀進(jìn)行序列測定。然后把獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已存在的細(xì)菌16SrDNA序列進(jìn)行相似性比較。6.結(jié)果與討論6.1結(jié)果6.1.1.DNA的提取和PCR擴(kuò)增將從樣品中提取的總DNA進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電

39、泳,在20kb左右出現(xiàn)條帶(如圖2A),表明已獲得較為完整的微生物的全部基因組的DNA。提取出的基因組DNA經(jīng)過用16sRNA引物PCR后,均獲得了特異擴(kuò)增片段,擴(kuò)增片斷約1,400bp左右,此片斷為16SrDNA基因的全序列擴(kuò)增(如圖2B)。圖1顯示了一個樣品的總DNA和16SrDNA基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。 AB圖2(A和B).細(xì)菌基因組DNA和16SrDNA的PCR產(chǎn)物6.1.2 16SrDNA序列測定與種類鑒定對純化后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行測序，我們獲得如下序列結(jié)果。對一種單菌落部分測序結(jié)果（713bp）GGGGACGTTATCGGATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTT

40、TGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGTCTTGAACTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAG

41、TACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTATTTACCAGCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGAT

42、GACGTCAAGAGGTTATGGCAGTTATTAGTGGGCTACACACGTGCGGTAAAGATCTGGTGTTGGGCTGC將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已存在的細(xì)菌16SrRNA序列進(jìn)行相似性比較，我們發(fā)現(xiàn)：該序列的覆蓋度占整個的95%，與一種假單胞菌（Pseudomonas）菌株的16SrRNA的核苷酸序列（403bp）相似性達(dá)到97%。該菌的基因序列號為EU.1(Pseudomonas sp.W15Feb26 16S ribosomal RNA gene Pseudomonas sp.W15Feb26 16S ribosomal RNA gene,EU.1)根據(jù)上面的步驟我

43、們把剩下的微生物鑒定出來的結(jié)果列成表格的形式如表3.表3.微生物鑒定結(jié)果匯總英文名稱屬別query coveragemax identCellvibrio sp.纖維弧菌屬60%96%Pseudomonas sp.假單胞菌屬92%91%Pseudomonas sp.假單胞菌屬92%95%Rheinheimera sp.棍著色菌屬61%92%Tepidiphilus sp.硫桿狀菌屬24%77%Pseudomonas sp.假單胞菌屬91%98%Bacillus pumilus短小芽孢桿菌43%99%Pseudomonas sp.假單胞菌屬45%85%Pseudomonas sp.假單胞菌屬98

44、%99%Pseudomonas sp.假單胞菌屬98%94%Pseudomonas sp.假單胞菌屬97%97%Pseudomonas sp.假單胞菌屬98%96%Shewanella baltica波羅的海希瓦氏菌98%96%Shewanella sp.希瓦氏菌92%93%Serratia marcescens 粘質(zhì)沙雷氏菌94%98%Shewanella sp.希瓦氏菌88%91%Pectobacterium果膠桿菌屬98%93%Shewanella baltica 波羅的海希瓦氏菌98%98%Aeromonas sp.氣單胞菌81%90%Serratia proteamaculans變形

45、斑沙雷氏菌99%96%Serratia marcescens粘質(zhì)沙雷氏菌菌株56%96%Shewanella sp.希瓦氏菌97%90%Aeromonas sp.氣單胞菌75%87%Shewanella baltica波羅的海希瓦氏菌99%99%Aeromonas sp.氣單胞菌97%89%Shewanella sp.希瓦氏菌99%99%Shewanella sp.希瓦氏菌86%94%Pseudomonas假單胞菌91%98%Shewanella sp.希瓦氏菌94%98%Aeromona daceae 氣單胞菌科細(xì)菌96%98%Aeromonas sp. 氣單胞菌98%98%Pseudomo

46、nas sp.假單胞菌82%96%Pseudomonas sp.假單胞菌93%99%Aeromonas salmonicida 殺鮭氣單胞菌91%98%Aeromonadaceae bacterium氣單胞菌科細(xì)菌22%90%Shewanella sp.希瓦氏菌98%98%Shewanella sp.希瓦氏菌86%81%Pseudomonas fluorescens熒光假單胞菌株91%95%Pseudomonas sp.假單胞菌96%96%Pseudomonas sp.假單胞菌屬83%90%Pseudomonas fluorescens 熒光假單胞菌98%97%Rahnella aquatil

47、is 水生拉恩氏菌95%99%Rahnella aquatilis水生拉恩氏菌97%97%屬別的形態(tài)及生理生化特征的分析：從列表中測算出微生物的平均覆蓋度是85%，平均最大相似度是94%，這些數(shù)據(jù)表明鑒定微生物結(jié)果是比較可靠的。6.2討論6.2.1對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析(1)本實(shí)驗(yàn)樣品是3000-3100E,12210-12400E組成的長江口杭州灣附近海域內(nèi)采集的。采集地點(diǎn)位于潮間帶以外。由于采集的地點(diǎn)遠(yuǎn)離陸地,從而確保分離到的微生物是真正的海洋微生物，從而排除陸地微生物的污染。(2)從鑒定出的微生物的生理生化分析的結(jié)果來看，這些細(xì)菌大致有以下特性：運(yùn)動性、異養(yǎng)或化能異養(yǎng)、寡營養(yǎng)性、嗜鹽性，嗜低溫

48、性，抵抗力強(qiáng)。從呼吸作用方式來看，有好氧型、厭氧型和兼性厭氧型的細(xì)菌，它們對氧的要求并不高。絕大多數(shù)海洋細(xì)菌都具有運(yùn)動能力，這和微生物所生成的環(huán)境有關(guān)系，只有運(yùn)動才能獲得足夠的營養(yǎng)。異養(yǎng)細(xì)菌和浮游植物有很大的關(guān)系，所以初級生產(chǎn)是影響長江口鄰近海域浮游異養(yǎng)細(xì)菌分布的重要因素。由于海水中營養(yǎng)物質(zhì)比較稀薄，大多數(shù)細(xì)菌都是寡營養(yǎng)細(xì)菌。海水中有機(jī)碳的平均水平相當(dāng)?shù)?，寡營養(yǎng)細(xì)菌能夠利用低濃度的有機(jī)碳，因此，寡營養(yǎng)細(xì)菌是海洋浮游生物的主要成員，在生物地球化學(xué)循環(huán)中起重要作用。對寡營養(yǎng)細(xì)菌生態(tài)學(xué)的研究，能為有效控制海洋生物圈的物質(zhì)循環(huán)和能量流動提供可靠依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)氯氣、甲烷和一氧化碳這些氣體在任何環(huán)境中都微

49、量存在，極有可能被寡營養(yǎng)細(xì)菌用來作為能量儲備，以對付其生存環(huán)境可能出現(xiàn)的營養(yǎng)物質(zhì)缺乏。嗜鹽性，嗜低溫性都是由于海洋獨(dú)特的環(huán)境所決定的。在這個獨(dú)特的環(huán)境中，生物必須具有強(qiáng)的抵抗力，例如芽孢桿菌產(chǎn)生孢子來度過不良環(huán)境。6.2.2用16SrDNA微生物鑒定的方法的優(yōu)點(diǎn)傳統(tǒng)的微生物分類是依賴純培養(yǎng)分離方法，通過表型特征和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，對其生理生化反應(yīng)和細(xì)胞組成成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析來實(shí)現(xiàn)分類鑒定的。許多研究結(jié)果表明，這種方法有很大的缺陷。（1）在自然環(huán)境中有許多的菌種用傳統(tǒng)的方法無法培養(yǎng)出來，同時純培養(yǎng)分離忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，丟失了大量的微生物資源。（2）在培養(yǎng)基上不可避免的會造成菌

50、株的富集或衰減，人為改變了原始菌群的微生態(tài)構(gòu)成，對研究結(jié)果造成了較大的偏差。（3）根據(jù)形態(tài)特征、理化特征、菌體某些化學(xué)成分對菌株進(jìn)行分類鑒定菌株的確很有用，至今這些特性的應(yīng)用十分有限。根據(jù)這些缺點(diǎn)，在加上于海洋獨(dú)特的環(huán)境, 包括高鹽、高壓、低營養(yǎng)、低溫等, 造就了海洋微生物有別于陸地微生物的諸多特異性而導(dǎo)致對它們種類區(qū)分的困難, 有礙于海洋微生物研究和開發(fā)的深入, 因此迫切需要建立一種簡單、方便、易于操作的分類鑒定方法對海洋微生物進(jìn)行分析, 使人們在一定程度上更科學(xué)、更精確、更快速地找到海洋微生物的分類地位, 為海洋微生物資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。隨著科學(xué)的發(fā)展，以16SrDNA為基礎(chǔ)的現(xiàn)代分子

51、生物學(xué)技術(shù)體高了解析的靈敏度，在基因水平上擴(kuò)大了物種多樣性的視野，可以實(shí)現(xiàn)快速，微量，準(zhǔn)確簡便的對微生物進(jìn)行分類鑒定。操作簡便還可有效地避免實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)丟失;通過從基因水平探索微生物群落的豐度、均勻度、分析菌種的變異情況等,可將微生物多樣性的研究提高到遺傳多樣性水平上,為全面認(rèn)識微生物多樣性在生態(tài)系統(tǒng)中的原始構(gòu)成、篩選出未知菌種提供了行之有效的技術(shù)手段。雖然可以用DNAG+CmoL含量測定和DNADNA雜交、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性圖譜(RAPD)分析和限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP分析)、DNA探針分析等其他的分子生物學(xué)技術(shù)來進(jìn)行鑒定微生物，但16SrRNA測序技術(shù)表現(xiàn)的更高效，更準(zhǔn)確、更簡便，

52、有很強(qiáng)的特異性。隨著基因組學(xué)的迅猛發(fā)展, 細(xì)菌16SrRNA間隔區(qū)序列數(shù)據(jù)庫不斷擴(kuò)大,運(yùn)用16SrRNA序列分析技術(shù)對微生物進(jìn)行分類鑒定,確定微生物在進(jìn)化中的位置,已成為微生物分類學(xué)中最重要的方法。6.2.3存在的問題（1）在實(shí)驗(yàn)過程中，我們很難提取到DNA，用了很多方法才得以成功。失敗的原因有很多，比如我們采集到的物品沒有及時操作，而且我們生活的環(huán)境和海洋微生物生活的環(huán)境不相同，可能導(dǎo)致海洋微生物不適合環(huán)境而死亡，因?yàn)樗劳龅奈⑸镏械腞NA很容易降解，這就使得微生物在采集到實(shí)驗(yàn)這一段很長的時間內(nèi)我們很少采集到總的DNA；還有就是沒有很好的控制細(xì)菌污染問題。環(huán)境中的細(xì)菌無處不在，很有可能是樣品

53、中進(jìn)入了雜菌，使得海洋中的微生物不能正常生長，所以在試驗(yàn)中如何控制細(xì)菌污染是一個關(guān)鍵問題。通過各個環(huán)節(jié)的嚴(yán)格無菌操作,選擇恰當(dāng)?shù)臄U(kuò)增循環(huán)次數(shù),DNA提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析的隔離措施,以及使用一次性吸頭等,可提高鑒定的正確性和可靠性。（2）以16SrDNA/RNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)正日益成為微生物種群分析的重要手段,但在應(yīng)用這些技術(shù)時必須清楚地認(rèn)識到它們存在的局限性和偏差,例如核酸提取的效率和PCR中的問題等。下面以PCR中出現(xiàn)的問題來說明。模板DNA是PCR體系中最重要的基本成分，它可能受到蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、能結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)及多糖類物質(zhì)的污染，所以要選用純化的DNA做模板，增加增加模板分子的濃度,