(完整word版)紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量_百度文庫(精)

1、教材 1 紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的原理 ;掌握紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù) ;掌握 TU-1901 紫外-可見分光光度計(jì)的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。二、實(shí)驗(yàn)原理紫外-可見吸收光譜法又稱紫外-可見分光光度法，它是研究分子吸收190nm750nm 波長范圍內(nèi)的吸收光譜，是以溶液中物質(zhì)分子對(duì)光的選擇性吸收為基礎(chǔ)而 建立起來的一類分析方法。紫外 -可見吸收光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價(jià)電子躍 遷的結(jié)果，其吸收光譜為分子光譜，是帶光譜。進(jìn)行定性:利用紫外-可見吸收光譜法進(jìn)行定性分析一般采用光譜比較法。即將 未知純化合物的吸收光譜特征，如吸收

2、峰的數(shù)目、位置、相對(duì)強(qiáng)度以及吸收峰的形 狀與已知純化合物的吸收光譜進(jìn)行比較。定量分析: 紫外-可見吸收光譜法進(jìn)行定量分析的依據(jù)是朗伯 -比爾定律：A=lgl0/l= & be當(dāng)入射光波長 入及光程b 一定時(shí)，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的 吸光度 A 與該物質(zhì)的濃度 c 成正比，即物質(zhì)在一定波長處的吸光度與它的濃度成 線形關(guān)系。因此，通過測定溶液對(duì)一定波長入射光的吸光度，就可求出溶液中物質(zhì) 濃度和含量。由于最大吸收波長入ma處的摩爾吸收系數(shù)最大，通常都是測量 入maX勺吸光度，以獲得最大靈敏度。光度分析時(shí)，分別將空白溶液和待測溶液裝入厚度為 b 的兩個(gè)吸收池中，讓一 束一定波長的平行單色光非別照

3、射空白和待測溶液，以通過空白溶液的透光強(qiáng)度為 I 0，通過待測溶液的透光強(qiáng)度為I，根據(jù)上式，由儀器直接給出I 0與I之比的對(duì) 數(shù)值即吸光度。紫外-可見分光光度計(jì)：紫外-可見吸收光譜法所采用的儀器稱為分光光度計(jì)，它 的主要部件有五個(gè)部分組成，即T單色吸收也U 檢測器|信號(hào)顯示器由光源發(fā)出的復(fù)合光經(jīng)過單色器分光后即可獲得任一所需波長的平行單色光該單色光通過樣品池靜樣品溶液吸收后，通過光照到光電管或光電倍增管等檢測器 上產(chǎn)生光電流，產(chǎn)生的光電流由信號(hào)顯示器直接讀出吸光度A?？梢姽鈪^(qū)采用鎢燈光源、玻璃吸收池；紫外光區(qū)采用氘燈光源、石英吸收池。本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨

4、酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其最大吸收峰位于280nm附近（不同的蛋白質(zhì)吸收波長略有差別）。在最大吸收波長處，吸光度與蛋白 質(zhì)溶液的濃度的關(guān)系服從朗伯-比耳定律。該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性， 且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定等優(yōu)點(diǎn)特點(diǎn)：帶光譜分子光譜應(yīng)用：定性分析-最大吸收波長定量分析-朗伯-比爾定律（標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法）根據(jù)朗伯比耳定律：A= be,只要繪出以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫 坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出試液的吸光度，就可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對(duì)應(yīng)的濃度值，即未 知樣的含量。三、儀器與試劑TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)，比色

5、管，吸量管 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5.00 mg.mL-1溶液0.9% NaCI溶液，待測蛋白質(zhì)溶液四、實(shí)驗(yàn)步驟一準(zhǔn)備工作1. 啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動(dòng)工作站并初始化儀器。 2. 在工作界 面上選擇測量項(xiàng)目（光譜掃描，光度測量），本實(shí)驗(yàn)選擇光度測量，設(shè)置測量條件 （測量波長等）。3. 將空白放入測量池中，點(diǎn)擊 START 掃描空白，點(diǎn)擊 ZERO 校零。4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。二測量工作1. 吸收曲線的繪制 :用吸量管吸取 2mL5.00mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于 10mL 比色管中，用 0.9% NaCl溶液稀釋至刻 度，搖勻。用 1cm 石英比色皿，以 0.9% NaCl 溶液為參比，

6、在 190 nm400nm區(qū)間，測量吸光度。2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ：用吸量管分別吸取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 5.00 mg.mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶 液于5只10 mL比色管中，用0.9% NaCI溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCI溶液為參比，在280 nm處分別測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸 光度 A 278記錄所得讀數(shù)。 3. 樣品測定：取適量濃度的待測蛋白質(zhì)溶液 3 mL，按上述方法測定278 nm處的吸光度。平行測定三份五、數(shù)據(jù)處理:1. 以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制吸收曲線，找出最大吸收波長由吸收曲線可得最大吸收波長 入max=278nmf

7、圖略2. 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C(mg/mL)吸光度A0, 250. in0.500 3350 . 750.4821. 000.657h 250,796標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度CWroL)吸光度A0, 250, 1710. 500, 3350. 750. 482L 00；0. 6371. 25仇796吸光度A0.200.400.600.801.001.201.40標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C(mg/mL濃度C-吸光度A標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是：A=0.6208*C+0.0186曲線擬合優(yōu)度：R=0.99983.根據(jù)樣品蛋白質(zhì)溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度。平行測定次數(shù)樣品液吸光度A樣品溶液濃度C (mg/mL)1676145920” 6721.05330. 6741. 056所測溶液平均濃度：C=(C1+C2+C3/3=1.056 mg/mL測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差：S=V2 (XbX /(n 1=0.003相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：R S D =S /=0.284% X待測蛋白質(zhì)溶液濃度為：1.056 mg/mL*10mL/3mL=3.520 mg/mL六、思考題:紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？受哪些因素的影響和限制？ 優(yōu)點(diǎn)：該測定法具有簡單靈敏快速高選擇性，且穩(wěn)定性好，干擾易消除不消 耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)：儀器昂貴，