基因克隆及蛋白表達(dá)

1、基因克隆及蛋白表達(dá) 研究某一目的基因功能一般策略 第一部分PCR 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù) 一、PCRPCR實(shí)驗(yàn)原理 一、PCRPCR實(shí)驗(yàn)原理 二、PCRPCR的反應(yīng)體系 二、PCRPCR的反應(yīng)體系 二、PCRPCR的反應(yīng)體系 Taq DNA polymerase 5 53 3 5 3 3 5 Pyrobest & pfu DNA Polymerase PCR的反應(yīng)體系 4dNTP: 50-200 umol/L 5. 模板DNA （1） 單鏈DNA （2） 雙鏈DNA （3） 濃度：基因組DNA：1ug 質(zhì)粒DNA：10ng 三、基本操作步驟 1.1.:95:95高溫下, ,雙螺旋氫鍵斷 裂

2、, ,雙鏈DNADNA解鏈成為單鏈DNADNA 2.2.: :兩條引物與模板DNADNA擴(kuò)增區(qū) 域的兩端按堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合. . 3.3.: :在4 4種dNTPdNTP底物及Mg2+存在 條件下,Taq DNA聚合酶在72下, , 將單核 苷酸按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則從引物3 3 端摻 入,使引物沿5 5 3 3 方向延伸合成新股 DNADNA 四、條件優(yōu)化 PCR反應(yīng)液 25l PCR反應(yīng)條件 94 5min 94 30sec 55 30sec 30 Cycles 72 1min 72 10min 4 forever 五、PCR引物的設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)的基本原則 引物設(shè)計(jì)的基本原則 引物設(shè)計(jì)的基本原

3、則 引物設(shè)計(jì)的基本原則 引物設(shè)計(jì)的基本原則 引物設(shè)計(jì)的基本原則 引物設(shè)計(jì)的基本原則 第二部分RT-PCR RT-PCR cDNA合成 Superscript first-strand synthesis system for RT-PCR 是從總RNA或mRNA合成cDNA。 RNA量為1ng5ug。 Reverse Transcriptase 5 53 3 5 3 3 5 Reverse Transcriptase RNA D N A D N A RT-PCR 用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（RNase H-） 進(jìn)行cDNA第一鏈的合成 用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（RNase H-） 進(jìn)行cDNA第一鏈

4、的合成 cDNA第一鏈的合成有三個(gè)方法 cDNA第一鏈的合成有三個(gè)方法 （2）oligo（dT）：較特異和常見(jiàn)的方法, 其cDNA的合成數(shù)量和復(fù)雜性大大低于random hexamers方法,尤其是進(jìn)行新的mRNA RT- PCR時(shí),建議用此方法. cDNA第一鏈的合成有三個(gè)方法 cDNAcDNA第一條鏈合成步驟 第三部分克隆 PCR片段回收 T-A克隆 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 T-Vector 進(jìn)行藍(lán)白篩選，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增 進(jìn)行藍(lán)白篩選，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增 進(jìn)行藍(lán)白篩選，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增 雙鏈pGEM-T質(zhì)粒，有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)氨芐青 霉素抗性基因和一個(gè)多克隆位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)

5、處于 表達(dá)LacZ基因產(chǎn)物-半乳糖苷酶的氨基端片段。 用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LacZ基因突變的大腸桿菌株（JM109 或DH5）時(shí)，因?yàn)橛少|(zhì)粒表達(dá)的-肽補(bǔ)充了大腸 桿菌缺失的-肽，所以恢復(fù)了分解半乳糖的能力。 進(jìn)行藍(lán)白篩選，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增 第四部分：外源基因的原核表達(dá) 外源基因的原核表達(dá) 一、原核表達(dá)系統(tǒng)常用的載體及 其應(yīng)用 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌載體的表達(dá)方式 大腸桿菌載體的表達(dá)方式 大腸桿菌載體的表達(dá)方式 大腸桿菌載體的表達(dá)方式 擴(kuò)增陽(yáng)性克隆并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá) SDS-PAGE電泳 Western Blot GST-Pro-B GST Northern印跡雜交 Northern印跡雜交 Northern印跡雜交 Northern印跡雜交 Northern印跡雜交 一、DNA探針標(biāo)記 Northern