輔酶Q10與拉貝洛爾聯(lián)合用藥對自發(fā)型高血壓大鼠治療效果的研究

1、開題報告：輔酶 Q10 抗脂質(zhì)過氧化作用對SHR 大鼠高血壓的防治研究2 級法文班徐呈蘭曉曦龐文璟解軼聲林盟菲孟晉方原吳貽明指導(dǎo)老師：李稻實驗?zāi)康?：探究、比較單用輔酶 Q10 以及輔酶 Q10 與拉貝洛爾協(xié)同作用對 SHR 大鼠的血壓升高的抑制或降壓的作用，并對輔酶 Q10 的降壓作用機制進行初步探討。實驗意義 ：高血壓是一種常見、多發(fā)病，原發(fā)性高血壓的病因不詳，但與遺傳因素和環(huán)境因素密切相關(guān)，所以對高血壓高危人群的防治工作尤為重要。新近發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可能參與了高血壓發(fā)生和發(fā)展的病理過程 9 。但也有報道認為， 輔酶 Q10 具有較好的抗脂質(zhì)過氧化的作用 8 。本實驗利用血壓未達平臺期的

2、 SHR 大鼠模擬高血壓高危人群， 并初步研究輔酶 Q10 以及輔酶 Q10 與拉貝洛爾協(xié)同作用對高血壓防治的效果，探索臨床用藥的新途徑。技術(shù)路線：SHR 大鼠配對分組測血壓、心率取血，冷凍保存實驗組大鼠：CoQ10對照組大鼠：生理鹽水15 天后肌肉注射拉貝洛爾，測血壓、心率處死動物，取血，測指標，心臟稱重數(shù)據(jù)分析、 討論結(jié)果實驗動物：大鼠 （雄性， 10 周齡，只， 隨機分為： 對照組和實驗組）動物來源：中國科學(xué)院動物實驗中心實驗器材 ：1B 型 RBP 大鼠血壓計、i-STAT型血氣電解質(zhì)分析儀、725 型分光光度計、80-2 臺式離心機、旋渦混勻器、水浴箱、研磨器、分析天平（ 0.1mg

3、）、可調(diào)式 Eppendorf 移液器、鼠臺、量筒、試管、注射器、常用手術(shù)器材、保鮮薄膜等。檢測試劑盒：丙二醛（ MDA ）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（南京建成生物工程研究所）一氧化氮（ NO ）測試盒（南京建成生物工程研究所）實驗藥品：生理鹽水：作為安慰劑，上海第二醫(yī)科大學(xué)病生教研室提供輔酶 Q10 膠囊：上海信誼制藥公司拉貝洛爾：江蘇天禾制藥公司無水乙醇、冰醋酸用量：輔酶Q10 ：20mg/day服用 15 天。拉貝洛爾：小劑量具體用量在預(yù)實驗后確定。實驗方法與操作步驟： 12 只大鼠穩(wěn)定兩天，每天測一次血壓（1B 型 RBP 大鼠血壓計），使大鼠習(xí)

4、慣。根據(jù)大鼠血壓配對后隨機分成兩組。（隨機數(shù)法）兩天后，眼球取血1.5 l 于試管。靜置后離心（3000rpm10min ）取上層血清，再一次離心（ 5000rpm 5min ）取上清液，-20C 冷凍待用。實驗組大鼠灌胃輔酶Q10（ 20mg/day）15 天，對照組大鼠灌胃安慰劑（生理鹽水） 15 天。灌胃溶液自行于灌胃當(dāng)天調(diào)配，灌胃液為20mg/3ml 生理鹽水。每隔5 天測量并記錄血壓、心率。第 15 天，測完血壓、心率后，肌肉注射拉貝洛爾（劑量待定），于 30min 后測量并記錄血壓和心率。乙醚麻醉動物，處死動物，稱重。用大剪刀開胸，即刻用注射器從心臟抽血，將針頭對準電極板注血口，注

5、入全血到標準刻度，蓋上小蓋，插入i-STAT 血液分析儀器，分析并記錄血液中鉀離子。最后再取血1.5ml 于試管中，血液靜置后離心取上層血清，將15 天前冰凍的血清取出，化凍，兩份血清一起做丙二醛、SOD、NO 檢測（方法詳見試劑盒說明書）并記錄結(jié)果。取出心臟，清理、稱重，計算：心重（g） /體重（ g）。運用配對T 檢驗的方法，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。預(yù)期結(jié)果：1服藥 15 天后，對照組和實驗組大鼠平均血壓有明顯差異，說明輔酶Q10 對SHR大鼠有降壓作用，推遲其血壓達平臺期的時間（統(tǒng)計學(xué)上有意義）。BHPRControlStudyControlStudyGroupGroupGroupGrou

6、p服用藥物 15 天后，實驗組對照組大鼠平均血壓、心率比較（ n=6)2拉貝洛爾 +輔酶 Q 用藥時， 可降低拉貝洛爾的劑量，達到降壓效果，或延長藥效維持時間。BP 0Study GroupControl Group15天后，肌注拉貝洛爾后，實驗組對照組大鼠平均血壓變化(n=6)3血清中 MDA 濃度：服用輔酶Q10 后明顯下降； SOD 濃度：服用輔酶度：服用輔酶Q10 后明顯升高。 證明輔酶Q10 的降壓機制為抗脂質(zhì)過氧化。Q10 后不變；NO濃K+SOD4.實驗組和對照組由于血壓不同而使心臟負荷不同，導(dǎo)致心肌增生程度不同，表現(xiàn)為心重不同。ACControl輔酶 Q10 實驗組與對照組心重

7、 /體重值比較（XSD ）StudyControlStudy可能遇到的困難和問題及解決的措施Body Weight(kg)Heart Weight （ g)/Body Weight(kg)GroupHeart Weight （ g)GroupGroupGroupNOMDAStudy Group為使實驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義，我們將動物數(shù)量控制1 經(jīng)費有限， 無法做大樣本量的藥效試驗，為 12Control只，并進行Group配對，盡最大可能使結(jié)果有說服力。2 小組成員對實驗操作經(jīng)驗不足，對于大鼠灌胃、測血壓等操作比較陌生。但在動物房老師B的耐心指導(dǎo)幫助下，將會順利完成實驗計劃，并對動物實驗的基本技術(shù)

8、有感性認識。(n=6)ControlStudyControlStudyDGroupGroupGroupGroup實驗組對照組大鼠血清生化指標(n=6)附錄：輔酶 Q10 的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀輔 酶Q(CoQ) ， 2,3- 二 甲 氧 -5- 甲 基 -6- 多 異 戊 二 烯 - 苯 醌(2,3-dimethoxy-5-methyl-6-multiprenyl-benzoquinone) 。 CoQ 不但存在于線粒體，還存在于漿膜和微粒體、溶酶體、高爾基體中。 CoQ 在細胞的生命過程中具有多方面的功能，在細胞中大都以還原型存在。輔酶 Q 有許多亞型， 人體中的存在的亞型稱為輔酶Q10 ，（ 2

9、,3-二甲氧 -5-甲基 -6-癸異戊烯-1,4- 苯醌），存在于日常飲食中，并可在人體組織細胞中生物合成，是一種氧化還原酶，在電子轉(zhuǎn)移和氧化磷酸化藕聯(lián)機制中起作用。輔酶Q10 濃度的高低，在呼吸鏈和ATP 合成中起了關(guān)鍵作用1 。上世紀70 年代，在日本人就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了輔酶Q10 對于高血壓有一定的治療意義。Yamagami 等人 2 研究了輔酶Q10 對于經(jīng)去氧皮質(zhì)酮（ deoxycorticosterone ）或鹽水溶液 (saline)誘導(dǎo)的繼發(fā)性高血壓大鼠的作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過六周的給藥后，其對于兩者收縮壓均有一定的降低作用；但是，不論是對照組、灌注輔酶Q10 組還是正常組的外周血管阻力均無

10、顯著差異。此后，各國科學(xué)家都開始關(guān)注于輔酶Q10 的降壓作用。 Folkers K 3 通過研究高血壓病人服用輔酶Q10 后的各項指標變化，提出輔酶Q10 降低血壓的機制是由于外周阻力的自我調(diào)節(jié)（autoregulation ），并且認為輔酶Q10 本身并無藥理活性，而是在轉(zhuǎn)錄水平上增長輔酶Q10酶。Danysz A. 等人 4的實驗 （先給 SHR 大鼠喂養(yǎng)一定時間的輔酶Q10 再注射普通劑量的尼群地平 /氨氯地平，分析血壓變化）則揭示了輔酶Q10 不會增大最大降壓幅度，但是能夠延長藥物對血壓控制的時間 （延長兩倍），因此提出輔酶Q10 的使用可以降低其他降壓藥的使用頻率。而 Rosenfe

11、ldt F.5 也提出將輔酶Q10 作為一種治療高血壓的輔助藥。在我國，關(guān)于輔酶Q10 的研究還比較少，但是也已經(jīng)有人6 得出了貝那普利（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑）聯(lián)用輔酶Q10 治療原發(fā)性高血壓比單用貝那普利效果好的結(jié)論。另外，縱觀其他的文獻，還能得出以下結(jié)論：Q10 對正常大鼠沒有降壓作用。在不同的高血壓動物模型中，口服輔酶Q10 對抑制血壓升高或降低血壓有效，但即便服用Q10 ，血壓仍比同類正常動物高20 到 30mmHg 。 Q10 的降壓作用表現(xiàn)在長期反復(fù)服藥之后，在急性實驗中即使用量高達100mg/kg 單劑量服用后也無效果。 SHR 大鼠模型中，服用（ 10mg/kg）Q10 對收

12、縮壓 180mmHg 的大鼠無降壓作用，但對血壓更高的大鼠有明顯作用。300mg 輔酶 Q10 的攝入量對人體無毒性作用。此外， CoQ10 有抗脂質(zhì)過氧化的作用，能對細胞產(chǎn)生保護作用7 。其可能的機制為8 ：（ 1）CoQH 2 與 ADP-perferryl ion作用ADP-Fe3+-2+ H 2O2 + CoQO2 + CoQH 2 ADP-Fe(2 ) CoQH 2 直接清除 O2-+ O2 + CoQ2 O2 + CoQH 2 H 2O2(3 ) CoQH 2 脂自由基或脂過氧基反應(yīng)2L + CoQH 2 2LH + CoQ2LOO + CoQH 2 2LOOH + CoQ氧自由基

13、能攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸(PUFA) 引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物（ LPO ），繼而分解成一系列復(fù)雜產(chǎn)物，其中包括丙二醛(MDA) 。脂質(zhì)過氧化作用及其產(chǎn)物能夠?qū)毎a(chǎn)生損害。而超氧化物歧化酶（SOD）是清除自由基的酶。研究表明9 ，氧自由基損害內(nèi)皮細胞后，會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能受損，表現(xiàn)為血管舒張因子（一氧化氮）分泌的減少。也有證據(jù)表明超氧陰離子使NO 失活有關(guān)，既氧化作用加強導(dǎo)致NO 損傷，氧自由基是 NO 損傷的誘導(dǎo)劑，超氧陰離子及氧化型LDL 使內(nèi)源性舒張因子NO 失活，而使內(nèi)皮細胞受損 10 。以上兩者相互作用，使NO 含量減少，收縮因子-舒張因子的平衡被打破，血管

14、在收縮因子的作用下發(fā)生收縮，使外周阻力升高，誘發(fā)高血壓9 。輔酶 Q10 作為一種抗氧化劑，能夠?qū)?nèi)皮細胞進行保護，其降低血壓的機制可能就與此有關(guān)。本實驗?zāi)康募词窍刖痛诉M行探討。參考文獻 ：1Ernster L.Facts and ideas about the function of coenzyme Q10 in mitochondria. In:Filkers K,Yamamura Y,eds.Biomedical and Clinical Aspects of Dcoenzyme Q.V oll Elseviet/North-Holland. Amsterdam,1997,1282Ya

15、magami T. Iwamoto Y. Folkers K. Blomqvist CG. Reduction by coenzyme Q10 of hypertension induced by deoxycorticosterone and saline in rats. International Journal for Vitamin & Nutrition Research. 44(4):487-96, 1974.3Folkers K. Drzewoski J. Richardson PC. Ellis J. Shizukuishi S. Baker L. Bioenergetics

16、 in clinical medicine. XVI. Reduction of hypertension in patients by therapy with coenzyme Q10. Research Communications in Chemical Pathology & Pharmacology. 31(1):129-40, 1981 Jan.4Danysz A. Oledzka K. Bukowska-Kiliszek M. Influence of coenzyme Q-10 on the hypotensive effects of enalapril and nitre

17、ndipine in spontaneously hypertensive rats. Polish Journal of Pharmacology. 46(5):457-61, 1994 Sep-Oct.5Rosenfeldt F. Hilton D. Pepe S. Krum H. Systematic review of effect of coenzyme Q10 in physical exercise, hypertension and heart failure. Review 29 refs Biofactors. 18(1-4):91-100, 2003.6 楊壽新 . 貝那普利聯(lián)用輔酶Q10對原發(fā)性高血壓療效觀察.中華使用醫(yī)學(xué)雜志 .2003,3(4).314-3157Beyer RE.Free Radic Biol Med