制藥微生物菌種建立

1、項(xiàng)目二項(xiàng)目二 微生物發(fā)酵制藥工藝微生物發(fā)酵制藥工藝 2.1 2.1 概述概述 2.2 2.2 微生物生長(zhǎng)與生產(chǎn)的關(guān)系微生物生長(zhǎng)與生產(chǎn)的關(guān)系 2.3 2.3 制藥微生物菌種建立制藥微生物菌種建立 2.4 2.4 制藥微生物培養(yǎng)基制備制藥微生物培養(yǎng)基制備 2.5 2.5 滅菌工藝滅菌工藝 2.6 2.6 微生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)微生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù) 2.7 2.7 發(fā)酵工藝過(guò)程的檢測(cè)與控制發(fā)酵工藝過(guò)程的檢測(cè)與控制 2.3 2.3 制藥微菌種的建立制藥微菌種的建立 2.3.1 新藥生產(chǎn)菌種的選育新藥生產(chǎn)菌種的選育 2.3.2 菌種保藏菌種保藏 2.3.3 菌種庫(kù)建立與質(zhì)量控制菌種庫(kù)建立與質(zhì)量控制 發(fā)酵制藥發(fā)

2、酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 制藥生產(chǎn)對(duì)菌種的要求制藥生產(chǎn)對(duì)菌種的要求 1.遺傳穩(wěn)定性：能長(zhǎng)期繁殖，不易變異和退化。純種， 無(wú)雜菌及噬菌體。 2.易生長(zhǎng)性：生長(zhǎng)旺盛、迅速； 4.容易培養(yǎng)性：條件易控，利用價(jià)廉易得的原料。 3.抗污染性：自身保護(hù)機(jī)制，抵抗雜菌污染能力強(qiáng)。 4.經(jīng)濟(jì)性：發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高，良好經(jīng)濟(jì)能力。 5.突變敏感性：對(duì)各種誘變較敏感，提高的潛力大。 菌種選育的目的：改善菌種的特性，使提高產(chǎn)量，改進(jìn) 質(zhì)量，降低成本，改革工藝，方便管理及綜合利用 自然分離自然分離 目的：出發(fā)菌的獲取目的：出發(fā)菌的獲取 樣品的采集：大陸表層土壤，海洋水體樣品的采集：大陸表層土

3、壤，海洋水體 預(yù)處理：根據(jù)分離目的和微生物的特性。預(yù)處理：根據(jù)分離目的和微生物的特性。 溫度；化學(xué)處理；離心、膜過(guò)濾溫度；化學(xué)處理；離心、膜過(guò)濾 培養(yǎng)基：選擇性，營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)基：選擇性，營(yíng)養(yǎng)和ph；添加抑制劑。；添加抑制劑。 分離方法：分離方法： （1）稀釋法：無(wú)菌水，生理鹽水，緩沖液）稀釋法：無(wú)菌水，生理鹽水，緩沖液 （2）濾膜法：細(xì)菌在膜上，放線菌進(jìn)入培養(yǎng)基。）濾膜法：細(xì)菌在膜上，放線菌進(jìn)入培養(yǎng)基。 培養(yǎng)條件：溫度。放線菌：培養(yǎng)條件：溫度。放線菌：2530，3237， 4550；714天至天至1月。月。 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 藥物的篩選藥物的篩選 瓊脂擴(kuò)散法瓊脂擴(kuò)散法

4、活性測(cè)定：活性測(cè)定： 非致病菌為對(duì)象，篩選生物活性物質(zhì)。非致病菌為對(duì)象，篩選生物活性物質(zhì)。 耐藥和超敏菌種。耐藥和超敏菌種。 hplchplc、lclcmsms等，分析鑒定活性物質(zhì)。等，分析鑒定活性物質(zhì)。 靶向篩選靶向篩選 高通量篩選高通量篩選 高內(nèi)涵篩選高內(nèi)涵篩選 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 微生物藥物與菌種的篩選流程微生物藥物與菌種的篩選流程 樣品采集樣品采集 微生物分離微生物分離培養(yǎng)培養(yǎng) 篩選鑒定篩選鑒定 篩選方法學(xué)建立篩選方法學(xué)建立 陽(yáng)性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果 化合物分離化合物分離 純化鑒定純化鑒定 前藥新前藥新 化合物化合物 新新 藥藥 研研 究究 與與 開(kāi)開(kāi) 發(fā)發(fā) 菌種鑒定

5、與保藏菌種鑒定與保藏 生產(chǎn)出發(fā)菌生產(chǎn)出發(fā)菌 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 生產(chǎn)選育生產(chǎn)選育 概念：不經(jīng)過(guò)人工誘變處理，根據(jù)菌種概念：不經(jīng)過(guò)人工誘變處理，根據(jù)菌種 的自然突變而進(jìn)行的菌種篩選過(guò)程。的自然突變而進(jìn)行的菌種篩選過(guò)程。 應(yīng)用應(yīng)用： （1 1）菌種的提純復(fù)壯。（菌種的提純復(fù)壯。（2 2）防）防 止退化，穩(wěn)定生產(chǎn)水平。止退化，穩(wěn)定生產(chǎn)水平。1 1年年1 1次。次。 過(guò)程過(guò)程 菌菌 種種 單孢單孢 子子 單菌落單菌落 測(cè)活測(cè)活 平板平板 分離分離 優(yōu)良優(yōu)良 菌株菌株 效率低（效率低（2e5e8），增產(chǎn)幅度?。?，增產(chǎn)幅度小 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種

6、的建立 誘變育種誘變育種 概念：人為創(chuàng)造條件（誘變劑處理），使菌種概念：人為創(chuàng)造條件（誘變劑處理），使菌種 發(fā)生變異，篩選優(yōu)良個(gè)體，淘汰劣質(zhì)個(gè)體。發(fā)生變異，篩選優(yōu)良個(gè)體，淘汰劣質(zhì)個(gè)體。 物理類(lèi)：紫外線，快中子，激光，太空射線。物理類(lèi)：紫外線，快中子，激光，太空射線。 化學(xué)類(lèi)：堿基類(lèi)似物，嵌合劑，亞硝酸?；瘜W(xué)類(lèi)：堿基類(lèi)似物，嵌合劑，亞硝酸。 生物類(lèi)：噬菌體，轉(zhuǎn)座子。生物類(lèi)：噬菌體，轉(zhuǎn)座子。 v特點(diǎn)：快速，簡(jiǎn)單，效益大。特點(diǎn)：快速，簡(jiǎn)單，效益大。 v缺點(diǎn)：無(wú)定向性，大量篩選。缺點(diǎn)：無(wú)定向性，大量篩選。 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 誘變方案設(shè)計(jì)誘變方案設(shè)計(jì) 出發(fā)菌種

7、的選擇：較高產(chǎn)，對(duì)誘變劑敏感。出發(fā)菌種的選擇：較高產(chǎn)，對(duì)誘變劑敏感。 誘變劑的使用：交叉使用多種，合理組合。中誘變劑的使用：交叉使用多種，合理組合。中 等劑量（等劑量（8080致死率）。致死率）。 選擇壓：施加一定的選擇壓，獲得耐藥菌株。選擇壓：施加一定的選擇壓，獲得耐藥菌株。 措施：添加抗生素，提高前體濃度，增加產(chǎn)物措施：添加抗生素，提高前體濃度，增加產(chǎn)物 濃度。濃度。 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 誘變育種流程誘變育種流程 出發(fā)菌種出發(fā)菌種單孢子懸液?jiǎn)捂咦討乙?稀釋涂板稀釋涂板單菌落初篩單菌落初篩高產(chǎn)菌株高產(chǎn)菌株 誘變處理誘變處理 穩(wěn)定性穩(wěn)定性 特性特性 放大放大 中試中試

8、 復(fù)篩復(fù)篩 投入生產(chǎn)投入生產(chǎn) 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合育種 概念概念 通過(guò)化學(xué)或物理學(xué)的方法，使兩個(gè)不同種通過(guò)化學(xué)或物理學(xué)的方法，使兩個(gè)不同種 類(lèi)的體細(xì)胞融合在一起，形成雜合細(xì)胞，類(lèi)的體細(xì)胞融合在一起，形成雜合細(xì)胞， 產(chǎn)生兼具兩個(gè)親本遺傳性狀的新細(xì)胞。產(chǎn)生兼具兩個(gè)親本遺傳性狀的新細(xì)胞。 特點(diǎn)：有一定的定向性，效果顯著。特點(diǎn)：有一定的定向性，效果顯著。 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 d.d.篩選，鑒定篩選，鑒定 e.e.高產(chǎn)菌株高產(chǎn)菌株 a. a. 原生質(zhì)體制備：原生質(zhì)體制備： 用去壁酶處理將微生用去壁酶處理將微生

9、 物細(xì)胞壁除去，制成物細(xì)胞壁除去，制成 原生質(zhì)體。原生質(zhì)體。 操作過(guò)程操作過(guò)程 hybrid cell c.細(xì)胞壁再生細(xì)胞壁再生 b.b.原生質(zhì)體融合：原生質(zhì)體融合： 異核體或重組子異核體或重組子 菌株菌株1 1菌株菌株2 2 去細(xì)胞壁去細(xì)胞壁 原生質(zhì)體原生質(zhì)體1原生質(zhì)體原生質(zhì)體2 高滲，高滲，pegpeg處理處理 雜合原生質(zhì)體雜合原生質(zhì)體 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 2.3.2 菌種保藏菌種保藏 原因：菌種經(jīng)過(guò)多次傳代，會(huì)發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致退化，原因：菌種經(jīng)過(guò)多次傳代，會(huì)發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致退化， 從而喪失生產(chǎn)能力甚至菌株死亡。從而喪失生產(chǎn)能力甚至菌株死亡。 目的：目的：保持

10、菌種保持菌種原有原有優(yōu)良特性優(yōu)良特性，延長(zhǎng)生命時(shí)限，延長(zhǎng)生命時(shí)限，長(zhǎng)期存長(zhǎng)期存 活、不退化，不污染，隨時(shí)為生產(chǎn)供菌。活、不退化，不污染，隨時(shí)為生產(chǎn)供菌。 原理：使菌種代謝處于不活躍狀態(tài)，即生長(zhǎng)繁殖受抑制原理：使菌種代謝處于不活躍狀態(tài)，即生長(zhǎng)繁殖受抑制 的休眠狀態(tài)。的休眠狀態(tài)。 措施：物理和化學(xué)方法（溫度：低溫；水分：干燥；氧措施：物理和化學(xué)方法（溫度：低溫；水分：干燥；氧 氣：缺氧；營(yíng)養(yǎng)；缺乏）氣：缺氧；營(yíng)養(yǎng)；缺乏） 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 保藏方法比較保藏方法比較 方法名稱主要措施適宜菌種保藏期評(píng)價(jià) 冰箱保藏法 （斜面） 冰箱保藏法 （半固體） 石蠟油封藏法 沙土保藏法

11、 冷凍干燥法 低溫 低溫 低溫、缺氧 干燥、無(wú)營(yíng)養(yǎng) 干燥、無(wú)氧、低 溫、有保護(hù)劑 各類(lèi) 細(xì)菌、酵母菌 各類(lèi) 產(chǎn)孢子微生物 各類(lèi) 36月 612月 12年 12年 515年以上 簡(jiǎn)便 簡(jiǎn)便 簡(jiǎn)便 簡(jiǎn)便有效 簡(jiǎn)便有效 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 2.3.3 菌種庫(kù)建立與質(zhì)量控制 依據(jù)： gmp對(duì)藥品生產(chǎn)的有關(guān)要求和規(guī)定 建立各級(jí)種子細(xì)胞庫(kù)，實(shí)施種子批系統(tǒng)管理， 進(jìn)行驗(yàn)證 確保菌種的穩(wěn)定、無(wú)污染，保證生產(chǎn)正常有 序進(jìn)行。 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 建庫(kù)的流程 w c b qc w c b qc qc mcb 新菌種或細(xì)胞系 原始培養(yǎng)物 qc 質(zhì)保實(shí)驗(yàn)室，繁殖 保

12、存實(shí)驗(yàn)室，繁殖 主菌種庫(kù)mcb：來(lái)源于原始菌種或細(xì)胞培養(yǎng)物 工作菌種庫(kù)wcb：由主菌種庫(kù)或主細(xì)胞庫(kù)繁殖而來(lái)。 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 菌種庫(kù)的質(zhì)量管理菌種庫(kù)的質(zhì)量管理 細(xì)胞類(lèi)型質(zhì)量控制（qc）內(nèi)容 細(xì)菌活性，純度，真實(shí)性，革蘭氏染色，形態(tài)特征，生 化特征，遺傳特征 真菌活性，純度，真實(shí)性，形態(tài)特征，生化特征，遺傳 特征 基因工程 菌 宿主菌特征，表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)與功能，鑒別標(biāo)志，基 因序列，穩(wěn)定性，表達(dá)方式與水平 動(dòng)物細(xì)胞 系 活性，純度，真實(shí)性，無(wú)菌實(shí)驗(yàn)，核型，dna分析 （如指紋圖譜），同工酶分析，支原體試驗(yàn)，其 他外源物試驗(yàn)，穩(wěn)定性和基因型分析 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種

13、的建立生產(chǎn)菌種的建立 保藏機(jī)構(gòu)中國(guó)保藏機(jī)構(gòu)中國(guó) 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心:china center for type :china center for type culture collection (cctcc)culture collection (cctcc)。 中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì), ,下設(shè)下設(shè)9 9個(gè)庫(kù)個(gè)庫(kù) 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心：china general china general microbiological culture collection center microbi

14、ological culture collection center (cgmcc)(cgmcc)，微生物所（真菌和細(xì)菌）；武漢所（病毒），微生物所（真菌和細(xì)菌）；武漢所（病毒） 抗生素菌種保藏管理中心（抗生素菌種保藏管理中心（cacccacc）：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗）：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗 生素所，四川抗生素所，華北制藥集團(tuán)抗生素所生素所，四川抗生素所，華北制藥集團(tuán)抗生素所 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 保藏機(jī)構(gòu)國(guó)外保藏機(jī)構(gòu)國(guó)外 wfccwfcc：world federation for culture world federation for culture collections

15、, collections, http:/www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thmlhttp:/www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thml 美國(guó)的典型菌種保藏中心美國(guó)的典型菌種保藏中心atcc: american type atcc: american type culture collection, culture collection, // 日本發(fā)酵研究所日本發(fā)酵研究所ifo: institute for ifo: institute for fermentation, osaka

16、, japanfermentation, osaka, japan 英國(guó)國(guó)家典型菌種保藏所英國(guó)國(guó)家典型菌種保藏所nctc: national nctc: national collection of type culture, london, uk collection of type culture, london, uk 發(fā)酵制藥發(fā)酵制藥生產(chǎn)菌種的建立生產(chǎn)菌種的建立 小結(jié)與要求 生產(chǎn)菌種選育：自然分離獲得出發(fā)菌種，生生產(chǎn)菌種選育：自然分離獲得出發(fā)菌種，生 產(chǎn)選育、誘變和原生質(zhì)體融合、產(chǎn)選育、誘變和原生質(zhì)體融合、shuffling，提，提 高菌種生產(chǎn)性能高菌種生產(chǎn)性能 菌種保藏：防止失活和退化（物理手段）菌種保藏：防止失活和退化（物理手段） 建立菌種庫(kù)：建立菌種庫(kù)：gmp的要求，質(zhì)量控制，保證的要求，質(zhì)量控制，保證 生產(chǎn)菌種活力和供給生產(chǎn)菌種活力和供給 了解菌種選育和保存的方法及其原理了解菌種選育和保存的方法及其原理 理解其生產(chǎn)應(yīng)