細(xì)菌感染的實驗室診斷

1、精品課件 第三章第三章 細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷 精品課件 第一節(jié)第一節(jié) 標(biāo)本的采集和處理原則標(biāo)本的采集和處理原則 一、標(biāo)本采集的一般原則一、標(biāo)本采集的一般原則 1.早期采集早期采集 2.無菌采集無菌采集 n無菌部位無菌部位:嚴(yán)格無菌操作嚴(yán)格無菌操作 n有正常菌群部位：明確目的菌；選擇合適的有正常菌群部位：明確目的菌；選擇合適的 選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基 精品課件 3.采用不同方法采集采用不同方法采集 n需氧菌或兼性厭氧菌需氧菌或兼性厭氧菌 n厭氧菌：穿刺法采集厭氧菌：穿刺法采集 4.采集適量標(biāo)本和適當(dāng)標(biāo)本采集適量標(biāo)本和適當(dāng)標(biāo)本 n采集有明顯病變的標(biāo)本采集有明顯病變的標(biāo)本 n根據(jù)病

2、程采集不同的臨床標(biāo)本根據(jù)病程采集不同的臨床標(biāo)本 5.安全采集安全采集 精品課件 二、標(biāo)本的處理二、標(biāo)本的處理 1.及時送檢及時送檢 2.運送與保存運送與保存 1）根據(jù)待檢菌特點對標(biāo)本進(jìn)行冷藏、保）根據(jù)待檢菌特點對標(biāo)本進(jìn)行冷藏、保 溫或保持厭氧狀態(tài)溫或保持厭氧狀態(tài) 2）注意安全防護(hù)）注意安全防護(hù) 精品課件 第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查 顯微鏡種類顯微鏡種類 1.普通光學(xué)顯微鏡（普通光學(xué)顯微鏡（light microscope） 光源：可見光光源：可見光 2. 暗視野顯微鏡（暗視野顯微鏡（ darkfield microscope ） 暗背景，菌體發(fā)光暗背景，菌體發(fā)光 n用于檢查不染

3、色的活細(xì)菌和螺旋體的形態(tài)及運用于檢查不染色的活細(xì)菌和螺旋體的形態(tài)及運 動觀察動觀察 精品課件 3. 相差顯微鏡相差顯微鏡 n檢查不染色活細(xì)菌的形態(tài)及某些內(nèi)部結(jié)構(gòu)檢查不染色活細(xì)菌的形態(tài)及某些內(nèi)部結(jié)構(gòu) 4. 熒光顯微鏡熒光顯微鏡 光源：光源：100W200W的高壓汞燈的高壓汞燈 5. 電子顯微鏡電子顯微鏡 光源：電子流光源：電子流 n透射電鏡透射電鏡：觀察細(xì)菌內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)：觀察細(xì)菌內(nèi)部超微結(jié)構(gòu) n掃描電鏡掃描電鏡：對細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)及附件觀察：對細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)及附件觀察 精品課件 精品課件 一、一、 不染色標(biāo)本的檢查不染色標(biāo)本的檢查 n常用方法常用方法 n壓滴法壓滴法 n懸滴法懸滴法 n毛吸管法毛吸管法

4、 用于檢查厭氧菌動力用于檢查厭氧菌動力 n用途用途 n動力試驗動力試驗檢查細(xì)菌有無動力檢查細(xì)菌有無動力 n制動試驗制動試驗鑒定血清型鑒定血清型 精品課件 三、三、 染色標(biāo)本的檢查染色標(biāo)本的檢查 （一）常用染料（一）常用染料 色基：決定染料的顏色色基：決定染料的顏色 助色基：決定染料的酸堿性助色基：決定染料的酸堿性 1. 堿性染料堿性染料 n電離后色基帶正電荷電離后色基帶正電荷 n細(xì)菌染色常用，如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等細(xì)菌染色常用，如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等 2. 酸性染料酸性染料 n用于細(xì)胞漿染色，如伊紅、酸性復(fù)紅、剛果紅用于細(xì)胞漿染色，如伊紅、酸性復(fù)紅、剛果紅 精品課件 3. 復(fù)合染料（中

5、性染料）復(fù)合染料（中性染料） n堿性染料與酸性染料的復(fù)合物，如瑞氏染料、堿性染料與酸性染料的復(fù)合物，如瑞氏染料、 姬姆薩染料等姬姆薩染料等 4. 單純?nèi)玖蠁渭內(nèi)玖?n如蘇丹染料，溶于脂肪溶劑，不溶于水，化如蘇丹染料，溶于脂肪溶劑，不溶于水，化 學(xué)親和力低學(xué)親和力低 精品課件 （二）常用的細(xì)菌染色法（二）常用的細(xì)菌染色法 n單染色法單染色法 只用一種染料，如呂氏美藍(lán)只用一種染料，如呂氏美藍(lán) n復(fù)染色法復(fù)染色法 用兩種或兩種以上不同顏色的染料用兩種或兩種以上不同顏色的染料 精品課件 細(xì)菌染色的一般程序細(xì)菌染色的一般程序 1. 涂片涂片 2. 干燥干燥：自然干燥為好：自然干燥為好 3. 固定固定 4

6、. 初染初染 5. 媒染媒染 媒染劑媒染劑 6. 脫色脫色 脫色劑脫色劑 7. 復(fù)染復(fù)染 精品課件 1. 革蘭染色法（革蘭染色法（Gram stainGram stain） （1 1）原理原理 1 1）細(xì)胞壁學(xué)說：兩種細(xì)菌細(xì)胞壁通透性不同）細(xì)胞壁學(xué)說：兩種細(xì)菌細(xì)胞壁通透性不同 2 2）等電點學(xué)說）等電點學(xué)說 3 3）化學(xué)學(xué)說：兩種細(xì)菌含有）化學(xué)學(xué)說：兩種細(xì)菌含有RNARNA鎂鹽不同鎂鹽不同 （2 2）方法方法：制片：制片結(jié)晶紫初染結(jié)晶紫初染碘液媒染碘液媒染 酒精脫色酒精脫色復(fù)紅復(fù)染復(fù)紅復(fù)染結(jié)果結(jié)果 革蘭陽性菌革蘭陽性菌G G ：紫色 ：紫色 革蘭陰性菌革蘭陰性菌G G ：紅色 ：紅色 精品課件

7、 精品課件 （3）影響染色結(jié)果的因素影響染色結(jié)果的因素 1）操作技術(shù)：涂片和脫色）操作技術(shù)：涂片和脫色 2）染色液：）染色液： 3）細(xì)菌：）細(xì)菌：1824h培養(yǎng)物為好培養(yǎng)物為好 （4）意義意義: 1）鑒別細(xì)菌）鑒別細(xì)菌 2）選擇藥物）選擇藥物 3）與致病性有關(guān)）與致病性有關(guān) 精品課件 2. 抗酸染色法抗酸染色法 細(xì)菌著色后不被鹽酸酒精脫色的染色方法細(xì)菌著色后不被鹽酸酒精脫色的染色方法 染料染料：石炭酸復(fù)紅、鹽酸酒精、美藍(lán)：石炭酸復(fù)紅、鹽酸酒精、美藍(lán) 方法方法 初染：初染：5%石炭酸復(fù)紅加熱染色石炭酸復(fù)紅加熱染色5min 脫色：脫色：3%鹽酸酒精鹽酸酒精 復(fù)染：呂氏美藍(lán)復(fù)染：呂氏美藍(lán) 精品課件

8、精品課件 3.熒光染色熒光染色 金胺金胺O法法 4.特殊染色法特殊染色法 n細(xì)胞壁染色、莢膜染色、芽胞染色、細(xì)胞壁染色、莢膜染色、芽胞染色、 鞭毛染色、鞭毛染色、 異染顆粒染色異染顆粒染色 5.負(fù)染法負(fù)染法 背景著色背景著色 精品課件 肺炎鏈球菌莢膜染色肺炎鏈球菌莢膜染色 墨汁負(fù)染法墨汁負(fù)染法 芽胞染色芽胞染色 精品課件 精品課件 第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定 一、培養(yǎng)基的種類和選擇一、培養(yǎng)基的種類和選擇 培養(yǎng)基培養(yǎng)基（culture mediumculture medium） 由人工方法配制而成的，專供微生物由人工方法配制而成的，專供微生物 生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品

9、。生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。 精品課件 （一）培養(yǎng)基的組成成分（一）培養(yǎng)基的組成成分 1. 營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì) 碳源、氮源、無機鹽、水、生長因子碳源、氮源、無機鹽、水、生長因子 （1）蛋白胨蛋白胨 提供氮源提供氮源 植物胨植物胨: 大豆大豆 動物胨：牛肉、動物組織等動物胨：牛肉、動物組織等 （2）肉浸液肉浸液 碳源、氮源碳源、氮源 （3）牛肉膏牛肉膏 氮源氮源 （4）糖（醇）類糖（醇）類 碳源和能源碳源和能源 精品課件 （5）血液血液 提供特殊生長因子、觀察溶血提供特殊生長因子、觀察溶血 （6）無機鹽類無機鹽類 常用元素常用元素：P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe等等 微量元素微量元素：Co

10、、Zn、Mn、Cu、Mu等等 （7）雞蛋與動物血清雞蛋與動物血清 用于某些特殊培養(yǎng)基用于某些特殊培養(yǎng)基 （8）生長因子生長因子 維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等 精品課件 2.凝固物質(zhì)凝固物質(zhì) 即賦形劑即賦形劑 （1）瓊脂瓊脂 （2）明膠明膠 動物膠原組織熬制而成動物膠原組織熬制而成 3. 抑制劑和指示劑抑制劑和指示劑 （1）抑制劑：膽鹽、煌綠、染料、抗生素等）抑制劑：膽鹽、煌綠、染料、抗生素等 選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：加入一定種類的抑制劑，以抑：加入一定種類的抑制劑，以抑 制雜菌生長或減少生長，有利于檢出菌生長制雜菌生長或減少生長，有利于檢出菌生長 的培養(yǎng)基。的培養(yǎng)基。

11、 （2）指示劑：）指示劑： 酚紅、中性紅、中國藍(lán)等酚紅、中性紅、中國藍(lán)等 鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基：加入特定底物和指示劑：加入特定底物和指示劑 精品課件 （二）培養(yǎng)基的種類（二）培養(yǎng)基的種類 1.按培養(yǎng)基的物理性狀按培養(yǎng)基的物理性狀 （1）液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：增菌增菌 （2）固體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基：純化，增菌純化，增菌 （3） 半固體培養(yǎng)基：半固體培養(yǎng)基：動力檢測，保種動力檢測，保種 精品課件 精品課件 2. 按營養(yǎng)成分和用途分類按營養(yǎng)成分和用途分類 （1）基礎(chǔ)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：只有基本營養(yǎng)成分培養(yǎng)基：只有基本營養(yǎng)成分 （2）營養(yǎng)營養(yǎng)培養(yǎng)基：加有血液培養(yǎng)基：加有血液 、血清等、血清等 （3）鑒別鑒別

12、培養(yǎng)基：含有特定底物和指示劑培養(yǎng)基：含有特定底物和指示劑 （4）選擇選擇培養(yǎng)基：含有抑制劑培養(yǎng)基：含有抑制劑 （5）特殊特殊培養(yǎng)基：厭氧、細(xì)菌培養(yǎng)基：厭氧、細(xì)菌L型型 精品課件 （三）培養(yǎng)基的選擇（三）培養(yǎng)基的選擇 1.血平板血平板 最常用最常用 2.巧克力血平板巧克力血平板 奈瑟菌屬、流感嗜血桿菌奈瑟菌屬、流感嗜血桿菌 3.腸道選擇培養(yǎng)基腸道選擇培養(yǎng)基 分離腸道細(xì)菌分離腸道細(xì)菌 常用中國藍(lán)、常用中國藍(lán)、EMB、MAC、SS 4.堿性瓊脂或堿性瓊脂或TCBS 分離霍亂弧菌分離霍亂弧菌 5.血液增菌培養(yǎng)基血液增菌培養(yǎng)基 血液、骨髓增菌用血液、骨髓增菌用 6.營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)肉湯 增菌用增菌用 精品課

13、件 （四）培養(yǎng)基的制備（四）培養(yǎng)基的制備 1. 常用各種器具滅菌前的準(zhǔn)備常用各種器具滅菌前的準(zhǔn)備 （1）培養(yǎng)皿：用紙包裹）培養(yǎng)皿：用紙包裹 （2）試管：加塞后用紙包好）試管：加塞后用紙包好 （3）吸管和毛細(xì)管）吸管和毛細(xì)管 （4）燒瓶）燒瓶 精品課件 2. 培養(yǎng)基制備的一般程序培養(yǎng)基制備的一般程序 （1）調(diào)配調(diào)配 根據(jù)培養(yǎng)基組成，準(zhǔn)確稱取各組分，先加需要蒸根據(jù)培養(yǎng)基組成，準(zhǔn)確稱取各組分，先加需要蒸 餾水的一部分，再加培養(yǎng)基干粉，最后補足水量。餾水的一部分，再加培養(yǎng)基干粉，最后補足水量。 （2）溶化溶化 液體培養(yǎng)基不需加熱液體培養(yǎng)基不需加熱 （3）調(diào)整調(diào)整pH值值 一般一般7.27.6 （4）過

14、濾澄清過濾澄清（一般可以省略）（一般可以省略） n液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基： 濾紙濾紙 n固體培養(yǎng)基：固體培養(yǎng)基： 紗布紗布 精品課件 （5）分裝分裝 n平板：滅菌后冷卻至平板：滅菌后冷卻至50 60時傾倒時傾倒 90mm 2530ml（4mm）：）：藥敏用藥敏用 90mm 1315ml( (3mm) )：培養(yǎng)用培養(yǎng)用 n瓊脂斜面：分裝量為試管的瓊脂斜面：分裝量為試管的1/41/3，滅菌后，滅菌后 趁熱制成斜面，斜面長度趁熱制成斜面，斜面長度2/3 n高層、半固體、液體：分裝量為試管長度高層、半固體、液體：分裝量為試管長度 1/42/3 精品課件 （ 6）滅菌滅菌 n高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌 n

15、無糖：無糖：103.4kPa 121.31530min n含糖：含糖： 68.4kPa 115 15min n流動蒸汽滅菌法流動蒸汽滅菌法 血清、牛乳、雞蛋血清、牛乳、雞蛋 n間歇蒸汽滅菌法間歇蒸汽滅菌法 精品課件 （7）鑒定鑒定 n無菌試驗無菌試驗：將制好的培養(yǎng)基在：將制好的培養(yǎng)基在35孵育過孵育過 夜，判定是否滅菌合格。夜，判定是否滅菌合格。 n效果檢查效果檢查：按不同的培養(yǎng)要求，接種相應(yīng)菌：按不同的培養(yǎng)要求，接種相應(yīng)菌 種，觀察細(xì)菌的生長狀況，判斷培養(yǎng)基是否種，觀察細(xì)菌的生長狀況，判斷培養(yǎng)基是否 符合要求。符合要求。 （8）保存保存 4 冰箱保存，一周左右冰箱保存，一周左右 精品課件 注

16、意事項注意事項 1. 器皿器皿 中性硬質(zhì)玻璃器皿中性硬質(zhì)玻璃器皿 2. 化學(xué)藥品化學(xué)藥品 化學(xué)純以上化學(xué)純以上 3. 準(zhǔn)確稱量，正確溶解準(zhǔn)確稱量，正確溶解 4. 準(zhǔn)確測定培養(yǎng)基酸堿度準(zhǔn)確測定培養(yǎng)基酸堿度 5. 保持澄清保持澄清 6. 滅菌時間不宜過長，不宜反復(fù)滅菌滅菌時間不宜過長，不宜反復(fù)滅菌 精品課件 二、分離培養(yǎng)二、分離培養(yǎng) （一）細(xì)菌的分離（一）細(xì)菌的分離 1.無菌技術(shù)無菌技術(shù) 是防止微生物進(jìn)入物品和機體，同時防止是防止微生物進(jìn)入物品和機體，同時防止 被檢物中可能存在的病原微生物污染周圍被檢物中可能存在的病原微生物污染周圍 環(huán)境及工作人員的規(guī)范化操作技術(shù)。環(huán)境及工作人員的規(guī)范化操作技術(shù)。

17、 2.操作要點操作要點 左手左手負(fù)責(zé)持平皿、試管等物品負(fù)責(zé)持平皿、試管等物品 右手右手持接種工具取菌并劃種持接種工具取菌并劃種 精品課件 3.移種或接種的基本步驟移種或接種的基本步驟 （1）右手持接種工具，在火焰上燒灼滅菌。）右手持接種工具，在火焰上燒灼滅菌。 （2）左手拿起標(biāo)本盒或平皿、試管等。）左手拿起標(biāo)本盒或平皿、試管等。 （3） 用接種工具挑取適量標(biāo)本或細(xì)菌。用接種工具挑取適量標(biāo)本或細(xì)菌。 （4）根據(jù)目的選擇不同的接種方法）根據(jù)目的選擇不同的接種方法 （5） 接種完畢，在火焰上燒灼接種工具，放接種完畢，在火焰上燒灼接種工具，放 回原處?；卦?。 精品課件 4.常用的接種方法常用的接種方

18、法 （1）平板劃線法平板劃線法 n分區(qū)劃線法分區(qū)劃線法 用用于雜菌量較多的標(biāo)本于雜菌量較多的標(biāo)本 n連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法 用于雜菌不多的標(biāo)本用于雜菌不多的標(biāo)本 （2）瓊脂斜面接種法瓊脂斜面接種法純培養(yǎng)純培養(yǎng) （3）穿刺法穿刺法觀察細(xì)菌動力觀察細(xì)菌動力 （4）液體培養(yǎng)基接種法液體培養(yǎng)基接種法 增菌增菌 （5）傾注平板法傾注平板法計數(shù)細(xì)菌數(shù)量計數(shù)細(xì)菌數(shù)量 （6）涂布法涂布法 紙片法藥敏試驗紙片法藥敏試驗 精品課件 （二）細(xì)菌的培養(yǎng)方法（二）細(xì)菌的培養(yǎng)方法 1.需氧培養(yǎng)法需氧培養(yǎng)法 普通培養(yǎng)普通培養(yǎng) 2.二氧化碳培養(yǎng)二氧化碳培養(yǎng) （1）二氧化碳培養(yǎng)箱）二氧化碳培養(yǎng)箱 （2）燭缸法）燭缸法 （3）化學(xué)

19、法）化學(xué)法 3.厭氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng) 精品課件 （三）細(xì)菌的生長現(xiàn)象（三）細(xì)菌的生長現(xiàn)象 1.固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象 n菌落菌落：單個細(xì)菌在培養(yǎng)基上分裂繁殖成一堆：單個細(xì)菌在培養(yǎng)基上分裂繁殖成一堆 肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。 nCFU：菌落形成單位，活菌計數(shù)用：菌落形成單位，活菌計數(shù)用 n細(xì)菌菌落的描述細(xì)菌菌落的描述 大小、形狀、突起或扁平、大小、形狀、突起或扁平、 邊緣、顏色、表面、透明度邊緣、顏色、表面、透明度 精品課件 （1）光滑型菌落光滑型菌落（S型菌落）型菌落） 表面光滑、濕潤、邊緣整齊表面光滑、濕潤、邊緣整齊 （2）粗糙型菌落粗糙型菌落（R型菌落）型

20、菌落） 表面粗糙、干燥、邊緣不齊表面粗糙、干燥、邊緣不齊 （3）粘液型菌落粘液型菌落（M型菌落）型菌落） 菌落粘稠、有光澤、似水珠樣菌落粘稠、有光澤、似水珠樣 精品課件 卷發(fā)樣菌落卷發(fā)樣菌落 粗糙型菌落（粗糙型菌落（L-J） 粘液型菌落粘液型菌落 精品課件 2.液體培養(yǎng)基中的生長情況液體培養(yǎng)基中的生長情況 表面生長表面生長 均勻混濁生長均勻混濁生長 沉淀生長沉淀生長 精品課件 三、細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定三、細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定 （一）碳水化合物的代謝試驗（一）碳水化合物的代謝試驗 1. 糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗 n原理原理 各種細(xì)菌酶系不同，分解糖（醇、各種細(xì)菌酶系不同，分解糖（醇、

21、 苷）的能力各異，產(chǎn)物也不同。苷）的能力各異，產(chǎn)物也不同。 n培養(yǎng)基培養(yǎng)基 單糖、雙糖、三糖、多糖單糖、雙糖、三糖、多糖 n應(yīng)用應(yīng)用 腸道桿菌科細(xì)菌的鑒定腸道桿菌科細(xì)菌的鑒定 精品課件 精品課件 2. 葡萄糖氧化葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗（發(fā)酵試驗（O/F） n原理原理 氧化型氧化型 專性需氧菌專性需氧菌 發(fā)酵型發(fā)酵型 產(chǎn)堿型產(chǎn)堿型 不分解葡萄糖不分解葡萄糖 n培養(yǎng)基培養(yǎng)基 Hugh-Leifson二氏培養(yǎng)基二氏培養(yǎng)基 n結(jié)果結(jié)果 氧化管氧化管 發(fā)酵管發(fā)酵管 氧化型氧化型 變黃變黃 不變不變 發(fā)酵型發(fā)酵型 變黃變黃 變黃變黃 產(chǎn)堿型產(chǎn)堿型 不變不變 不變不變 （陰性）（陰性） 精品課件 n應(yīng)用應(yīng)用

22、鑒別腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌鑒別腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌 精品課件 3. -半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（ONPG ）試驗）試驗 n原理原理 ONPG無色，經(jīng)無色，經(jīng)-半乳糖苷酶水解后生半乳糖苷酶水解后生 成黃色的鄰硝基酚成黃色的鄰硝基酚 n方法方法 （1）在含）在含ONPG的培養(yǎng)基中接種純種細(xì)菌的培養(yǎng)基中接種純種細(xì)菌 （2）制成菌懸液，加入甲苯，再加）制成菌懸液，加入甲苯，再加ONPG試劑試劑 n結(jié)果結(jié)果 陽性：變黃（陽性：變黃（2030min） n應(yīng)用應(yīng)用 遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定 精品課件 4. 七葉苷水解試驗七葉苷水解試驗 n原理原理 葡萄糖葡萄糖 七葉苷七葉苷 七葉

23、素七葉素+Fe2+ 黑色化合物黑色化合物 n培養(yǎng)基培養(yǎng)基 七葉苷、膽汁七葉苷培養(yǎng)基七葉苷、膽汁七葉苷培養(yǎng)基 n結(jié)果結(jié)果 陽性：培養(yǎng)基變黑陽性：培養(yǎng)基變黑 n用途用途 鑒別腸球菌、鑒別腸球菌、G-桿菌及厭氧菌桿菌及厭氧菌 精品課件 5. 甲基紅甲基紅（methyl red MR）試驗試驗 n原理原理 葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇 甲基紅甲基紅 - - 葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸 各種酸各種酸 甲基紅甲基紅 + + n培養(yǎng)基培養(yǎng)基 葡萄糖蛋白胨水葡萄糖蛋白胨水 n結(jié)果結(jié)果 陽性：紅色陽性：紅色 陰性：黃色陰性：黃色 n應(yīng)用應(yīng)用 鑒別腸桿菌科細(xì)菌鑒別腸桿菌科細(xì)菌 精品課件 6. V

24、P（Voges-Proskauer）試驗試驗 n原理原理 葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇 二乙酰二乙酰 肌酸肌酸 萘酚萘酚紅色化合物紅色化合物 n培養(yǎng)基培養(yǎng)基 葡萄糖蛋白胨水葡萄糖蛋白胨水 n結(jié)果結(jié)果 陽性：紅色陽性：紅色 n應(yīng)用應(yīng)用 鑒別腸桿菌科細(xì)菌鑒別腸桿菌科細(xì)菌 精品課件 精品課件 （二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗 1.明膠液化試驗明膠液化試驗 n原理原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生明膠酶，分解明：某些細(xì)菌可產(chǎn)生明膠酶，分解明 膠，使其失去凝固能力。膠，使其失去凝固能力。 n方法方法：將待檢物接種于明膠培養(yǎng)基：將待檢物接種于明膠培養(yǎng)基22 培養(yǎng)培養(yǎng)7天天

25、 n結(jié)果結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性 n應(yīng)用應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌鑒別：腸桿菌科細(xì)菌鑒別 精品課件 2. 吲哚吲哚（indol）試驗試驗 n原理原理 色氨酸色氨酸吲哚吲哚玫瑰吲哚玫瑰吲哚 吲哚試劑（對二甲基氨基苯甲醛）吲哚試劑（對二甲基氨基苯甲醛） n培養(yǎng)基培養(yǎng)基 蛋白胨水培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基 n結(jié)果結(jié)果 陽性：紅色陽性：紅色 精品課件 3. 硫化氫試驗硫化氫試驗 n原理原理 含硫氨基酸含硫氨基酸 H H2 2S+S+硫酸亞鐵硫酸亞鐵FeSFeS黑色黑色 醋酸鉛醋酸鉛 PbS PbS黑色黑色 n培養(yǎng)基培養(yǎng)基 醋酸鉛培養(yǎng)基醋酸鉛培養(yǎng)基 n結(jié)果結(jié)果 陽性：黑色沉淀陽性：黑色沉淀

26、 n用途用途 腸桿菌科菌屬間的鑒定腸桿菌科菌屬間的鑒定 精品課件 精品課件 4. 尿素分解試驗?zāi)蛩胤纸庠囼?n原理原理 尿素尿素 NH3+CO2+H2O (NH4)2CO3 n培養(yǎng)基培養(yǎng)基 尿素肉湯或尿素瓊脂培養(yǎng)基尿素肉湯或尿素瓊脂培養(yǎng)基 n結(jié)果結(jié)果 陽性：紅色陽性：紅色 n用途用途 腸桿菌科中變形桿菌的鑒定腸桿菌科中變形桿菌的鑒定 精品課件 5. 苯丙氨酸脫氨酶試驗苯丙氨酸脫氨酶試驗 n原理原理 苯丙氨酸苯丙氨酸 苯丙酮酸苯丙酮酸+10%氯化鐵氯化鐵 綠色化合物綠色化合物 n培養(yǎng)基培養(yǎng)基 苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基 n結(jié)果結(jié)果 陽性：綠色陽性：綠色 n用途用途 腸桿菌科中變形桿菌的

27、鑒定腸桿菌科中變形桿菌的鑒定 精品課件 精品課件 6. 氨基酸脫羧酶試驗氨基酸脫羧酶試驗 n原理原理 氨基酸氨基酸 胺胺+ CO2 培養(yǎng)基變堿培養(yǎng)基變堿 n培養(yǎng)基培養(yǎng)基 氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照 n結(jié)果結(jié)果 陽性：紫色陽性：紫色 陰性：黃色陰性：黃色 n用途用途 腸桿菌科細(xì)菌鑒定腸桿菌科細(xì)菌鑒定 精品課件 （三）（三） 碳源和氮源利用試驗碳源和氮源利用試驗 1. 枸櫞酸鹽利用試驗枸櫞酸鹽利用試驗 n原理原理 銨鹽銨鹽 碳酸鈉碳酸鈉+氨氨 n培養(yǎng)基培養(yǎng)基 枸櫞酸鹽培養(yǎng)基枸櫞酸鹽培養(yǎng)基 n結(jié)果結(jié)果 陽性：藍(lán)色陽性：藍(lán)色 陰性：綠色陰性：綠色 2.丙二酸鹽利用試驗

28、丙二酸鹽利用試驗 精品課件 利用枸櫞酸鹽生長利用枸櫞酸鹽生長 + 不能利用不能利用 - 精品課件 IMViC試驗試驗 I - 吲哚吲哚（indol）試驗）試驗 M - 甲基紅甲基紅（methyl red）試驗）試驗 V - VP（Voges-Proskauer）試驗）試驗 C -枸櫞酸鹽利用枸櫞酸鹽利用（citrate utilization）試驗）試驗 精品課件 I M Vi C試驗試驗 大腸埃希菌大腸埃希菌 + + - - 產(chǎn)氣桿菌產(chǎn)氣桿菌 - - + + 精品課件 （四）（四） 各種酶類試驗各種酶類試驗 1. 氧化酶試驗氧化酶試驗 n原理原理 n方法方法 菌落法菌落法 濾紙法濾紙法 試劑

29、紙片法試劑紙片法 n結(jié)果結(jié)果 深紫色為陽性深紫色為陽性 精品課件 2. 過氧化氫酶試驗過氧化氫酶試驗 3. 硝酸鹽還原試驗硝酸鹽還原試驗 4. 脂酶試驗脂酶試驗 5. 卵磷脂酶試驗卵磷脂酶試驗 6. DNA酶試驗酶試驗 7. 凝固酶試驗?zāi)堂冈囼?8.CAMP試驗試驗 9. 膽汁溶菌試驗?zāi)懼芫囼?精品課件 （五）抑菌試驗（五）抑菌試驗 1.O/129試驗試驗 n用于弧菌科的屬間鑒別用于弧菌科的屬間鑒別 2.桿菌肽試驗桿菌肽試驗 n用于用于A群鏈球菌與其他鏈球菌間的鑒別群鏈球菌與其他鏈球菌間的鑒別 3.奧普托欣試驗奧普托欣試驗 n用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒

30、別 精品課件 第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法 一、一、免疫學(xué)檢測免疫學(xué)檢測 利用抗原、抗體特異性結(jié)合的原理，用已利用抗原、抗體特異性結(jié)合的原理，用已 知抗原檢測未知抗體，或用已知抗體檢測知抗原檢測未知抗體，或用已知抗體檢測 未知抗原。未知抗原。 精品課件 （一）抗原檢測（一）抗原檢測 1. 凝集反應(yīng)凝集反應(yīng) n直接凝集、間接凝集、直接凝集、間接凝集、SPA協(xié)同凝集試驗協(xié)同凝集試驗 2.免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) n用熒光標(biāo)記抗體，顯微鏡觀測結(jié)果用熒光標(biāo)記抗體，顯微鏡觀測結(jié)果 3.酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù) n用酶標(biāo)記抗體，根據(jù)顏色變化判斷結(jié)果用酶標(biāo)記抗體，根據(jù)顏色變

31、化判斷結(jié)果 精品課件 反向間接血凝試驗反向間接血凝試驗 精品課件 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù) 1.直接法：直接法：熒光素標(biāo)記抗體熒光素標(biāo)記抗體 2.間接法間接法：熒光素標(biāo)記二抗（抗抗體）：熒光素標(biāo)記二抗（抗抗體） 3.免疫熒光免疫熒光 菌球法菌球法 精品課件 酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗-ELISA 1. 雙抗體夾心法雙抗體夾心法 2. 競爭法競爭法 陽性陽性-無色無色 精品課件 （二）抗體檢測（二）抗體檢測 n用已知的細(xì)菌或其特異性抗原檢測病人用已知的細(xì)菌或其特異性抗原檢測病人 血清中有無相應(yīng)抗體及其效價的動態(tài)變血清中有無相應(yīng)抗體及其效價的動態(tài)變 化，輔助診斷某些傳染病?；o助診斷某些傳

32、染病。 精品課件 二、分子生物學(xué)檢測二、分子生物學(xué)檢測 （一）核酸雜交（一）核酸雜交 n來自兩個不同個體的單鏈來自兩個不同個體的單鏈DNA 相互結(jié)合成互補的相互結(jié)合成互補的 DNA雙鏈的過程雙鏈的過程 （二）聚合酶鏈反應(yīng)（二）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） n是一項簡便、快速的特異性是一項簡便、快速的特異性DNA體外擴增技術(shù)體外擴增技術(shù) （三）生物芯片技術(shù)（三）生物芯片技術(shù) n常用的芯片：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片常用的芯片：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片 精品課件 三、細(xì)菌毒素的檢測三、細(xì)菌毒素的檢測 （一）內(nèi)毒素（一）內(nèi)毒素 1.內(nèi)毒素的致熱作用（體內(nèi)實驗）內(nèi)毒素的致熱作用（體內(nèi)實驗） n原理原理：內(nèi)毒素產(chǎn)生于：

33、內(nèi)毒素產(chǎn)生于G-菌，菌體死亡后菌，菌體死亡后 釋放，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱。釋放，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱。 n方法方法： （1）將家兔分成兩組，每組）將家兔分成兩組，每組4只，測量基只，測量基 礎(chǔ)體溫并記錄。礎(chǔ)體溫并記錄。 精品課件 （2）用無菌注射器抽取待檢物注入一組）用無菌注射器抽取待檢物注入一組 家家 兔耳靜脈，另一組注射等量生理鹽水。兔耳靜脈，另一組注射等量生理鹽水。 （3）觀察動物反應(yīng)，并間隔）觀察動物反應(yīng)，并間隔30min測量測量 兩組家兔體溫。兩組家兔體溫。 n結(jié)果結(jié)果 ：陽性陽性 試驗組體溫升高試驗組體溫升高 對照組體溫正常對照組體溫正常 n應(yīng)用應(yīng)用：無菌的生物制品

34、：無菌的生物制品 精品課件 2.鱟試驗（體外實驗）鱟試驗（體外實驗） 原理原理：鱟血液中含有一種變形細(xì)胞，此細(xì)：鱟血液中含有一種變形細(xì)胞，此細(xì) 胞裂解物可與微量內(nèi)毒素起凝膠反應(yīng)，即胞裂解物可與微量內(nèi)毒素起凝膠反應(yīng)，即 細(xì)胞裂解物中的一種酶被激活，使細(xì)胞裂細(xì)胞裂解物中的一種酶被激活，使細(xì)胞裂 解物中的蛋白質(zhì)形成凝膠。解物中的蛋白質(zhì)形成凝膠。 鱟試劑鱟試劑：鱟變形細(xì)胞裂解物：鱟變形細(xì)胞裂解物 精品課件 精品課件 n方法方法 （1）打開）打開3支鱟試劑安瓶，各加支鱟試劑安瓶，各加0.1ml無菌無菌 蒸餾水使之溶解，同時編號。蒸餾水使之溶解，同時編號。 （2）向）向3支安瓶中分別加待測物、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)支安瓶中分別加待測物、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi) 毒素、無熱原生理鹽水各毒素、無熱原生理鹽水各0.1ml。 （3）輕輕搖勻，垂直放）輕輕搖勻，垂直放37 水浴，水浴， 1530min后觀察結(jié)果。后觀察結(jié)果。 鱟試驗鱟試驗 精品課件 n結(jié)果結(jié)果 - 不形成凝膠不形成凝膠 + 形成凝膠，但不牢固形成凝膠，但不牢固 + 形成牢固凝膠，倒持安瓶凝膠不動。形成牢固凝膠，倒持安瓶凝膠不動。 n應(yīng)用應(yīng)用 鱟試驗鱟試驗 精品課件 （二）外毒素（二）外毒素 1.體內(nèi)毒力試驗體內(nèi)毒力試驗 n原