IP,COIP,Pulldown之間的區(qū)別

1、ip co-ip pull-down 免疫沉淀 （immunoprecipitation ip） 免疫沉淀（免疫沉淀（immunoprecipitation ip）是利）是利 用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗 原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來。原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來。 免疫共沉淀 （co-immunoprecipitation co-ip） 免疫共沉淀（免疫共沉淀（co-immunoprecipitation co-ip）是以抗）是以抗 體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相 互作用

2、的經(jīng)典方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下互作用的經(jīng)典方法。其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下 被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的 相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀的抗體免疫沉淀 x，那么與，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。也能沉淀下來。 pull down pull down其基本原理是將靶蛋白其基本原理是將靶蛋白-親和配基親和固化在親和配基親和固化在 親和樹脂上親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物作為與目的蛋白親和的支撐物,充當(dāng)一種充當(dāng)一種“誘誘 餌蛋白餌

3、蛋白”,目的蛋白溶液過柱目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的可從中捕獲與之相互作用的 “捕獲蛋白捕獲蛋白”(目的蛋白目的蛋白),洗脫結(jié)合物后通過洗脫結(jié)合物后通過sds-page 電電 泳分析泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目 的蛋白的蛋白,“誘餌蛋白誘餌蛋白”和和“捕獲蛋白捕獲蛋白”均可通過細(xì)胞裂解物均可通過細(xì)胞裂解物 、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲 得得 co-ipco-ip的原理示的原理示 意圖意圖 pull-down的原理示意圖的原理示意圖 ip c a

4、co-ip c a+b pull-down c+b a proteina proteinb affinity ligandc protocol co-ip 1.grow cells 100 ml culture from od.i = 0.2 to od.f = 1-1.3 2.pellet 50 ml each culture and wash pellets water (20 ml spin 5 min 3100 rmp) 3.freeze pellets at -80 4.resuspend each 50 ml culture pellet in 180 ul buffer i (k

5、eep always in ice , 0.1g pellet + 180ul) 5.baed-beat pellets 5 times 200-300 rpm (keep in ice between ) spin 14000 rpm until sn is clear ( spin of 15 min ,take sn and spin it again 15min and once more if necessary ) 6.quantify protein (bradford biorad).approx 35ug/ul were obtained 7.take input aliqu

6、ot ( corresponding to 100 ug is enough . dilute in 1pbs until volume is 20 ul , add 2sds buffer with me-oh and boil for 6 min, 5loading buffer + 5% -me-oh) 8.incubate 6 mg of total protein wce ( around 200 ul ) to anti-ha ab ( 3ul=6ug) 9.incubate 3hr at 4 (no rotation) 10. add wce anti-ha ab to 75 u

7、l pre- washed beads ( 3 times with 200ul pbs and 1 time with 300ul buffer i ) 11.incubate for 1hr with rotation at 4 12.spin in ufuge for 2 min 1500 rpm 13.take sn (keep on aliquot same volumes as input aliquots, boil in the same way) 14.wash beads with 400ul buffer 3 times 15.boil beads in 50 ul 2s

8、ds buffer with me-oh and boil for 6min 免疫沉淀 （immunoprecipitation ip） 免疫沉淀（免疫沉淀（immunoprecipitation ip）是利）是利 用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗 原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來。原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來。 thank you for listening ! 抗體數(shù)據(jù)資源庫正式開放抗體數(shù)據(jù)資源庫正式開放 全球抗體搜索引擎全球抗體搜索引擎fantibodytm 上線上線 全球抗體搜索引擎fantibodytm (http:/) 是繼基因數(shù)據(jù)庫、蛋 白數(shù)據(jù)庫之后全新推出的網(wǎng)上公共數(shù)據(jù)資源平臺。在生物基礎(chǔ)研究、臨床診斷及 抗體藥物的研發(fā)中，抗體都是必不可少具有極為廣泛的應(yīng)用?？贵w的種類數(shù)量多 達(dá)數(shù)十萬種，且以每年