生殖毒性試驗流程及意義

1、.嚙齒類動物生殖毒性I、II、III段實驗流程及意義1.概述生殖毒性試驗（Reproductive toxicity study）是通過動物試驗反映受試物對哺乳動物生殖功能和發(fā)育過程的影響，預(yù)測其可能產(chǎn)生的對生殖細胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等親代生殖機能的不良影響，以及對子代胚胎-胎兒發(fā)育、出生后發(fā)育的不良影響。包括：生育力與早期胚胎發(fā)育毒性實驗（I段）、胚胎胎仔發(fā)育毒性試驗 （II段）、圍產(chǎn)期毒性試驗（III段）。生殖毒性試驗中，為方便實驗一般可將一個完整生命周期過程分成以下幾個階段如下圖所示：圖1. 動物生命周期劃分A. 從交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的發(fā)育和成熟、交配行為、

2、受精）。 B. 從受孕到著床（成年雌性生殖功能、著床前發(fā)育、著床）。C. 從著床到硬腭閉合（成年雌性生殖功能、胚胎發(fā)育、主要器官形成）。 D. 從硬腭閉合到妊娠終止（成年雌性生殖功能、胎仔發(fā)育和生長、器官發(fā)育和生長）。 E. 從出生到離乳（成年雌性生殖功能、幼仔對宮外生活的適應(yīng)性、離乳前發(fā)育和生長）。 F. 從離乳到性成熟（離乳后發(fā)育和生長、獨立生活的適應(yīng)能力、達到性成熟的情況）。 各段試驗研究階段如下：生育力與早期胚胎發(fā)育毒性實驗（I段）：A-B胚胎胎仔發(fā)育毒性試驗（II段） ：C-D圍產(chǎn)期毒性試驗（III段）：C-F1一般試驗設(shè)計簡介1.1受試物 生殖毒性試驗的受試物應(yīng)能充分代表臨床研究受

3、試物或上市藥品。1.2實驗動物 首選嚙齒類動物為大鼠。在胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究中，一般還需要采用第二種哺乳動物，家兔為優(yōu)先選用的非嚙齒類動物。1.3給藥1. 3.1計量選擇：至少應(yīng)設(shè)三個劑量組，必要時可增加劑量組。 高劑量：應(yīng)出現(xiàn)一些輕微的母體毒性反應(yīng)，或為最大給藥量/最大耐受量。 低劑量：應(yīng)為生殖毒性方面的“未觀察到不良反應(yīng)的劑量（NOAEL）”。1.3.2給藥途徑：給藥途徑應(yīng)與臨床擬用途徑一致（不用腹腔注射途徑，因腹腔注射會對胎兒及子宮產(chǎn)生直接影響）。1.4對照組 應(yīng)設(shè)賦形劑對照組。當(dāng)賦形劑可能產(chǎn)生作用或影響受試物的作用時，應(yīng)另設(shè)空白對照組。二、生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗（I段）生育力與

4、早期胚胎發(fā)育毒性試驗是對雌雄動物由交配前到交配期直至胚胎著床給藥，以評價受試物對動物生殖的毒性或干擾作用（生殖細胞接觸藥物后對受胎能力、生殖系統(tǒng)及子代有無不良影響）。評價內(nèi)容包括配子成熟度、交配行為、生育力、胚胎著床前階段和著床等。 研究階段包括生命周期的 A 階段和 B 階段如下圖所示：圖2. 生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗研究階段示意圖*注*：引自生殖毒性發(fā)育試驗設(shè)計和實施中應(yīng)該注意的問題，作者：常艷1.試驗流程如下圖所示：圖3. 生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗流程圖2.試驗流程圖解：2.1 分組及飼養(yǎng)：首先雌鼠、雄鼠分別按體重隨機分為給藥組和對照組，常規(guī)飼養(yǎng)，每天觀察并記錄動物體征和死亡情況

5、；2.2給藥期：雄鼠：交配前給藥4-10周，給藥期持續(xù)整個交配期，至處死；雌鼠：交配前兩周開始給藥，并持續(xù)至胚胎著床（GD6-GD7）；2.3陰道涂片檢查：合籠交配前2周須每天對雌鼠進行陰道涂片檢查，觀測每只雌鼠的性周期變化，以檢查其是否對交配和交配前時間有影響；2.4合籠：雌鼠、雄鼠1：1合籠交配，交配期2周。交配結(jié)束后雌鼠、雄鼠分別進行不同處理：雄鼠：交配成功后即可處死，并進行剖檢，保存睪丸、附睪、異常組織器官；檢測項目主要包括：附睪精子計數(shù)、精子活力檢查、精子畸形檢查；統(tǒng)計項目：攝食量、體重、生育率；雌鼠：未交配成功的雌鼠：交配結(jié)束后處死；交配成功孕鼠：每天觀察并記錄體征、死亡情況；每3

6、天測定體重、攝食量；并于GD13-GD15日處死，進行剖檢。保存子宮、卵巢及異常組織器官；檢測項目：計數(shù)黃體數(shù)、活胎、死胎、吸收胎數(shù)，并計算著床數(shù)；統(tǒng)計項目：攝食量、體重、受孕率、妊娠率、著床前丟失率、著床后丟失率；三、胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗（II段）胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗是研究妊娠動物自胚胎著床至硬腭閉合給藥，評價藥物對妊娠動物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響。實驗動物包括大鼠和家兔。評價內(nèi)容包括妊娠動物較非妊娠雌性動物增強的毒性、胚胎-胎仔死亡、生長改變和結(jié)構(gòu)變化等。研究階段主要包括生命周期的 C 階段至 D 階段如下圖所示：圖4. 胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗研究階段示意圖*注*：引自生殖毒性發(fā)育試驗設(shè)

7、計和實施中應(yīng)該注意的問題，作者：常艷1. 試驗流程如下圖所示：圖5. 胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗流程圖2. 實驗流程圖解：2.1制備孕鼠/孕兔，并按體重平均分為給藥組和對照組，常規(guī)飼養(yǎng)，每3天測定攝食量、體重；每天觀察并記錄體征、死亡情況；2.1給藥期：給藥期設(shè)定在懷孕動物胚胎著床至硬腭閉合期。孕鼠給藥期：GD6-GD15；孕兔給藥期：GD6-GD18；2.3剖檢：動物飼養(yǎng)至分娩前處死，剖腹取仔。孕鼠剖檢日期：GD20/GD21；家兔剖檢日期：GD28/GD29；母鼠/母兔：進行大體尸檢觀察胎盤是否異常；保存異常組織器官；計數(shù)：黃體數(shù)、活胎、死胎、吸收胎；計算：攝食量、體重、著床數(shù)；胎仔：胎仔清洗

8、干凈后分別測定每只胎仔體重、頂臀長，并進行大體外觀檢查。該過程以后胎鼠與胎兔處理是有區(qū)別的。胎鼠：50%胎仔制作骨骼標本，進行骨骼檢查；50%胎仔制作內(nèi)臟標本，進行內(nèi)臟檢查；胎兔：全部胎兔首先進行剖檢，進行內(nèi)臟檢查，然后將剖檢后胎兔剝離皮膚組織，并剔除脂肪，全部制作成骨骼標本，進行后期骨骼檢查。四、圍產(chǎn)期毒性試驗（III段）圍產(chǎn)期毒性試驗是檢測從胚胎著床到幼仔離乳給藥對妊娠/哺乳的雌性動物以及胚胎和子代發(fā)育的不良影響； 評價內(nèi)容包括妊娠動物較非妊娠雌性動物增強的毒性、出生前和出生后子代死亡情況、生長發(fā)育的改變以及子代的功能缺陷，包括F1代的行為、性成熟和生殖功能。研究階段包括生命周期中的 C

9、階段至 F 階段如下圖所示：圖6. 圍產(chǎn)期毒性試驗研究階段示意圖*注*：引自生殖毒性發(fā)育試驗設(shè)計和實施中應(yīng)該注意的問題，作者：常艷1.試驗流程如下圖所示：圖7. 圍產(chǎn)期毒性試驗流程圖2. 試驗流程圖解：2.1制備孕鼠，按體重平均分為給藥組和對照組，飼養(yǎng)至分娩，該階段為懷孕期，每天對孕鼠進行體征及死亡情況觀察；每3天進行體重、攝食量測定；2.1給藥期：設(shè)定在胚胎硬腭閉合至哺乳結(jié)束期，一般為孕鼠懷孕15日至子鼠離乳（GD15-PND21）進行給藥。2.3分娩：孕鼠一般于GD21-GD23分娩；在大鼠分娩結(jié)束后進行觀察（不能打擾其分娩，以免產(chǎn)生食仔現(xiàn)象），計數(shù)死胎數(shù)、活胎數(shù)、雌胎仔數(shù)和雄胎仔數(shù)；計算

10、F1代大鼠畸形率、成活率、性別比例；對胎鼠進行外觀畸形檢查，并分別測定每窩雌、雄胎仔總體重；后進入哺乳階段。2.3哺乳期：P代大鼠：每天進行體征及死亡情況觀察；每3天進行體重、攝食量測定，飼養(yǎng)至離乳；F1代胎鼠：每天計數(shù)雌、雄胎鼠數(shù)量；每3天分別測定雌、雄胎鼠總體重；于PND4進行窩仔數(shù)調(diào)整（減少由于每窩胎仔數(shù)目不同而產(chǎn)生的對胎鼠身體發(fā)育等指標的影響）；哺乳期至離乳后還需根據(jù)身體發(fā)育、反射發(fā)育等檢測指標日程安排對F1代胎鼠進行身體發(fā)育檢測和反射發(fā)育檢測；2.4離乳： F1代大鼠于PND21離乳，代表哺乳期結(jié)束。此時對P代雌鼠及F1代大鼠分別進行相應(yīng)處理：P代大鼠：哺乳期結(jié)束后（PND21）進行大體剖檢；保存:異常組織器官；統(tǒng)計攝食量、體重、哺乳成活率；F1代大鼠：每窩留存雌、雄仔鼠各1只，數(shù)量不夠時同劑量組仔鼠補齊，飼養(yǎng)至性成熟。該階段每天觀察并記錄F1代大鼠體征、死亡情況；每周測定攝食量、體重；據(jù)F1代仔鼠行為指標檢測日程安排進行轉(zhuǎn)棒試驗和穿梭箱試驗。2.5 F1代大鼠合籠交配：F1代大鼠性成熟后同劑量組雌鼠與雄鼠1:1配對，合籠交配，交配期為2周。交配結(jié)束后對雄鼠、雌鼠分別進行相應(yīng)處理：F1代雄鼠：處死，計算生育率；未孕雌鼠：處死，并進行大