溶解曲線[應用材料]

1、DNA溶解曲線表示擴增產物的特異性。曲線橫坐標是溫度，每個溫度點一個。一般從60到98度縱坐標是熒光強度的變化值（不是強度本身）。一開始加熱的時候，雖然熒光強度比較強，但是由于雙鏈沒有解離，所以熒光強度保持不變。當加熱接近于PCR產物Tm時，雙鏈開始解離，熒光強度變小，機器會比較前后2個溫度點的熒光強度，然后把2者的差值標在圖上。Tm到達時，有一般雙鏈解離，這時的熒光強度變化最大（峰值）。再加熱，雙鏈全部解離，所以熒光強度的變化又變小了。 你PCR產物大小不一，但是只要有相同或者相近的Tm，峰值就有可能在一個位置上。如果實際測得的峰值和理論計算的吻合，問題不大。如果有差別，說明有非特異性產物，

2、建議不要再用SYBR GREEN方法。標準的PCR過程分為三步：1.DNA變性（90-96）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA2.退火（25-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。3.延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。1、隨著溫度的升高，DNA雙鏈斷裂；接著溫度降低，到達退火溫度的時候，DNA雙鏈復性，熒光分子綁定在DNA雙鏈上，所以熒光信號值到達最高點。上面的是反映在擴增曲線上面的。如圖所示，這就是一個標準的

3、real time-qPCR溶解曲線。下面從幾個方面來解讀：2、接著DNA雙鏈分子由退火溫度約60度，繼續(xù)升溫，雙鏈斷開，DNA分子溶解。請注意溶解曲線的縱坐標，表示單位時間內熒光信號的變化量。當擴增產物特異，是單一產物的時候，這個縱坐標峰值所對應的橫坐標應該是一致的，即呈現(xiàn)單一的溶解峰，這個時候，在同樣的溫度下，可以認為是產物相同；如果溶解峰不單一，就意味有非特異性擴增。一般在熒光定量PCR中會用到擴增曲線.描述PCR動態(tài)進程的曲線即為擴增曲線,在進行PCR反應過程中,通過檢測系統(tǒng)對PCR管內的樣品進行實時檢測,最后將熒光信號值通過成像技術顯現(xiàn)在電腦上.正常的擴增曲線包括四個階段：基線期,指數(shù)增長期,線性增長期,平臺期.擴增曲線可以粗略地判斷擴增效率。SYBR Green的雙delta Ct法要求目的基因和內參的擴增效率基本一致。如果不一致，需要對公式進行修正，部分qPCR儀的配套軟件可以做到，直接輸入每對引物的擴增效率。但無論如何，保證高擴增效率是實驗成功的關鍵。如果擴增效率一致，不同Ct的曲線顯示出來就基本是平行的位移，其傾斜程度基本一致。而如下圖一樣，一條比較“陡”，另一條比較“平”，那么意味著擴增效率不一致。有可能