柏樹內(nèi)生真菌的分離與抑菌研究

1、柏樹內(nèi)生真菌的分離與抑菌研究 學院：生命科學學院 年級： 2004 級 專業(yè) : 制藥工程 -生物制藥 姓名： 學號： 指導教師： 目錄 摘要 i Abstract ii 1. 前言 1 1.1植物內(nèi)生真菌 1 1.1.1 內(nèi)生菌概念 1 1.1.2 植物內(nèi)生真菌 1 1.2植物內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀及應用 2 1.2.1 抗腫瘤活性物質 2 1.2.2抗菌活性物質 2 1.2.3產(chǎn)酶的內(nèi)生菌 3 1.2.4抗蟲抑菌類物質 3 1.2.5植物生長調(diào)節(jié)物質 3 1.2.6產(chǎn)香氣的內(nèi)生真菌 4 1.2.7生物防治 4 1.2.8其他作用 4 1.3白蟻及白蟻的危害 4 1.3.1 白蟻 4 1.3.2

2、白蟻的危害 5 1.4白蟻的防治 7 1.4.1 物理防治法 7 1.4.2化學防治法 7 1.4.3生物防治法 8 1.5本試驗研究的目的及意義 8 2. 材料與方法 10 2.1材料及設備 10 2.1.1分離內(nèi)生菌所用樹木及指示菌 10 2.2.2 培養(yǎng)基 10 10 2.2.3 主要儀器設備 2.2試驗方法 11 2.2.1內(nèi)生真菌的分離 11 222 內(nèi)生真菌的純化 11 223 搖瓶培養(yǎng) 12 2.2.4牛津杯法抑菌實驗 12 3. 結果與分析 14 3.1柏樹木內(nèi)生真菌的分離 14 3.2活性篩選結果 14 4. 討論 18 5. 結論 19 參考文獻 20 附錄 22 23 致

3、謝 摘要 植物內(nèi)生真菌作為生活在植物組織內(nèi)部的一大類微生物，在其生活史的一定階段或全過程中對 宿主不表現(xiàn)出明顯病癥。在長期共同進化過程中，植物內(nèi)生菌與宿主植物之間形成了一種共生 關系。 香柏和羅森繪具有天然的抗白蟻特性，按照基因可互相傳遞的原則推測，香柏的內(nèi)生菌可以產(chǎn) 生對白蟻有抑制作用的活性物質。因此本實驗旨在從具有天然抗白蟻樹木的樹枝、樹皮中分離 出能抗白蟻的內(nèi)生真菌。利用白蟻體內(nèi)共生菌作指示菌，采用牛津杯法做抑菌試驗，得到抑菌 功能效果好的菌株 HDF-I-217 和 HDF-I-232 。下一步將對該兩株菌進行鑒定，提取其代謝產(chǎn)物 用于防治白蟻，這將具有極大的開發(fā)利用價值。 關鍵詞 內(nèi)

4、生真菌；白蟻；分離 Abstract As a big group of microbe inhabiting in the tissues of living plants, the endophytic fungi have no signifieantly negative effects on the host plants during their whole life history or some phases. During the long process of the common evolution, a symbiosis system formed between e

5、ndophytes and host. Port-orford-cedar and eastern red cedar have the natural character of anti-termite. According to the principle of the genes mutually transmitting between the plant and the endophytes, it is supposed that the endophyte from Port-orford-cedar can produce active compound which has i

6、nhibition for termite. So the research separates the endophytic fungi from the branch and the pill of the natural anti-termite trees. We obtained the dominance endophytes named HDF-I-217 and HDF-I-232 by the cylinder plate method in the microbiostatic experiment, they can inhibit the microbes which

7、live in the termite gut. The next step we will identify the two fungi and extract metabolites for preventing and controlling termite, which will have a great development of value. Key words endophytic fungi; termite; isolation 1. 前 1.1 植物內(nèi)生真菌 1.1.1 內(nèi)生菌概念 對內(nèi)生菌的定義認識是不斷發(fā)展的。 首先由De Bary提出，內(nèi)生菌是指生活在植物 組織內(nèi)的

8、微生物，以區(qū)分那些生活在植物表面的表生菌（Epiphyte）；后來Carroll將內(nèi)生 菌定義為生活在地上部分、 活的植物組織內(nèi)并不引起明顯病害癥狀的真菌， 突出強調(diào)內(nèi) 生菌與植物的互惠共生關系，因此，這個內(nèi)生菌概念不包含植物致病菌和菌根菌 1。 目前，內(nèi)生菌概念是由Stone等提出的，是指那些在其生活史的一定階段或全部階 段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌或細菌， 被感染的宿主植物 （至少暫時 ） 不表現(xiàn)出外在病癥， 可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組 織內(nèi)直接擴增出微生物DNA勺方法來注明其內(nèi)生2。也就是說我們可以把植物內(nèi)生菌理 解為生活于植物組織內(nèi)的正常菌

9、群， 不僅包括互惠共利的內(nèi)共生微生物， 也包括潛伏在 宿主植物體內(nèi)的病原菌 3。 1.1.2 植物內(nèi)生真菌 植物內(nèi)生菌主要有細菌、真菌和放線菌。內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）是指那些在其 生活史中的某一段時期生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌。 近年來的研究表明， 內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物。 植物與內(nèi)生真菌 呈互利共生的關系：一方面，植物為內(nèi)生真菌提供光合產(chǎn)物和礦物質；另一方面，內(nèi)生 真菌產(chǎn)生的代謝物， 或能刺激植物的生長發(fā)育， 或能提高宿主植物對生物脅迫或非生物 脅迫的抵抗能力。 這些代謝物中的一部分， 正是應用前景廣闊的新型生物活性物質，

10、 有 很高的開發(fā)利用價值 4。 1.2 植物內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀及應用 內(nèi)生真菌廣泛存在于健康植物組織內(nèi)部， 是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。 內(nèi)生 真菌產(chǎn)生的各種活性物質， 在生物制藥、 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、 工業(yè)發(fā)酵等方面都表現(xiàn)出美好的應 用前景，受到世界各國專家的廣泛關注。 利用內(nèi)生真菌發(fā)酵實現(xiàn)生物活性物質的工業(yè)化 生產(chǎn)，可以提高產(chǎn)量、降低產(chǎn)品成本，滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求；同時有利于珍稀、瀕 危藥用植物資源的保護，對減少野生藥用植物多樣性的破壞具有重要意義。 藥用植物具有豐富的物種多樣性， 是人類生存與發(fā)展的重要自然資源。 各種藥用植 物中蘊藏著非常豐富的內(nèi)生真菌。通過與藥用植物的“協(xié)同進化” ，某些

11、內(nèi)生真菌具有 了產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質的能力。 1.2.1 抗腫瘤活性物質 植物中極低的含量和植物資源的有限是人類規(guī)模利用這些化合物所面臨的主要困 難。這造就了從紅豆杉等植物中去尋找能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌。 從紅豆杉的內(nèi)生真菌 中不僅分離出了紫杉醇， 現(xiàn)已從紅豆杉及其近緣植物分離到了許多種產(chǎn)紫杉烷類化合物 的內(nèi)生菌。落羽松( Taxodium distchum) 、榧樹( Torreya grandifolia) 、銀杏( Ginkgo biloba) 、 禿柏(Toxodium distichum)以及一種松樹(Wollemia nobilis)中都分離到了能產(chǎn)生紫杉醇 的內(nèi)

12、生菌，這為紫杉醇的來源問題提供了很好的解決辦法 5 。 以中國倉鼠卵巢細胞 (CHO 細胞)株作為模型，對喜樹內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物進行 體外抗腫瘤活性試驗，結果表明從喜樹的樹皮和樹枝中均分離了能產(chǎn)生抑制 CHO 細胞 增殖活性的內(nèi)生真菌 6。郭智勇等7從三種紅樹林內(nèi)生真菌 Paecilomyces sp.( treel-7) ， 4557, ZZF65中分到九個環(huán)肽類的次級代謝產(chǎn)物，其中得到的環(huán)Pro-Leu具有強的抗癌 活性及特殊的抗菌活性而被稱為滅癌素。 1.2.2 抗菌活性物質 多種藥用植物本身具有抗菌消炎作用， 因此其內(nèi)生真菌也是篩選抗病原菌菌株的理 想途徑，已有多種藥用植物內(nèi)生真菌被

13、研究過抑菌活性。 從黃花夾竹桃分離到的內(nèi)生真 菌中有 17 株具有抑菌活性，其中一株木霉 (Trichoderm sp.) 抑菌活性最強，抗菌譜最廣 。Wagenaar等從薄荷的一株內(nèi)生真菌 Phomopsis Iongicolla的培養(yǎng)物中，分離提取出 一種新的抗生素 dicerandrols,它具有很強的殺菌作用。目前人們已知的抗生素遠不 能滿足需求， 植物內(nèi)生真菌是一個未開發(fā)的新領域， 它們所產(chǎn)生的抗生素活性成分往往 是新穎的。因此，開發(fā)植物內(nèi)真生菌為尋找新的抗生素提供了具有廣闊的前景。 1.2.3 產(chǎn)酶的內(nèi)生菌 近年來，關于內(nèi)生菌產(chǎn)酶的報道越來越多， 利用內(nèi)生菌產(chǎn)生的酶體系經(jīng)過篩選可用

14、 于有機合成、 新藥開發(fā)等領域， 是豐富天然產(chǎn)物的又一新途徑。 內(nèi)生真菌產(chǎn)生細胞壁分 解酶，用以克服宿主防御異物的天然屏障， 還能產(chǎn)生果膠酶、 纖維素酶、醋酶等胞外酶。 有些酶具有較高的商業(yè)應用價值。2001年Stamford等人發(fā)現(xiàn)從薯蕷屬蠶豆中分離出來 的內(nèi)生放射形擬諾卡菌可以產(chǎn)生耐熱性 a -淀粉酶；次年，又發(fā)現(xiàn)玉米葉中的內(nèi)生真菌 鏈抱子囊菌在pH8.0的淀粉-Czapek培養(yǎng)基上可以高效產(chǎn)生耐熱葡萄糖淀粉酶。 1.2.4 抗蟲抑菌類物質 內(nèi)生真菌可增強宿主對病蟲害的抵抗能力， 這是因為有的內(nèi)生真菌在宿主內(nèi)和純培 養(yǎng)中產(chǎn)生有毒物質， 如有機胺類， 麥角生物堿等。 這些內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物可

15、對植物致 病菌和有害昆蟲產(chǎn)生抗性。 國內(nèi)外關于內(nèi)生真菌在農(nóng)藥領域的研究與開發(fā)尚處于起步階 段，報道極少，因此值得深入研究與開發(fā)。 從藥用植物海金沙中篩選抗小麥赤霉菌、 番茄早疫霉菌、 番茄灰霉菌等植物病原真 菌的內(nèi)生真菌，并進行活性物質檢測。結果表明 80以上的內(nèi)生真菌對 3 種農(nóng)作物病 原真菌具有較強的抗菌活性 10。 從除蟲菊的根、莖、葉和花中分離出內(nèi)生真菌其發(fā)酵液 10倍稀釋液至少對供試的 番茄灰霉病菌、辣椒疫霉病菌、蘋果炭疽病菌、玉米大斑病菌( Exserohilum turcicum) 、 小麥紋枯病菌和小麥赤霉病菌等 6種病原菌中的一種抑菌活性達 75以上11 。 1.2.5 植物

16、生長調(diào)節(jié)物質 內(nèi)生真菌長期和宿主植物生活在一起， 對植物的生長發(fā)育具有很重要的作用。 內(nèi)生 真菌能產(chǎn)生促進植物生長的物質如植物生長素、 赤霉素以及細胞激動素等， 直接促進植 物生長。內(nèi)生真菌也能通過增強植物吸收 N、P 等營養(yǎng)元素，或與病原菌競爭營養(yǎng)和空 間或直接產(chǎn)生拮抗物質而抑制病原菌，從而間接促進植物生長。研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮等 4 種蘭科藥用植物的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生赤霉素 ( GA 3) 、吲哚乙酸 ( IAA ) 、脫落酸( ABA ) 、 玉米素(Z)、玉米素核苷(ZR)等植物生長調(diào)節(jié)劑12。 1.2.6 產(chǎn)香氣的內(nèi)生真菌 從香料植物香茅草上分離到一株產(chǎn)香內(nèi)生菌 XCY-1，液體發(fā)酵后分析

17、鑒定其發(fā)酵 液的揮發(fā)性成分，共鑒定出 74 個化合物，其中有乙縮醛二乙醇、檸檬烯、月桂烯、月 桂醛等多種香料物質。產(chǎn)香內(nèi)生菌給新的香料資源開發(fā)提供了理論依據(jù) 13。 1.2.7 生物防治 植物內(nèi)生真菌的專一性很強， 除了對其宿主植物及取食或感染宿主植物的生物起作 用外，對其他生物沒有直接影響， 而且內(nèi)生真菌還可通過人工接種被導入不同的植物并 可通過宿主的種子進行遺傳；內(nèi)生真菌分布于植物組織內(nèi)，有足夠的碳源、氮源，而且 受到植物組織的良好保護， 具有更穩(wěn)定的生存環(huán)境， 更易于發(fā)揮作用， 因而具有作為生 物農(nóng)藥的優(yōu)良特性。 蘭琪等14從苦皮藤(Celastrus angulatuS植株中分離到39

18、株內(nèi)生真菌，其中3株內(nèi) 生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的丙酮提取物對番茄灰霉病等 6 種病菌的菌絲生長有較強的抑制作用。 在盆栽試驗中，內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的丙酮提取物對供試病菌的治療和保護作用均在 50以上， 有的內(nèi)生真菌在一定條件下可成為拮抗菌。 由此可見， 內(nèi)生真菌可能成為生 物防治中有潛力的微生物農(nóng)藥和增產(chǎn)菌。 但內(nèi)生真菌提高植物抗病性的機制， 以及內(nèi)生 真菌如何影響寄主防御相關的酶系活性還不清楚。 1.2.8 其他作用 藥用植物內(nèi)生真菌具有一些其他有益的生理作用，如除草活性、抗結核、抗瘧、免 疫抑制作用、抗氧化，降解纖維素、保鮮等 12。 1.3 白蟻及白蟻的危害 1.3.1 白蟻 白蟻屬于昆蟲綱(I

19、nsectS*等翅目(Isopte，是地球上最古老的社會性昆蟲，距今大 約有2.5億年的歷史。全世界有大約 2600種白蟻， 我國有500余種。白蟻在分類上的地位 和名稱經(jīng)歷了 100多年的不穩(wěn)定。 從解剖學和社會組織性特征可以把白蟻分為兩大類群， 即低等白蟻， 包括澳白蟻科 (Mastotermitidae* 、木白蟻 (Kalotermitidae* 、草白蟻科 ( Hodotezmitzdae* 、原白蟻科 (Termopsidae* 、鼻白蟻科 (Rhinotermitidae* 、齒白蟻科 (Serritermitidae* 和高等白蟻即白 蟻科( Termitidae * 共七個科

20、。高等白蟻較低等白蟻有更細致的內(nèi)外部解剖學特征和更強 的社會組織性。 低等白蟻吃木質性食物 (吃草的草白蟻除外 *，腸內(nèi)有原生動物和細菌共 生；白蟻科占白蟻總數(shù)的 75，吃樹、草、凋落物和含礦物質的土壤，有豐富的腸細菌 共生，但原生動物很少見 15。 白蟻屬社會性群體生活昆蟲， 并有復雜的組織分工。 在一個群體內(nèi)的個體， 從形態(tài) 和分工上可分為兩大類型， 即生殖型和非生殖型。 生殖型為有性的雌蟻和雄蟻， 它們的 職責是保持舊群體和創(chuàng)立新群體。 在這個類型中有大翅型或有翅型， 短翅型， 無翅型三 個品級。非生殖型是指沒有生殖能力的白蟻。它們無翅，生殖器官已經(jīng)退化，主要擔負 勞動和作戰(zhàn)的任務，因而

21、又有工蟻與兵蟻之分。 白蟻作為社會性昆蟲的類群之一， 低等白蟻與腸道微生物共生是其特征， 很多研究 者經(jīng)常選擇其作為研究材料。 白蟻腸道呈螺旋狀， 其中存在著原生動物， 發(fā)酵性螺旋體， 同型產(chǎn)乙酸細菌， 甲烷細菌和硫酸鹽還原菌， 它們對白蟻消化木質纖維素類食物有著重 要作用 16 。 1.3.2 白蟻的危害 作為森林“分解者”，白蟻對森林的物質循環(huán)起了很大作用；反之，作為木材害蟲， 它給人類帶來了各種危害。 白蟻是喜溫性昆蟲， 只要具備了適宜的溫度， 濕度和食物等 條件，就能很快的繁殖，擴散。白蟻的繁殖危害可造成嚴重的損失，全世界每年直接和 間接的損失達數(shù)十億美元。由于白蟻危害的嚴重性和廣泛性

22、而引起了人們的重視。 在歐洲，散白蟻(Reticulitermes)造成的財產(chǎn)損失最大，僅法國每年損失就達2億歐 元。在意大利、西班牙、葡萄牙和希臘，白蟻對建筑的侵害也很嚴重，很多具歷史意義 的建筑被嚴重損壞。隨著歐洲經(jīng)濟復蘇，在 5 年內(nèi)，年除害處理費用至少達到 10 億歐 元。在北美洲，白蟻被視為主要經(jīng)濟害蟲，僅美國，被調(diào)查地每年白蟻防治和損失維修 費在 10 億美元以上。 1.3.2.1 白蟻對建筑物的破壞 白蟻對建筑物的破壞， 特別是對磚木結構、 木結構建筑的破壞， 由于其隱蔽在木結 構內(nèi)部 破壞或破壞其承重部位，往往造成房屋突然倒塌，導致財產(chǎn)損失和人員傷亡， 引起人們的極大關注。 近

23、年來，隨著鋼筋混凝土建筑的增多， 被白蟻破壞造成倒塌的危險性的比率是在逐 步降低。 但是，新的大廈內(nèi)部木結構仍可遭受白蟻破壞。白蟻不僅危害木結構，而且 它分泌的蟻酸也可以腐蝕金屬。因此，新建房屋必須進行白蟻預防處理。 1.3.2.2 白蟻對堤壩的破環(huán) 在我國南方諸省、 區(qū)的堤壩白蟻危害極為普遍， 堤壩白蟻主要危害種類是土白蟻屬 和大白蟻屬，在中國有廣泛的分布。尤其是長江流域及其以南的江河堤圍和山塘水庫， 普遍遭受白蟻的危害，常常出現(xiàn)蟻患險情和災難。這些白蟻在堤壩內(nèi)2-3m甚至更深處， 修筑直徑達Im以上的巢，密集營巢，蟻道四通八達，有些蟻道甚至穿通堤壩的內(nèi)外坡。 當汛期水位升高時，常常出現(xiàn)管涌

24、、滑坡、垮壩險情。 1.3.2.3 白蟻對農(nóng)作物的危害 白蟻可以危害花生、木薯、桑、茶、玉米、小麥、水稻等農(nóng)作物，尤其對甘蔗的危 害十分嚴重。另外，白蟻對楊梅、山核桃、杉木、樟樹、按樹、刺槐、垂柳、懸鈴木、 白楊、重陽木、拐棗等林木、果樹等的危害也具有相當?shù)膹V泛性和嚴重性。在南方丘陵 地區(qū)，杉木林基地的蟻害率一般達 40%60%。在廣州市郊區(qū)，公路兩旁的按樹蟻害 率達 90以上。 1.3.2.4 白蟻對通訊設備的破壞 埋地塑料電纜和通訊設備也常遭白蟻蛀食。 在南方，白蟻造成的通訊電纜故障占總 故障率 60%，廣東省則高達 80%。電力電纜被白蟻咬穿護層后，還易引起短路，導致 電力轉送中斷，甚至

25、釀成火災。據(jù)報道，我國南方已有 12 個省、市、自治區(qū)，發(fā)現(xiàn)白 蟻破壞埋地塑料電纜情況。 1.3.2.5 白蟻對其他物品的危害 白蟻還能危害圖書、 文物、織物、武器、賬冊、錢幣、地下電纜等， 造成重大損失。 1.3.2.6 白蟻對生態(tài)環(huán)境的危害 據(jù)統(tǒng)計世界上的白蟻群每年向大氣排放 2000萬噸蟻酸，蟻酸產(chǎn)生化學物質，污染 大氣，此項污染已超過了汽車和工業(yè)煙霧對環(huán)境造成的污染。目前各國腫瘤專家認為： 空氣越污染，癌癥的發(fā)病率就越高。由此看來白蟻是個不可忽視的禍根 17 。 1.4 白蟻的防治 1.4.1 物理防治法 使用簡單工具、機械及利用光、熱、電等來防治白蟻的方法，它具有殺蟻直接、不 造成環(huán)

26、境污染、 不破壞木材等被處理物的特點， 特別適用于文物、 木竹制品等白蟻的防 治。主要有：人工挖取白蟻巢，利用射線，熱能，電能防治白蟻以及燈光誘殺等。 物理屏障技術，主要是利用砂子、玄武巖石子顆粒、金屬網(wǎng)、金屬板和PV（板等物 質作為物理或機械屏障， 防止白蟻進入建筑物內(nèi)造成危害的方法。 是利用白蟻只能通過 1 m以上的空隙，但不能用口器搬運直徑大于 1 mr的石頭顆粒的特點，設計障礙物阻止 白蟻通過。 這種方法的優(yōu)點主要是能預防白蟻進入建筑物內(nèi)進行為害， 而不是驅趕或滅 殺接近建筑物的白蟻；可結合建筑物施工時完成，花費不高，對環(huán)境友好。不足的是未 能阻止分飛的蟻群進入建筑物。 在澳大利亞、

27、加拿大和美國的夏威夷， 這種技術投入商 業(yè)運用已超過 10年，申請了多個專利。物理屏障法可根據(jù)需要采用以下幾種屏障材料： 篩網(wǎng)，石頭顆粒，防護板，防水膜和鋼結構等 18 。 物理防治雖然具有無污染、無殘留、無毒害等優(yōu)點，且有的措施還能在短時間內(nèi)使 白蟻死亡，但是，由于使白蟻死亡的有效物質（光、電、熱、射線等）均要直接作用到 白蟻，才能使白蟻死亡， 致死物在蟻群中不能增值傳染， 不能依靠白蟻間相互感染消滅 整個蟻群。因而，物理防治較適宜于局部處理，不能廣泛應用于白蟻防治，難以達到長 久有效的要求。 1.4.2 化學防治法 化學防治因其毒殺效果好， 驅避強烈， 所以仍然是目前最主要、 最普遍研究的

28、白蟻 防治方法。在防治過程中一般是利用化學防治劑的觸殺、 胃毒、熏蒸等作用來殲滅白蟻。 目前常用的白蟻防治方法主要有：粉劑毒殺法，潑澆法，毒餌誘殺法，熏蒸法等 . 藥劑 的毒力是化學防治的核心， 在防治過程中， 藥劑無增值作用。 而高效低毒對化學防治來 講，是一項難以克服的矛盾。現(xiàn)在的化學防治研究，也只能提高藥劑的利用率，降低防 治工作的損耗量， 無法避免使用毒劑， 只能使實際用藥量盡可能接近防治所需的最小用 藥量。 目前我國及各國市場上常用的白蟻防治劑主要有：砷制劑、金屬鹽類、無機酸類、 有機氯 ( 氟)類、有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、硅烷類、有機雜環(huán)類和昆蟲 生長調(diào)節(jié)劑等。 砷制

29、劑是無機白蟻防治劑的重要品種， 主要品種如亞砷酸 (As2O3) 、砷酸鉛、 亞砷酸 鈉等。亞砷酸俗稱砒霜，是一種強胃毒劑。利用白蟻的互相吮舐習性，還可制成各種誘 殺劑使用。該藥是我國目前使用量最大的滅蟻劑， 但在潮濕環(huán)境下滅蟻效果不佳。 目前， 隨著人們環(huán)保意識的加強，逐漸被淘汰。 有機氯(氟)藥劑其主要品種如氯丹(chlordane)等。氯丹的觸殺、胃毒、熏蒸作用強 烈，且殘效期長， 廣泛用于新建房屋的白蟻預防， 是我國過去使用量最大的白蟻預防藥 劑。但是，由于這些藥物的強殘留作用和高汽化性， 我國現(xiàn)在已經(jīng)停止生產(chǎn)并禁止使用。 硫酰氟 (sulfurylfluoride ) 和溴甲烷是目前

30、我國被允許使用的 2種熏蒸劑，但溴甲烷在發(fā)達 國家已于 2005年被禁止使用，發(fā)展中國家則需在 2015年完全淘汰。 有機磷類代表為毒死蜱 (chlorpyrifos) ，是一種有機磷類高效白蟻防治劑。 觸殺、 胃毒和熏蒸作用強烈，而且長效、廣譜、低殘留。毒死蜱是國內(nèi)目前最有可能替代氯丹 的較理想藥劑，也是目前國外使用最多的白蟻預防藥劑。 此外，擬除蟲菊酯類藥劑是目前世界上品種最多的白蟻預防藥劑，以氯菊酯 (permethrin)、氯氰菊酯(cypermethrir)、氰戊菊酯(fenvalerate等菊酯類為有效成分為 代表的白蟻防治劑，已在美國甚至全世界都占有較大的市場比例 19 0 昆蟲

31、生長調(diào)節(jié)劑被譽為 “第 3代殺蟲劑”，主要包括保幼激素類似物和幾丁質合成抑 制劑兩大類。氟鈴脲對環(huán)境污染小，胃毒作用和觸殺作用明顯，對北美散白蟻、白灣乳 白蟻的控制作用顯著 19 。 1.4.3 生物防治法 隨著科學技術的進步和人們對白蟻習性的了解， 生物防治白蟻將是未來白蟻防治的 主流。利用生物源物質作為白蟻防治劑對白蟻進行控制和減滅的技術稱為生物源物質防 治技術。這一技術由于可選種類多樣、 作用方式獨特和環(huán)境和諧性良好等優(yōu)點而受到產(chǎn) 業(yè)界和大眾的重視 植物是未來殺白蟻劑的寶庫， 它的提取物對白蟻具有毒殺、 驅避和拒食作用。 已有 越來越多的殺蟲植物活性物質用于白蟻防治。伊可兒等 20從 8

32、3種樹木提取液中，篩選 出 29 種樹木提取液對白蟻均有較強的忌避活性效果。 利用可引起白蟻致病致死的病原微生物 （ 真菌、細菌、病毒等 ）在蟻群中感染、傳播， 而達到防治白蟻的目的。 目前微生物防治雖然還處于試驗研究階段， 但是國內(nèi)外科技工 作者通過不懈努力，已取得可喜的成果。黃曲霉Aspergillus flavus、白僵菌 Beauveria bassiana 綠僵菌Metarhizium anisopliae等對白蟻的毒力也較高21。目前，利用這類真 22 ， 23 。 菌防治白蟻申請了多個專利。混合使用昆蟲病原線蟲的Xenorhabdus Photorhabdus共 生細菌和病原真菌

33、球孢白僵菌或金龜子綠僵菌可防治白蟻，并申請了專利 微生物（真菌、細菌、病毒等 ）具有選擇性強的特點，只要選擇只對寄主 （白蟻等昆 蟲） 有作用，對人、畜和農(nóng)作物等無害、無污染的微生物，就能達到低毒的要求。另一 方面，微生物在使寄主致病致死的過程中，本身也在急劇繁殖，具有增殖作用。而且， 白蟻是營巢居的集群生活， 相互間有交哺， 舔舐的習性， 特別是“對病蟻舔唰至死為止” 的特性，為微生物在蟻群中感染傳播提供有利條件， 使微生物防治有可能達到高效的要 求。 1.5 本試驗研究的目的及意義 香柏具有天然的抗白蟻、 抗腐蝕等特性， 且已從這種樹中分離到香榧醇、 香柏酮等 十多種具有抗白蟻作用物質。

34、按照基因可互相傳遞的原則推測， 這些抗白蟻物質可能由 其內(nèi)生菌產(chǎn)生，而使香柏具有抗白蟻的功能。 本試驗從柏樹中分離內(nèi)生真菌， 以在白蟻體內(nèi)分離的產(chǎn)纖維素酶、 木質素酶的共生 菌作指示菌， 利用牛津杯法對分離到的內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物做抑菌試驗， 篩選出抑菌效 果好的菌株。以篩選到的菌株代謝產(chǎn)物來殺滅白蟻，為白蟻的微生物防治開辟出新的途 徑，不僅達到了防治白蟻的目的，也解決傳統(tǒng)方法對環(huán)境的毒害問題。 2. 材料與方法 2.1 材料及設備 2.1.1 分離內(nèi)生菌所用樹木及指示菌 柏樹( Port-orford-cedar )樹枝、樹皮； 指示菌：細菌 HDB-II-003 、HDB-II-005 ，真

35、菌 HDF-I-006 、HDF-I-008 (白蟻腸道 內(nèi)分解纖維素的內(nèi)生菌，由本實驗室從黑翅土白蟻腸道內(nèi)分離并保存) 2.1.2 培養(yǎng)基 (1) 分離培養(yǎng)基：樹木浸汁20mL瓊脂20g，蒸餾水980mL pH自然； (2) 真菌分離培養(yǎng)基：酵母膏 1g,樹木浸汁20mL瓊脂20g，鏈霉素終濃度 30.0 卩 g/mL,蒸餾水 980mL, pH4.8; (3) 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000ml, pH7.0-7.2 ，固體培養(yǎng)基加入 2的瓊脂； (4) 半固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中加入0.6瓊脂， 加熱溶解，分裝

36、小瓶，每瓶 25mL； (5) 查氏培養(yǎng)基：蔗糖 30g， NaN03 2.0g ， KCl O.5g ， MgS04O.5g， FeS04 O.O1g， KHP0 1.0g，蒸餾水1000ml，pH自然，固體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂； (6) 半固體查氏培養(yǎng)基：查氏液體培養(yǎng)基中加入0.6 的瓊脂，加熱溶解，分裝 小瓶，每瓶 25mL； (7) 水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂20g，蒸餾水1000m1 pH自然； 以上培養(yǎng)基在1.05kg/cm2, 121C, 20min高壓蒸汽滅菌后備用。 2.1.3 主要儀器設備 電子天平：梅特勒托利多儀器上海有限公司 全自動滅菌鍋( SANYO Electric Co.

37、Ltd. )； 柜式恒溫冷凍搖床 HQL300A ：中國科學院武漢科學儀器廠 超凈臺SW CJ2FD:蘇凈集團安泰公司 電熱恒溫培養(yǎng)箱 Q/BKYY28-200 ：上海躍進醫(yī)療器械廠 生化培養(yǎng)箱 LRH 2 50A ：廣東省醫(yī)療器械廠 保鮮柜LC 156：海爾集團 低速離心機 LD52A ：北京醫(yī)用離心機廠 光學顯微鏡 SA 3000：北京泰克儀器有限公司 電熱恒溫鼓風干燥箱DHG 9140A :上海一恒科技有限公司 2.2 試驗方法 2.2.1 內(nèi)生真菌的分離 用滅菌解剖刀分別取主干和側枝的樹皮、韌皮部和木質部，切成薄層小塊 （ 兩端均 需有切口），約1cm 1.5cm大小，用自來水將表面清

38、洗干凈晾干，無菌操作置于 75% 乙醇消毒35min,后用無菌水沖洗34次，0.1 %升汞消毒30s，再用75%乙醇消毒 1min,無菌水沖洗34次，將橫截面切段接入已倒好的分離培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿置于 28C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)35d。大約35d后在分離培養(yǎng)基上長出菌，然后三區(qū)劃線法 把菌接入真菌分離培養(yǎng)基，分離出單菌落。 2.2.2 內(nèi)生真菌的純化 接種物培養(yǎng)23d后，其邊緣長出菌絲，用接種針挑取切口處新長出的菌絲， 及時 轉接至查氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落出現(xiàn)后，按以下方法逐步純化，對菌株編號后，轉至 查氏斜面培養(yǎng)基上，于28E培養(yǎng)箱中培養(yǎng)34d,然后放入4C冰箱保存。 2.2.2.1 平板劃線分

39、離法 先用滅菌的接種環(huán)挑取少許菌，在瓊脂平板上劃Z線至平板三分之一處，此為一區(qū)， 一區(qū)要密些，然后灼燒接種環(huán)，將接種環(huán)冷卻后，劃二區(qū)，劃線要與一區(qū)交叉一次，同 理劃三區(qū)與二區(qū)交叉一次。三區(qū)要劃的分散些，以便容易分離出單菌落。 2.2.2.2 稀釋涂布平板法 （1）倒平板 將查氏固體培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至 5560C時，倒平板。 （2）制備菌懸液 將待測菌接入裝有10mL無菌水的試管中，振搖約20mi n，用一支1mL無菌吸管吸 取1mL菌液，加入到盛有9mL無菌水的試管中，混合均勻。然后用另一無菌移液槍從此 試管吸取1mL混合液加入另一瓶盛有 9mL無菌水的試管中，混合均勻。以此類推制成 1

40、0-1、 1 0-2、 1 0-3、 1 0-4、 1 0-5、 1 0-6、 1 0-7、 1 0-8不同濃度的菌懸液。 3）涂布 將上述培養(yǎng)基的平板底面分別標記上 10-5、10-6、10-7、10-8 四種稀釋梯度，然后用 無菌移液槍分別由10-5、10-6、10-7、10-8四管中吸取O.ImL菌液對號放入相應的平板中， 用無菌玻璃涂布棒輕輕涂勻，靜置 510mi n。 （4）培養(yǎng) 將平板倒置于28C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2448h。 （5）挑菌落 將培養(yǎng)后長出單個菌落的平板分別調(diào)取少許菌體接種到查氏斜面上，28 C培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)34d，4C冰箱保藏。 2.2.3 搖瓶培養(yǎng) 無菌操作條件下，將

41、分離出的內(nèi)生真菌用接種環(huán)接種于盛有 200mL查氏液體培養(yǎng)基 的500mL三角瓶內(nèi)，每菌株1瓶，在28C，140r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)711d。 2.2.4 牛津杯法抑菌實驗 2.2.4.1 培養(yǎng)基 （1）水瓊脂培養(yǎng)基：作為雙層培養(yǎng)基的底層（23mm，使之與上層的半固體培養(yǎng) 基結合緊密，在去掉牛津杯加入發(fā)酵液后，發(fā)酵液不會外泄； （2）查氏半固體培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)真菌； （ 3）牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)細菌。 2.2.4.2 立牛津杯 制備水瓊脂平板：滅菌后的水瓊脂培養(yǎng)基分別裝于已滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)（約15mL）， 冷凝后在培養(yǎng)基上均勻放置 2 個已滅菌的牛津杯。 2.2.4.3 菌懸

42、液的制備 預先把指示菌在室溫下活化2h，然后在超凈臺上用接種環(huán)刮取兩環(huán)菌種置于30mL 無菌水中，搖勻，制成菌懸液。 2.2.4.4 雙層培養(yǎng)基的制備 在無菌條件下，用移液槍吸取1mL菌懸液加入到盛有25mL半固體培養(yǎng)基的小三角 瓶中，其中細菌指示菌加入到牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基， 真菌指示菌加入到查氏半固 體培養(yǎng)基，混勻后，倒入已立有牛津杯的水瓊脂培養(yǎng)皿中備用。 2.2.4.5 發(fā)酵液的制備 將搖瓶培養(yǎng)的真菌發(fā)酵液，在無菌條件下，倒入已滅菌的離心管中，3500rpm離心 12mi n。棄去沉淀，取上清液置于已滅菌的三角瓶內(nèi)。 2.2.4.6 抑菌實驗 待上層半固體培養(yǎng)基冷凝后， 用鑷子沾取酒

43、精經(jīng)火焰滅菌后， 將雙層培養(yǎng)基中的牛 津杯輕輕拔出（要保持邊緣圓滑）。用移液槍將150卩L已制備好的發(fā)酵液注入到牛津杯 留下的孔內(nèi)。室溫放置34h后放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)，細菌指示菌 28C培養(yǎng)16h左右， 真菌指示菌28C培養(yǎng)48h左右，測其抑菌效果。 3. 結果與分析 3.1柏樹木內(nèi)生真菌的分離 把處理過的木塊置入含有樹木浸汁的水瓊脂培養(yǎng)基，同時另取同樣處理過的小木塊 在對照培養(yǎng)基平板上滾動擦拭，此平板與分離平板一起培養(yǎng)，以檢驗樹木小塊表面消毒 是否徹底。小木塊置入水瓊脂培養(yǎng)基，可最大程度減少染菌的機會。通過觀察，發(fā)現(xiàn)對 照培養(yǎng)基上沒有生長任何微生物，證明分離到的微生物為植物的內(nèi)生菌。 本試驗從

44、柏樹木中分離獲得了 34株內(nèi)生真菌，編號為HDF-I-211至HDF-I-244。 3.2活性篩選結果 從34株內(nèi)生真菌中選取第711d發(fā)酵液進行處理，分別對細菌指示菌 HDB-II-003、HDB-II-005，真菌指示菌 HDF-I-006、HDF-I-008 作抑菌試驗，測試其 抑菌活性。試驗結果見表4-1、表4-2。結果表明有 4株菌株分別為 HDF-I-217、 HDF-I-224、HDF-I-232、HDF-I-241的代謝產(chǎn)物對細菌指示菌有較好程度的抑菌活性， 有 5 株菌株 HDF-I-217、HDF-I-219、HDF-I-232、HDF-I-237、HDF-I-242 的代

45、謝產(chǎn)物對 真菌指示菌有較好程度的抑菌活性。 綜合以上結果編號HDF-I-217、HDF-I-232抑菌效果最好。菌株 HDF-I-232抑菌效 果見附錄。 表4-1內(nèi)生真菌活性篩選抑菌結果 Table 4-1 The scree ning results of bacteriostasis for en doge nous fungi . 指示 菌 菌種 第7 d 第8 d 第9 d 細菌細菌 -003-005 第10 d 第11 d 細菌 -003 細菌 -005 細菌 -003 細菌 -005 細菌 -003 細菌 -005 細菌 -003 細菌 -005 HDF-I-211 HDF-I-

46、212 + + + + + HDF-I-213 HDF-I-214 HDF-I-215 + + HDF-I-216 HDF-I-217 + + + + + + + + + + + HDF-l-218 HDF-I-219_ _ _ _ _ + _ + + + HDF-I-220 一 + HDF-I-221 一 _ _ _ HDF-I-222 + + + HDF-I-223 一 HDF-I-224 _ + + + + + + + + + + HDF-I-225 + + + + + HDF-I-226 HDF-I-227 一 HDF-I-228 HDF-I-229 HDF-I-230 HDF-I-2

47、31 + HDF-I-232 + _ _ + + + + + + + + + + HDF-I-233 + + + HDF-I-234 HDF-I-235 _ HDF-I-236 + + HDF-I-237 一 + + + + + HDF-I-238 HDF-I-239 HDF-I-240 + HDF-I-241 _ + + + + + + + + + HDF-I-242 一 + + + + + + HDF-I-243 HDF-I-244 注：0（平均抑菌圈直徑）6mnm +: 6 mnQ 10mm +： 10mmC 16mm +： 16mmC 26mm 表4-2內(nèi)生真菌活性篩選抑菌結果 Tab

48、le 4-2 The scree ning results of bacteriostasis for en doge nous fungi 指示 菌 菌種二 第7 d 第8 d 第9 d 第10 d 第11 d 真菌 -006 真菌 -008 真菌 -006 真菌 -008 真菌 -006 真菌 -008 真菌 -006 真菌 -008 真菌 -006 真菌 -008 HDF-I-211 HDF-I-212 + + + HDF-I-213 HDF-I-214 HDF-I-215 + + HDF-I-216 + + + HDF-I-217 + + + + + + + + + + + + HDF

49、-I-218 HDF-I-219 + + + + + + + + + + + + + + HDF-I-220 + + HDF-I-221 HDF-I-222 HDF-I-223 + + + HDF-I-224 + + + + + + + + + + + + HDF-I-225 + HDF-I-226 HDF-I-227 + + HDF-I-228 + + + + + + HDF-I-229 HDF-I-230 HDF-I-231 + HDF-I-232 + + + + + + + + + + + + + HDF-I-233 + + + HDF-l-234 HDF-l-235_ HDF-l-23

50、6 _ _ _ + + + + + + + + HDF-I-237 + + + + + + + + + + + + + + HDF-I-238 HDF-I-239 HDF-I-240 + + + + + + HDF-I-241 + + + + + + + + + + + HDF-I-242 + + + + + + + + + + + HDF-I-243 HDF-I-244 注：0（平均抑菌圈直徑）6mnm +： 6 10mm +： 10mmC 16mm +： 16mmC 26mm 4. 討 論 近年來，內(nèi)生菌由于其獨特的生理特性及在自然界中重要的生態(tài)學作用， 引起了人 們廣泛的關注。 植物內(nèi)生

51、菌是一類次生代謝產(chǎn)物豐富、 應用前景廣闊的資源微生物。 從 對植物內(nèi)生菌的存在、分布、種類、到內(nèi)生菌的生理特性，各類研究競相開展并頗有成 效。而內(nèi)生真菌作為微生物中的重要類群， 若能對其進行合理的開發(fā)與利用， 從中尋找 并發(fā)現(xiàn)新型先導化合物，則將成為開發(fā)新藥物、研制新農(nóng)藥的重要途徑。 在分離過程中， HDF-I-219 的分離出現(xiàn)了一些困難，在視野中的菌形態(tài)并不均一， 經(jīng)過多次的梯度稀釋、劃線分離后，得到了純的單菌落。因此，在菌的分離過程中，要 嚴格堅持無菌操作，操作時要有細心耐心。 本試驗在分離內(nèi)生真菌過程中， 為檢查材料表面消毒的效果， 做如下對照試驗： 將 上述同樣表面消毒過的小塊直接置

52、于分離培養(yǎng)基平板上作對照培養(yǎng)處理， 結果若對照材 料周圍均無任何真菌長出， 證明表面消毒徹底， 從而保證了所分離出的真菌是植物的內(nèi) 生真菌而不是空氣中的或組織塊表面附生的微生物。 有些內(nèi)生真菌專一性地寄生在植物體內(nèi)， 不能在人工培養(yǎng)基上生長， 即使使用不同 的營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)， 也不能確保把生活在植物組織內(nèi)的所有真菌全部分離出來。 有些已 分離到的內(nèi)生真菌在人工培養(yǎng)基上不產(chǎn)生可育性孢子， 就會由于菌絲體的死亡而造成菌 種丟失，因此不能準確地反映出植物組織內(nèi)生菌的數(shù)量和種群。 在抑菌活性篩選中選擇了不同的指示菌，由于真菌和細菌指示菌的培養(yǎng)時間不同， 而且 34 種菌株同時做抑菌實驗工作量很大，所以

53、可以分開進行，先對細菌指示菌做抑 菌實驗，再對真菌做抑菌實驗。實驗過程中要標記準確，及時記錄實驗結果。 提高內(nèi)生菌所產(chǎn)生的抗菌化合物的產(chǎn)量， 將來可以采取常規(guī)誘變、 基因工程等手段 選育高產(chǎn)菌株以及優(yōu)化培養(yǎng)基成分、 研究發(fā)酵條件和代謝調(diào)控等方法提高抗白蟻化合物 的產(chǎn)量。 植物內(nèi)生真菌的研究存在許多問題， 只有通過對內(nèi)生真菌全面系統(tǒng)的研究， 并 借助于其它學科的研究方法和手段， 進一步完善其基礎理論， 才能推動植物內(nèi)生真菌研 究的不斷深入，豐富微生物資源。 植物內(nèi)生真菌這一資源將得到更多更合理的開發(fā)與利 用，為醫(yī)學和農(nóng)業(yè)的發(fā)展做出巨大貢獻。 5. 結 論 5.1 從柏樹中分離得到 34 株內(nèi)生真

54、菌； 5.2 菌株 HDF-I-217 、 HDF-I-224 、HDF-I-232 、HDF-I-241 的代謝產(chǎn)物對白蟻腸道內(nèi)生 細菌具有抑菌活性； 5.3 菌株 HDF-I-217 、HDF-I-219、HDF-I-232 、HDF-I-237 、HDF-I-242 的代謝產(chǎn)物對白 蟻腸道內(nèi)生真菌具有抑菌活性； 5.4 綜合以上篩選結果菌株 HDF-I-217 、HDF-I-232 抑菌效果最好。 參考文獻 1 張曉瑞 .植物內(nèi)生菌及其開發(fā)應用研究進展 J. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展 .2007 ，7(11):1747-1750. 2 Stone J K, Bacon C W, White J

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