硫磺菌菌絲液體發(fā)酵條件的研究畢業(yè)論文

1、畢 業(yè) 設(shè) 計(jì)（ 論 文 ）題 目：硫磺菌菌絲液體發(fā)酵條件的研究英文題目：study on the liquid fermentation condition of laetiporus sulphureus mycelium學(xué)生姓名： 專 業(yè)：生物技術(shù)班 級(jí)： 指導(dǎo)老師： 硫磺菌菌絲液體發(fā)酵條件的研究 摘 要 實(shí)驗(yàn)以硫磺菌為材料，在其適宜的外部培養(yǎng)條件（培養(yǎng)溫度為25、裝液量75ml/250ml、搖瓶轉(zhuǎn)速為150r/min培養(yǎng)120h）下，通過(guò)不同濃度的黃豆?jié){、不同濃度的葡萄糖、不同種類的氮源（包括黃豆?jié){、尿素、牛肉膏、蛋白胨、(nh4)2so4）、不同種類的碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖）

2、、酸堿度幾個(gè)單因素的控制以及各因素的正交實(shí)驗(yàn)，采用液體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)硫磺菌菌絲體，并稱量每次培養(yǎng)的菌絲體濕重重量，從而確定硫磺菌的最適生長(zhǎng)條件。結(jié)果表明：以濃度為17.5g/l的黃豆?jié){為氮源，濃度為20g/l的葡萄糖為碳源，初始ph值為5.5，為菌絲生長(zhǎng)條件最優(yōu)。關(guān)鍵詞：硫磺菌； 液體發(fā)酵培養(yǎng)； 菌絲生長(zhǎng)條件； 正交實(shí)驗(yàn)study on the liquid fermentation condition oflaetiporus sulphureus mycelium abstractthe experiment take the laetiporus sulphureus as the mat

3、erial，under the best exterior raise condition (raise temperature of 25 ,and the volume of the liquid installs is 75ml/250ml,and the speed of rocker is 150r/min ,then we raise for 120 hours). through the control of different density yellow soybean milk, and different density glucose, and different ty

4、pe nitrogen (including yellow soybean milk, urea, beef extract, protein peptone)，and different type carbon (including glucose, sucrose, starch, lactose),and the sour alkalinity. last we do the orthogonal experiment of the various factors. then we through the liquid fermentation technology to raise l

5、aetiporus sulphureus mycelium, and we weight each time raises mycelium wet weight, thus determinate the most suitable growth condition of laetiporus sulphureus. the result indicated that, take the density as the 17.5g/l yellow soybean milk for nitrogen, the density is the 20g/l glucose for carbon, t

6、he initial ph is 5.5, produces mycelium the condition to be most superior.key worlds: laetiporus sulphureus; liquid fermentation culture; growing conditions of mycelium; orthogonal experiment目 錄1. 前 言11.1 食用菌概述11.2 硫磺菌概述11.3 現(xiàn)階段研究現(xiàn)狀21.2.1 猴頭菌液體發(fā)酵條件的研究21.2.2 人工栽培出野生硫磺菌21.2.3 野生朱紅硫磺菌馴化栽培研究21.2.4 對(duì)硫磺菌的

7、發(fā)酵液抗菌活性進(jìn)行了初步研究21.2.5硫磺菌原變種液體培養(yǎng)代謝物生物活性分析31.3 實(shí)驗(yàn)研究的意義41.4 實(shí)驗(yàn)研究的目的41.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方案52. 材料和方法62.1 材料62.1.1 主要儀器設(shè)備62.1.2 菌種62.1.3 主要試劑62.1.4 培養(yǎng)基62.2 實(shí)驗(yàn)方法62.2.1 液體菌種的制作62.2.2 不同濃度的黃豆?jié){對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響62.2.3 不同濃度的葡萄糖對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響62.2.4 不同種類的氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響62.2.5 不同種類的碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響72.2.6 不同ph對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響72.2.7 正交實(shí)驗(yàn)73 結(jié)果及分析83.1 不同濃度的黃豆?jié){對(duì)菌

8、絲生長(zhǎng)的影響83.2 不同濃度的葡萄糖對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響93.3 不同種類的氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響103.4 不同種類的碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響103.5 不同的ph對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響113.6 不同濃度的葡萄糖、黃豆?jié){和ph值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響11小結(jié)13致謝15參考文獻(xiàn)161. 前 言1.1 食用菌概述 食用菌是指可供人類使用的大型真菌。通常也稱為“菇”、“菌”、“蘑”、“耳”。約90的食用菌屬于擔(dān)子綱，少數(shù)屬于子囊菌綱。全世界有10000多種肉質(zhì)菌。目前中國(guó)已報(bào)道的食用菌近1000種，其中大約有50多種是極新鮮美的，有50多種是美味的，人工栽培的有70多種，其中形成大規(guī)模商業(yè)性栽培的20種左右。食用

9、菌是一種營(yíng)養(yǎng)豐富并兼有食療價(jià)值的食品，食用部分大都為具有產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的子實(shí)體。子實(shí)體的蛋白質(zhì)含量約為鮮重的34或干重的2040，介于肉類和蔬菜之間，所含的氨基酸種類豐富，還含有較多的核酸和各種維生素，包括維生素b1（硫胺素）、維生素b2（核黃素）、維生素pp（煙酸）、維生素c（抗壞血酸）和維生素d原等。礦物質(zhì)的含量亦較豐富，尤其含磷質(zhì)較多，有利于人體各種生理機(jī)能的調(diào)節(jié)。此外，很多種類如銀耳、木耳、猴頭菌以及菌核側(cè)耳還兼有滋補(bǔ)作用和醫(yī)療用途。 數(shù)千年前，人們就已經(jīng)采食蘑菇。中國(guó)是絕大多數(shù)食用菌栽培的發(fā)祥地。工業(yè)革命后，隨著微生物學(xué)、真菌學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，德國(guó)、法國(guó)、英國(guó)、美國(guó)

10、、日本等國(guó)家將食用菌的栽培和加工推進(jìn)到科學(xué)化的階段，成為重要的產(chǎn)業(yè)。1.2 硫磺菌概述硫磺菌（laetiporus sulphureus bond.et singer）又稱硫磺多孔菌、硫色多孔菌1，為非褶菌目、多孔菌科、硫磺菌屬，是一種重要的藥用真菌。它的形態(tài)特征是初期瘤狀，似腦髓狀，菌蓋覆瓦狀排列，肉質(zhì)多汁，干后輕而脆。菌蓋寬8-30cm，厚1-2cm，表面硫磺色至鮮橙色，有細(xì)絨或無(wú)，有皺紋，無(wú)環(huán)帶，邊緣薄而銳，波浪狀至瓣裂。菌肉白色或淺黃色，管孔為硫磺色，干后褪色，孔口多角形，平均每毫米3-4個(gè)。孢子卵形，近球形，光滑、無(wú)色、（4.5-7）（4-5） m，其中最重要的特征是子實(shí)體瓦狀排列，

11、硫磺色。它主要生長(zhǎng)在柳、云杉等活立木樹干、枯立木上，分布于國(guó)內(nèi)18個(gè)省市。硫磺菌幼時(shí)可食用，味道較好。藥用，性溫，味甘，能調(diào)節(jié)肌體，增進(jìn)健康、抵抗疾病，是治療乳腺癌，前列腺癌的輔助藥物，此菌產(chǎn)生齒孔菌酸，可用于合成甾體藥物。另外還產(chǎn)生甜菜堿、胡蘆巴堿和等生物堿。引起木材褐色塊狀腐朽。常生長(zhǎng)在香菇段木上，被視為“雜菌”。 前人曾報(bào)道硫磺菌發(fā)酵培養(yǎng)液可產(chǎn)生有機(jī)酸2,可廣泛用于食品、印染等工業(yè)部門?，F(xiàn)在研究最多的是朱紅硫磺菌3。該菌主要分布于我國(guó)南方海拔1 200m以上山區(qū)的針闊林中(以針葉林為多)，屬野生珍稀食、藥菌。子實(shí)體幼嫩至成熟時(shí)味道鮮美，似鮭魚，老后呈干酪狀，不宜食用，但可入藥，具有調(diào)節(jié)機(jī)

12、能，增進(jìn)健康，提高人體抵抗力的作用。在野生菌生長(zhǎng)區(qū)，當(dāng)?shù)乩习傩諏⒃摼母芍破芳宸?，用于治療感冒和其它疾病，效果非常好。?jù)分析，該菌含有豐富的齒孔菌酸，這種物質(zhì)是合成甾體類藥物(類固醇化合物)的主要原料，是合成口服避孕藥和治療雄性器官功能衰退及某些婦科疾病藥物的重要原料。1.3 現(xiàn)階段研究現(xiàn)狀1.3.1 猴頭菌液體發(fā)酵條件的研究本試驗(yàn)結(jié)果表明：猴頭菌對(duì)碳源的利用較廣泛，對(duì)單糖、寡聚糖、多糖都能利用尤其是小麥粉、糊精、麥芽糖等都是猴頭菌的較好碳源。有機(jī)氮比無(wú)機(jī)氮更利于猴頭菌菌絲體的生長(zhǎng)。使用酵母粉、蛋白胨等有機(jī)氮源時(shí)，猴頭菌絲生長(zhǎng)較快，本試驗(yàn)選用價(jià)格低、來(lái)源廣的小麥粉和酵母粉作為碳、氮源。并摸索到

13、適用的發(fā)酵條件所獲得的生物量最高達(dá)3左右。顯著高于最近有關(guān)資料的猴頭菌菌絲體得率。當(dāng)然要進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)還需要進(jìn)一步提高生物量。種齡和接種量也是關(guān)鍵之一，一般種子選用處在旺盛的指數(shù)生長(zhǎng)期的菌絲體種子。猴頭菌為4d。接種量也是很重要的因素，種量大，可縮短發(fā)酵延遲期，減少污染機(jī)率；但接種過(guò)多不僅種子培養(yǎng)費(fèi)時(shí)。種子中的代射產(chǎn)物的帶入對(duì)液體發(fā)酵也會(huì)造成很大影響所以猴頭菌液體發(fā)酵一般以10 15的接種量為宜。1.2.2 人工栽培出野生硫磺菌河北省平泉縣食用菌總公司食用菌研究中心的科技人員,經(jīng)過(guò)1年多的研究, 通過(guò)上千次的試驗(yàn),終于將具有藥食兩用價(jià)值的珍稀野生菌-硫磺菌， 人工栽培成功。經(jīng)中科院微生物所檢測(cè)

14、, 目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)人工栽培的硫磺菌,這項(xiàng)科研成果,填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)空白。1.2.3 野生朱紅硫磺菌馴化栽培研究研究表明朱紅硫磺菌的菌絲體適宜生長(zhǎng)的溫度范圍為15-32，最適溫度范圍為22-28。朱紅硫磺菌子實(shí)體發(fā)生的最適溫度為16-25，氣溫低于16，子實(shí)體色澤為淡橙色，子實(shí)體呈鮮橙紅色。朱紅硫磺菌菌絲體適宜酸堿度范圍為ph3.08.0，最適酸堿度為ph4.06.5。朱紅硫磺菌的子實(shí)體產(chǎn)量與光照條件無(wú)關(guān)，但光照強(qiáng)度影響子實(shí)體的發(fā)生時(shí)間和色澤。朱紅硫磺菌栽培原料廣泛，凡栽培木腐菌的培養(yǎng)料均可用于栽培朱紅硫磺菌。1.2.4 對(duì)硫磺菌的發(fā)酵液抗菌活性進(jìn)行了初步研究研究通過(guò)硫磺菌深層發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)7種常見供試細(xì)菌

15、、3種霉菌和10種植物病原菌抗菌活性初步的試驗(yàn)結(jié)果表明,硫磺菌發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對(duì)馬鈴薯芽孢桿菌、北京棒狀桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌7種細(xì)菌(其中金黃色葡萄球菌是人體重要的化膿性細(xì)菌,大腸桿菌是人體腸道感染細(xì)菌和黑根霉均有較為顯著的抗菌活性,對(duì)小麥赤霉、辣疫霉、黃瓜炭疽、小麥根腐和棉花黃萎這些植物病原菌均有中等以上的抗菌作用,對(duì)甘薯黑斑、煙草赤星、蘋果腐爛病菌具有較弱的抗菌效果;而正丁醇萃取物對(duì)馬鈴薯芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌3種細(xì)菌和小麥赤霉、小麥根腐、蘋果褐腐、辣椒疫霉和黃瓜炭疽病菌5種植物病原菌也具有較好的抗菌效果,且總體上抗菌

16、活性隨濃度的增大而增強(qiáng),但因?yàn)槭浅醮卧囼?yàn),處理濃度選擇較少,僅對(duì)一部分供試菌株測(cè)得最佳抗菌濃度,所以在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)繼續(xù)擴(kuò)大該菌株發(fā)酵液的抗菌譜及最佳抗菌濃度。整體上看在相同試驗(yàn)濃度下乙酸乙酯萃取物較正丁醇萃取物的抗(殺) 菌作用更為明顯,說(shuō)明該菌株發(fā)酵液活性成分主要集中在乙酸乙酯萃取物中,對(duì)以后的研究工作有所指導(dǎo)。該試驗(yàn)僅對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行了抗菌活性的室內(nèi)測(cè)試,至于發(fā)酵產(chǎn)物中具體的活性成分還不清楚。對(duì)于常見植物病菌的抗制作用只著眼于對(duì)菌絲的抑制效果,對(duì)于被抑制的菌絲餅是僅受到抑制,還是被殺死以及其作用機(jī)制,對(duì)其抑菌成分的分離篩選和確定都需要在后續(xù)的工作中進(jìn)一步研究。1.2.5 硫磺菌原變種液體培養(yǎng)代

17、謝物生物活性分析很多木腐擔(dān)子菌的子實(shí)體和純培養(yǎng)菌絲都能夠分泌草酸,一般認(rèn)為草酸的分泌與木腐過(guò)程密切相關(guān),但是其在白腐和褐腐過(guò)程中的作用有明顯的差異,在褐腐菌中主要是在降解纖維素、半纖維素等碳水化合物的過(guò)程中,作為fenton類型的氧化作用的質(zhì)子供體,促進(jìn)復(fù)雜化合物的降解,也有報(bào)道認(rèn)為草酸的分泌與生長(zhǎng)環(huán)境中重金屬離子的耐受有關(guān),但是沒(méi)有報(bào)道論及木腐菌液體培養(yǎng)生長(zhǎng)代謝過(guò)程所產(chǎn)生的昆蟲毒理效果。研究發(fā)現(xiàn)硫磺菌液體培養(yǎng)物具有對(duì)果蠅的致死效應(yīng)5,而菌絲體分泌的草酸與此生物活性相關(guān)。昆蟲中腸道內(nèi)環(huán)境一般呈中性至堿性,并且具有一定的ph 值緩沖能力,草酸可能是通過(guò)破壞了腸道的酸堿平衡,從而導(dǎo)致果蠅的死亡,但

18、是我們?cè)趯?duì)硫磺菌紅色變種進(jìn)行研究時(shí),發(fā)現(xiàn)酸的種類和濃度對(duì)果蠅致死效率影響很大6。以上理由無(wú)法解釋這種明顯的差異,因此很可能還有另外的致死因素。我們還發(fā)現(xiàn)一種堿性條件下呈紫紅色的酸性色素也具有同樣的生物活性。最近weber7 報(bào)道從硫磺菌的子實(shí)體中分離到一種多烯類的色素laetiporic acid ,該報(bào)道還稱液體培養(yǎng)條件下硫磺菌也可以產(chǎn)生laetiporic acid ,但是該報(bào)道沒(méi)有明確指明變種,而且沒(méi)有相關(guān)的生物活性分析報(bào)道。由于多烯類物質(zhì)普遍具有抗生素活性,而ershova8等最近報(bào)道硫磺菌的液體培養(yǎng)產(chǎn)物具有廣譜抗菌效果,所以該色素可能導(dǎo)致果蠅死亡的一個(gè)因素,但是到目前尚不能確定此未知

19、色素是否是laetiporic acid。很多蕈菌的子實(shí)體具有殺蟲效果,并且有很多種具有殺蟲活性的物質(zhì)已經(jīng)成功分離純化。從一種食用菌嗜球果傘中分離到的strobilurins 及其系列衍生物已經(jīng)被用于開發(fā)生物農(nóng)藥,因此蕈菌源生物殺蟲劑具有廣闊的開發(fā)前景。此前的研究的多是以子實(shí)體為研究對(duì)象,而子實(shí)體的來(lái)源受諸多不利因素如時(shí)間和采集地的限制,研究表明利用液體大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)開發(fā)蕈菌源生物殺蟲劑具有潛在的可行性。1.3 實(shí)驗(yàn)研究的意義硫磺菌是一種非常好的藥材，能調(diào)節(jié)肌體，增進(jìn)健康、抵抗疾病，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)小白鼠肉瘤180和艾氏癌抑制率分別為80%和90%。硫磺菌還可以產(chǎn)生齒孔菌酸可用于合成甾體藥物。另

20、外還產(chǎn)生甜菜堿、胡蘆巴堿和等生物堿。通過(guò)查找文獻(xiàn)，我們了解到現(xiàn)階段對(duì)硫磺菌的研究，在于變種的探討以及發(fā)酵液的實(shí)用性研究，而對(duì)硫磺菌最基本的生長(zhǎng)條件的研究還不多。所以通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，我們可以進(jìn)一步詳細(xì)的了解硫磺菌液體培養(yǎng)生長(zhǎng)的最適條件，可以為大規(guī)模生長(zhǎng)硫磺菌液體菌絲，從而大規(guī)模種植硫磺菌作參考，為國(guó)內(nèi)研究新型藥物作出貢獻(xiàn)。1.4 實(shí)驗(yàn)研究的目的在有關(guān)文獻(xiàn)中指出，一般食用真菌的最佳外部培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度為25、裝液量為75ml/250ml、搖瓶轉(zhuǎn)速為150r/min培養(yǎng)120h8。在上述條件下，通過(guò)不同濃度的黃豆?jié){、不同濃度的葡萄糖、不同種類的氮源（包括黃豆?jié){、尿素、牛肉膏、蛋白胨、(nh4)2so

21、4）、不同種類的碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖）、酸堿度幾個(gè)單因素的控制以及各因素的正交實(shí)驗(yàn)9，采用液體發(fā)酵技術(shù)10培養(yǎng)硫磺菌菌絲體，并稱量每次培養(yǎng)的菌絲體濕重，從而確定硫磺菌的最適生長(zhǎng)條件。1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方案單 因 素 實(shí) 驗(yàn)不同濃度黃豆?jié){的影響不同濃度葡萄糖的影響不同濃度葡萄糖的影響不同ph值的影響不同碳源的影響正 交 實(shí) 驗(yàn)最 佳 培 養(yǎng) 基 配 方 比 分 析不同氮源的影響 2. 材料和方法2.1 材料2.1.1 主要儀器設(shè)備九陽(yáng)牌豆?jié){機(jī)、遠(yuǎn)紅外快速恒溫干燥箱、shz-型循環(huán)水真空泵、bs223s電子天平、hzqqx全恒振蕩搖床、高壓滅菌鍋2.1.2 菌種 硫磺菌菌株由東華理工大學(xué)

22、化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院食用菌研究中心提供。2.1.3 主要試劑 0.1mnaoh溶液、0.1mhcl溶液。2.1.4 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基：黃豆12.5g（取豆?jié){）、葡萄糖20g、水1000ml、ph自然、121滅菌20min。2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 液體菌種的制作在基本培養(yǎng)基中接入硫磺菌母種，25，150r/min搖瓶120h，即成液體菌種。2.2.2 不同濃度的黃豆?jié){對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響將75g黃豆浸泡24h后，磨成豆?jié){，加入蒸餾水配成3000ml的溶液，用玻璃棒混勻。配制成黃豆?jié)舛炔煌呐囵B(yǎng)基各500ml，黃豆的濃度分別是7.5g/l、10g/l、12.5g/l、15g/l、17.5g/l

23、、20g/l、22.5g/l、25/l，每個(gè)黃豆量的裝液量是75ml/250ml，重復(fù)四組，貼好標(biāo)簽。然后放入高壓滅菌鍋滅菌20min，冷卻后放在無(wú)菌操作臺(tái)上1h后，開始接種。（注：每瓶接種量要一樣）最后放入hzqqx全恒振蕩搖床進(jìn)行搖床培養(yǎng)，溫度為25，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)120h后統(tǒng)一用絲襪在shz-型循環(huán)水真空泵上抽濾5min，在電子天平上稱量菌絲濕重。2.2.3 不同濃度的葡萄糖對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響將25g黃豆浸泡24h后，磨成豆?jié){，加入蒸餾水配成2000ml的溶液，用玻璃棒混勻。取400ml溶液，作五組，每組加入不同量的葡萄糖，葡萄糖的濃度分別是10g/l、15g/l、20g/l、

24、25g/l、30g/l. 每個(gè)葡萄糖量的裝液量是75ml/250ml，重復(fù)四組，貼好標(biāo)簽。然后放入高壓滅菌鍋滅菌20min，冷卻后放在無(wú)菌操作臺(tái)上1h后，開始接種。（注：每瓶接種量要一樣）最后放入hzqqx全恒振蕩搖床進(jìn)行搖床培養(yǎng)，溫度為25，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)120h后統(tǒng)一用絲襪在shz-型循環(huán)水真空泵上抽濾5min，在電子天平上稱量菌絲濕重。2.2.4 不同種類的氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響將12.5g黃豆浸泡24h后，磨成豆?jié){，加入蒸餾水配成1000ml的溶液，用玻璃棒混勻。取出400ml作為培養(yǎng)基，向溶液中加入8g葡萄糖，再分別取5g尿素、牛肉膏、蛋白胨、(nh4)2so4分別加入四個(gè)

25、400ml的蒸餾水中，再向其中分別加入8g葡萄糖，混勻，確保完全溶解。然后裝瓶，每瓶裝液量為75ml/250ml，重復(fù)四組，貼好標(biāo)簽。然后放入高壓滅菌鍋滅菌20min，冷卻后放在無(wú)菌操作臺(tái)上1h后，開始接種。（注：每瓶接種量要一樣）最后放入hzqqx全恒振蕩搖床進(jìn)行搖床培養(yǎng)，溫度為25，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)120h后統(tǒng)一用絲襪在shz-型循環(huán)水真空泵上抽濾5min，在電子天平上稱量菌絲濕重。2.2.5 不同種類的碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響將25g黃豆浸泡24h后，磨成豆?jié){，加入蒸餾水配成2000ml的溶液，用玻璃棒混勻。取出500ml溶液四組作為培養(yǎng)基，向每組分別加入10g葡萄糖、乳糖、淀粉、

26、蔗糖，然后裝瓶，每瓶裝液量為75ml/250ml，重復(fù)四組，貼好標(biāo)簽。然后放入高壓滅菌鍋滅菌20min，冷卻后放在無(wú)菌操作臺(tái)上1h后，開始接種。（注：每瓶接種量要一樣）最后放入hzqqx全恒振蕩搖床進(jìn)行搖床培養(yǎng)，溫度為25，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)120h后統(tǒng)一用絲襪在shz-型循環(huán)水真空泵上抽濾5min，在電子天平上稱量菌絲濕重。2.2.6 不同ph對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響將25g黃豆浸泡24h后，磨成豆?jié){，加入蒸餾水配成2000ml的溶液，用玻璃棒混勻。取出300ml溶液六組作為培養(yǎng)基，通過(guò)0.1mnaoh溶液和0.1mhcl溶液調(diào)節(jié)溶液的ph，使ph分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0

27、、7.5。然后裝瓶，每瓶裝液量為75ml/250ml，重復(fù)四組，貼好標(biāo)簽。然后放入高壓滅菌鍋滅菌20min，冷卻后放在無(wú)菌操作臺(tái)上1h后，開始接種。（注：每瓶接種量要一樣）最后放入hzqqx全恒振蕩搖床進(jìn)行搖床培養(yǎng)，溫度為25，轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)120h后統(tǒng)一用絲襪在shz-型循環(huán)水真空泵上抽濾5min，在電子天平上稱量菌絲濕重。2.2.7 正交實(shí)驗(yàn)選出不同濃度的黃豆?jié){、不同濃度的葡萄糖、不同ph三個(gè)單因素的三個(gè)水平進(jìn)行組合培養(yǎng)，稱量菌絲濕重，從而確定培養(yǎng)基的最佳配方。3 結(jié)果及分析3.1 不同濃度的黃豆?jié){對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響按2.2.2 中的方法稱量得到菌絲的濕重結(jié)果見表3-1及圖3-1

28、表3-1 不同濃度的黃豆?jié){對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響的結(jié)果黃豆?jié)舛龋╣/l）7.51012.51517.52022.525菌絲濕重（g/100ml）11.2912.0612.3013.5315.7712.7912.2610.58圖3-1 不同濃度的黃豆?jié){對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由表3-1和圖3-1可知，其他外部培養(yǎng)條件不變的情況下，隨著黃豆量的增加，菌絲濕重也在增加，在黃豆?jié)舛葹?7.5g/l左右時(shí)，菌絲體的濕重最大，以后隨著黃豆?jié)舛鹊奶岣?，菌絲濕重下降。由此可知，硫磺菌的最適黃豆?jié)舛仁?7.5g/l左右。3.2 不同濃度的葡萄糖對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響按2.2.3 中的方法稱量得到菌絲的濕重結(jié)果見表3-2及圖3-2

29、表3-2 不同濃度的葡萄糖對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響的結(jié)果葡萄糖濃度（g/l） 1015202530菌絲濕重（g/100ml）12.2114.3915.4413.7511.83圖3-2 不同的葡萄糖量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 由表3-2和圖3-2可知，其他外部培養(yǎng)條件不變的情況下，隨著葡萄糖濃度的增加，菌絲濕重也在增加，在葡萄糖濃度為20g/l左右時(shí)，菌絲體的濕重最大，以后隨著葡萄糖量的提高，菌絲濕重下降。由此可知，硫磺菌的最適葡萄糖濃度是20g/l左右。 3.3 不同種類的氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響按2.2.4中的方法稱量得到菌絲的濕重結(jié)果見表3-3表3-3不同種類的氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響的結(jié)果不 同 氮 源尿素(n

30、h4)2so4黃豆牛肉膏 蛋白胨菌絲濕重（g/100ml）0.818.4815.7416.9112.11由表3-3可知，其他外部培養(yǎng)條件不變的情況下，隨著加入的氮源不同，菌絲濕重也不一樣，在加入牛肉膏時(shí)，菌絲體的濕重最大，而加入尿素，(nh4)2so4這些無(wú)機(jī)氮源，長(zhǎng)出的菌絲很少，特別是尿素，菌絲在含有尿素的培養(yǎng)基中幾乎不生長(zhǎng)。但在加入黃豆，牛肉膏，蛋白胨的有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中，菌絲能夠很快生長(zhǎng)。雖然含有牛肉膏的培養(yǎng)基長(zhǎng)出的菌絲最多，但一般情況下，考慮到原料來(lái)源的難易及價(jià)格因素，在液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，一般宜選黃豆作為氮源。3.4 不同種類的碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響按2.2.5 中的方法稱量得到菌絲的濕重

31、結(jié)果見表3-4表3-4不同種類的碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響的結(jié)果不 同 碳 源葡萄糖乳糖蔗糖淀粉菌絲濕重（g/100ml）16.3715.7215.5512.82由表3-4可知，其他外部培養(yǎng)條件不變的情況下，隨著加入的碳源不同，菌絲濕重也不一樣，從結(jié)果可以看出，這四種碳源都能加快菌絲的生長(zhǎng)，但是加入葡萄糖的培養(yǎng)基，菌絲生長(zhǎng)最快，所以菌絲濕重最大。所以由此可知硫磺菌的最適碳源是葡萄糖。3.5 不同的ph對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響按2.2.6 中的方法稱量得到菌絲的濕重結(jié)果見表3-5及圖3-3表3-5 不同的ph對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響的結(jié)果ph55.566.577.5菌絲濕重（g/100ml）15.6416.9215.

32、6415.5115.215.09圖3-3 不同的ph對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響由表3-5和圖3-3可知，其他外部培養(yǎng)條件不變的情況下，在不同ph的培養(yǎng)基中，菌絲生長(zhǎng)情況不一樣，ph為5.5時(shí)菌絲生長(zhǎng)量最大，但是ph5.5之后，菌絲生長(zhǎng)量越來(lái)越少。由此可知硫磺菌的最適ph是5.5。3.6 不同濃度的葡萄糖、黃豆?jié){和ph值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響表36 培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)因素水平水平不同濃度葡萄糖g/l（a）不同濃度黃豆g/l（b）初始ph（c） 1 1515 5.0 2 2017.5 5.5 3 2520 6.0 表37 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析編號(hào)abc濕重（g/100ml）111112.17212215.45313

33、310.90421212.68522313.65623113.15731313.91832112.28933212.20k138.5236.7639.60k239.4841.3840.33k336.3936.2536.46x112.8412.2512.20x213.1613.7913.44x312.1312.0812.15r1.021.711.29圖34 三因素水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀圖正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析詳見上表36和表37，其直觀分析圖為圖34。從表37的r值和直觀圖34可知，本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的三因素對(duì)菌絲產(chǎn)量的影響順序?yàn)椋篵ca，說(shuō)明不同濃度的黃豆?jié){是主要影響因素，其次是不同ph值，再次是不同濃度的葡

34、萄糖。而其中又以a因素的水平2（葡萄糖濃度20g/l），b因素的水平2（黃豆?jié){濃度為17.5g/l），c因素的水平2（ph為5.5）的組合菌絲產(chǎn)量最高，即初步認(rèn)為a2b2c2為最佳配比。小結(jié)： 試驗(yàn)結(jié)果表明，硫磺菌液體培養(yǎng)菌絲的最優(yōu)培養(yǎng)基為：以濃度為17.5g/l的黃豆?jié){為氮源，濃度為20g/l的葡萄糖為碳源，初始ph值為5.5，培養(yǎng)溫度為25、裝液量為75ml/250ml、搖瓶轉(zhuǎn)速為150r/min的外部培養(yǎng)條件下培養(yǎng)120h后，菌絲的生長(zhǎng)量可以達(dá)到最高，為16.92g/100ml（菌絲濕重）。通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)，不同種類的碳源對(duì)菌絲的生長(zhǎng)，影響不是主要的。在以同濃度的葡萄糖、乳糖、蔗糖、

35、淀粉分別作為碳源的培養(yǎng)條件下，菌絲生長(zhǎng)量的變化不是很顯著。不過(guò)一般情況下，液體培養(yǎng)食用菌菌絲都是以葡萄糖作為碳源。但是不同種類的氮源對(duì)菌絲的生長(zhǎng)，結(jié)果是不一樣的，在加入牛肉膏時(shí)，菌絲體的濕重最大，而加入尿素，(nh4)2so4這些無(wú)機(jī)氮源，長(zhǎng)出的菌絲很少，特別是尿素，菌絲在含有尿素的培養(yǎng)基中幾乎不生長(zhǎng)。但在加入黃豆，牛肉膏，蛋白胨的有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中，菌絲能夠很快生長(zhǎng)。從結(jié)果中可以看出，以牛肉膏和黃豆?jié){作為氮源的培養(yǎng)基，加入牛肉膏的長(zhǎng)出的菌絲更多，但由于牛肉膏成本比黃豆高的多，而且黃豆來(lái)源比較廣泛，所以一般情況下還是選黃豆?jié){作為氮源。通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果我們還發(fā)現(xiàn)，不同濃度的葡萄糖對(duì)菌絲的生長(zhǎng)，影響不

36、是主要的。在以濃度為10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l的葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)條件下，菌絲的生長(zhǎng)量變化不是很顯著。所以我們?cè)谘芯苛蚧蔷L(zhǎng)條件時(shí)可以降低葡萄糖的用量。尤其是在大批量生長(zhǎng)的時(shí)候，也可以達(dá)到降低成本的目的。而不同濃度的黃豆?jié){對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響是比較顯著，以濃度為17.5g/l的黃豆?jié){作為氮源培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)量最大。而以與此濃度相鄰的黃豆?jié){作為氮源培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)量陡與之相差很大。黃豆?jié){除了含有豐富的蛋白質(zhì)外，還含有多種維生素和大量礦質(zhì)元素，而這些因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)是非常有利的。我們通過(guò)對(duì)不同濃度的黃豆?jié){對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響這一實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定黃豆?jié){的用量和作用，使菌絲生長(zhǎng)條

37、件更完善，在制作液體培養(yǎng)菌絲培養(yǎng)基的過(guò)程中也可以避免不必要的浪費(fèi)。 總之試驗(yàn)結(jié)果表明硫磺菌對(duì)碳源的利用較為廣泛，有機(jī)氮比無(wú)機(jī)氮更利于硫磺菌絲體的生長(zhǎng)使用牛肉膏、黃豆?jié){等氮源時(shí)硫磺菌菌絲生長(zhǎng)較快，這都與有關(guān)資料基本一致1113。這次實(shí)驗(yàn)前前后后，我失敗過(guò)好幾次。特別是培養(yǎng)菌絲的時(shí)候，培養(yǎng)基有時(shí)候會(huì)被污染，長(zhǎng)出的菌絲就會(huì)很少，味道也會(huì)變化。這是由于菌絲被污染，其他雜菌就會(huì)溶解長(zhǎng)出的菌絲，使自己得到繁殖。后經(jīng)過(guò)試驗(yàn)以及老師的講解，發(fā)現(xiàn)污染是由于接種時(shí)，培養(yǎng)基被污染了。如果每次研究出的最佳生長(zhǎng)條件可以用來(lái)作為下一次的基本條件，我想本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)更準(zhǔn)確。在前言中，描述了關(guān)于對(duì)硫磺菌的發(fā)酵液抗菌活性進(jìn)行了

38、初步研究以及硫磺菌原變種液體培養(yǎng)代謝物生物活性分析，由于時(shí)間和條件的問(wèn)題，還有待后人做進(jìn)一步的研究。通過(guò)這次試驗(yàn)，讓我學(xué)到很多東西，讓我了解到，作實(shí)驗(yàn)要懂得早作計(jì)劃，這樣才會(huì)減少失敗的次數(shù)，以及減少實(shí)驗(yàn)用品的浪費(fèi)。而且作實(shí)驗(yàn)時(shí)，要注重和老師間的交流，以及和伙伴之間的分工合作。這次試驗(yàn)對(duì)我以后的工作和生活都將會(huì)有很大的幫助。 致 謝感謝化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院生物系的領(lǐng)導(dǎo)和所有老師給我們提供了良好的畢業(yè)設(shè)計(jì)環(huán)境；感謝 老師在我整個(gè)畢業(yè)設(shè)計(jì)過(guò)程中對(duì)我的悉心指導(dǎo)以及提出了許多建設(shè)性的意見，為我能夠圓滿完成畢業(yè)設(shè)計(jì)，給與極大的幫助；還要感謝 老師為我提供實(shí)驗(yàn)儀器以及梁曉娟、丁志剛等同學(xué)的幫助和支持。兩位老師對(duì)畢業(yè)設(shè)計(jì)的嚴(yán)格要求，尤其是對(duì)試驗(yàn)過(guò)程的嚴(yán)謹(jǐn)與求實(shí)的態(tài)度，令我受益非淺，對(duì)學(xué)生的細(xì)心關(guān)照，也令我非常感動(dòng)。在此，學(xué)生向兩位老師表示最崇高的敬意和由衷的感謝。參考文獻(xiàn)：1 卯小嵐主編.中國(guó)大型真菌m.河南科學(xué)技術(shù)出版社.20o1；475.2 王娟，高錦明，張鞍靈,李曉明.硫磺菌發(fā)酵液抗菌活性的初步研究. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15（6）.3 曾先富，廖志勇，張 軍.野生朱紅硫磺菌馴化栽培研究. 中國(guó)食用菌，2005，26（6）.4 池玉杰.潘學(xué)仁.康海燕等.硫磺菌原變種與淡紅變種培養(yǎng)特性研