lc480-software1.5中文說明書維護sop--3-10講解學(xué)習

1、LightCycler480 熒光定量 PCR 儀操作規(guī)程1 每次反應(yīng)最后一步都必須做降溫，降至 40 度，維持至少 30 秒。 2在操作過程中，切忌戴有粉末的乳膠手套接觸光學(xué)透性封板膜。3試劑加完樣，封膜完畢后， 在板式離心機中1500X g (3000rpm )離心兩分鐘，以排 除氣泡。4先開電腦在開儀器，先關(guān)儀器再關(guān)電腦。打開總電源，打開連接LightCycler480 熒光定量 PCR 儀的電腦，并打開 LightCycler480 Software 軟件，然后打開 LightCycler480 儀 器后方的電源開關(guān)，此時儀器會在與電腦軟件接通后進行自檢，儀器正面右邊兩盞桔黃 色的燈會

2、閃爍。自檢完畢后，左邊的燈會變綠，右邊的燈仍為桔黃色。這時按一下燈右 邊帶雙箭頭的開關(guān)，儀器的載板器會自動伸出，將準備好的反應(yīng)板放入載板器中( 反應(yīng) 板的切角方向應(yīng)與載板器的切角方向相應(yīng)才能將反應(yīng)板正確放入，切勿用裸手接觸反應(yīng) 板的光學(xué)透性封板膜 )。再按一下帶雙箭頭的開關(guān)，儀器的載板器會自動縮入儀器內(nèi)， 此時儀器能自動檢測到反應(yīng)板，原來呈桔黃色的燈會變綠， LightCycler480 Software 中 Start Run按鈕也同時變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。5. 設(shè)定完實驗程序并編輯完樣本后，點擊軟件中Start Run按鈕，運行實驗。6. 軟件界面上出現(xiàn)Run Complete.標識時，說明實驗運

3、行完畢，按一下儀器上帶雙箭 頭的按鈕，使載板器伸出，取下反應(yīng)板，再按一下帶雙箭頭的按鈕，使載板器縮回，關(guān) 閉 LightCycler480 儀器后方的電源開關(guān)，在電腦上分析實驗數(shù)據(jù)。7. 分析完實驗數(shù)據(jù)后保存結(jié)果，打印報告，并關(guān)閉電腦，關(guān)閉總電源。實驗員在離開PCR擴增區(qū)時帶走用完的反應(yīng)板。維護 SOPLightCycler 480 是一臺免維護的儀器。 做任何維護工作前，須確認主機電源已被關(guān)閉。預(yù)防性維護：1檢查 LightCycler 480 主機兩側(cè)與背后空間，確保無任何阻礙空氣流通的物品，包 括書本、紙張或其他任何物品；2若主機表面和桌面有灰塵，用不起毛的軟布蘸少量清水擦拭干凈。清潔性

4、維護：若有需要，可用性質(zhì)溫和的商品化清潔劑或70的乙醇溶液對 LightCycler 480 主機表面、熱循環(huán) 96 孔模塊和熱蓋進行清潔。清潔 96 孔熱循環(huán)模塊：1. 用移液器移取125 70 %乙醇溶液或異丙醇至所有孔內(nèi)；2. 1 5分鐘后，使用移液器對孔內(nèi)溶液進行多次吹洗；3. 移除孔內(nèi)的液體，并使 96孔模塊孔內(nèi)自然風干；注意操作時不要讓清洗液腐蝕熱循環(huán) 模塊的涂層。LightCycler480 Software 1.5 軟件操作（中文版）第一部分基本界面及圖標概述:Overview 界面Eli Iuuni l MasLuMiMDdLightCycler?480 Software r

5、elease 1.5.0VttHM 1 5.坤AlExit :關(guān)閉LC480軟件Log off :從目前使用的數(shù)據(jù)庫中退出并可登陸其他的數(shù)據(jù)庫Overview :點擊該圖標進入“ Overview ”界面Navigator :點擊該圖標進入“ Navigator ”界面，可進行數(shù)據(jù)的導(dǎo)入導(dǎo)出等操作,詳見 OOOOOOSave：點擊該圖標進行保存Export :導(dǎo)出當前打開的文件Close：關(guān)閉當前打開的文件Print :打印當前打開的窗口Tools:打開“ Tools”界面，可進行密碼修改，建立和編輯用戶，系統(tǒng)設(shè)置，查看 數(shù)據(jù)庫狀態(tài)、儀器狀態(tài)、濾光片組合等操作Help :查看軟件版本，操作說明

6、書等、New Experiment 界面WiRderir肓冥Irrm畠卻“hum HawfltU切PcaTHnPnjqnim NiMHSiiiinl K-：il ienfRua Wc*CfrchEGAaatyis Mode:M 口 Bfl LiijlitCpcJcE JiA|訕.Iratrijlii8iruiiipi1: Vpnyil I 術(shù)刷誕加HOi W 餉海m i N1 C*itii*Gt40曲6 Mf Caourfii肝血rt|atVteji Izg亠tep Deli aylr hoa：ao：oi:忙勺QD護:Run Module :編輯、運行或查看 PCR程序及查看PCR實時數(shù)據(jù)Su

7、bset Editor :點擊該模塊后可進行子集的編輯S-am pieEdiiarSample Editor :點擊后進行樣品信息的編輯Arztysis|Analysis Module:點擊進行結(jié)果分析或查看已保存的分析結(jié)果D4IL1Report Module :選擇需要的內(nèi)容以報告的形式給出結(jié)果Summary Module :查看實驗的總體概況，包括實驗名稱，所用的程序，檢測模 式，濾光片組合等。概況的內(nèi)容由系統(tǒng)自動生成Navigator 界面| NvwRHMDlMlImport :導(dǎo)入一個文件 Export :導(dǎo)出一個文件Batch Import :導(dǎo)入一批數(shù)據(jù) Batch Export

8、:導(dǎo)出一批數(shù)據(jù)New：新建一個實驗或文件夾New Folder :新建一個文件夾Open:打開一個文件Ren ame:重命名Delete：刪除選中的目標Copy:拷貝選中的目標Note :所有上述圖標在深藍色時為激活狀態(tài)，灰色時為滅活狀態(tài)也就是不可用狀態(tài) 各圖標的功能在不同狀態(tài)下以顏色來區(qū)分是否具備。軟件操作打開軟件打開電腦，Windows操作系統(tǒng)的用戶名為operator，密碼為LC480 (區(qū)分大小寫)，電腦操作系統(tǒng)啟動完畢，檢查電腦右下角是否有圖標。如果沒有，點擊桌面“Exor4 for XDMS_R ”快捷方式文件。然后右鍵點擊 守圖標，左鍵點擊“ Show” 一欄，如最后一句話顯示“

9、 Exor 4 server is running”表示數(shù)據(jù)庫加載成功。如果顯示“ Exor4 failed to start”則表示數(shù)據(jù)庫沒有加載上，關(guān)閉該窗口，右鍵點擊劉圖標，選“Shutdown” 一欄，退出數(shù)據(jù)庫，重新點擊桌面“ Exor4 for XDMS_T ”文件，加載數(shù)據(jù) 庫。然后點擊桌面“ LightCycler480 Software”快捷方式文件，運行該軟件。輸入用戶名和密碼。用戶名默認為 admin (管理者權(quán)限)，密碼為LightCycler480 (區(qū)分 大小寫)，如用戶已經(jīng)建立新用戶名，則可以按照新用戶名登錄。二. 用戶管理為了實驗結(jié)果的有效管理，可以建立不同級別

10、的用戶。如：標準用戶(Sta ndard Use)、專業(yè)用戶(Expert User)、管理者(LocalAdministrator)。一般實驗室建議建立專業(yè)用戶(Expert User)用戶名，然后以該用戶名 登錄軟件進行實驗操作。建立新用戶操作：打開LightCycler480操作軟件，點擊右側(cè)匚按鈕打開“ Tools” 工具欄，選擇“ User Access/Users and Groups選項。在右邊窗口中點擊“ New User” 鍵，在右邊“ Enter the users full name” 一欄中填寫用戶的全名，在“”Enter the namethe user wants

11、to log in as 一欄填寫用戶登錄名，在“ Enter the users password 一欄中輸 入密碼(密碼須含有6個以上字母，1個以上數(shù)字，其中有至少一個字母大寫)，在“Confirm the password 一欄中重新輸入一次密碼，加以確認，在“Select the user srole” 一欄中選擇用戶級別，然后點擊右下方“ Close”按鈕加以確認。在G “ Tools”工具欄中的“ System Sett in gs界面中可以設(shè)置各用戶級的權(quán)限, 以及密碼的時效。三. 儀器自檢每次開機時，儀器會自動進行初始化自檢程序。自檢通過，儀器左側(cè)指示燈變綠。 如放置了樣本，儀

12、器右側(cè)指示燈變綠。在自檢時，不能放置反應(yīng)板，否則自檢無法通 過。四. 建立實驗程序打開LightCycler480操作軟件，成功登錄后點擊 按鈕，進入 New Experiment/Run Protocol程序設(shè)置界面。在“ Detection Format” 一欄中選擇所使用的熒光檢測技術(shù)，可選擇各類探針和染料，如常見的SYBR Green I染料、Mo no ColorHydrolysis Probe單色 TaqMan 水解探針、Multi Color Hydrolysis Probe 多色 TaqMan 水解-Setu p探針。Datectioon Format I Bule iColo

13、r HydrolysisPrctoJ在進行多色熒光PCR實驗時，須點擊更巫5按鈕選擇用戶所采用的熒光檢測通道, 點擊“V”確認。在Reaction Volume 20欄中填寫反應(yīng)體積。在“ Programs界面中設(shè)置實驗程序：在“ Program Name下方命名程序，“ Cycles ” 一欄內(nèi)填寫該程序的循環(huán)數(shù)，在“ Analysis Mode ”一欄選擇該程序的分析模式。定量分 析選擇“ Quantification”，溶解曲線分析選擇 “Melting Curves，顏色補償實驗選擇“ Color Compe nsation”。而后在“ Temperature Targets ”界面內(nèi)

14、設(shè)置所指定程序的內(nèi)容，在“ Target( C)處填寫目標溫度，“ Acquisition Mode ”處選擇信號采集方式，“ Hold”一欄填寫該溫度 所持續(xù)的時間，“ Ramp Rate(C/s)”處填寫升降溫速率(注：如目標溫度為50C以下時，為了減少硬件的損耗，必須將降溫速率調(diào)至1.5C/s以下)。如一個程序有多個步增加步驟；也可點擊上下箭頭驟，則在Temperature Targets 界面的左側(cè)處點擊蘭調(diào)整各步驟的先后順序。如一個實驗中有多個程序，也可在“Programs界面左側(cè)點擊，增加程序，也可點擊上下箭頭調(diào)整各程序的先后順序。實驗程度設(shè)置完成后，在下方“ Overview ”

15、界面內(nèi)會自動生成溫度隨時間變化的溫 控曲線，以及估計的運行時間，綠色點表示采集熒光信號的溫度和時間點。可以依照該 圖檢查一下程度設(shè)置是否正確。kradiumerit:Vlnudiittll 監(jiān) 主樺出m A； Mol QinnedEtllDdldibdse! Cdimipiidtr fhfstdiLJtlUMF!S停gm Adminr(rtor Comp IPliuti-Setup 一Oepctiwri Fnunair | Brill：.丄H羅血燈丄夕弓活 FtuB 討 CuxiomuSlock Si zeFl* ID ffteedrioH Vrblume 向I 4 Ma1Cycles押i耳

16、Mrjd gp-deiLa.1 titE腫并tueQyaAtiflectionjjf iii i 引fiJnf1! kfiefttiDTi4Q：|血 WLaq CwcveMQlLmINumPiOrfncHhia.山riNHHk啟tkn TeniperdtuirTryenTrgyt f q他qSite I|imr m|H：57J1U7：33t1 孔剝OOTTO &QE4D.Eid PfiigfriiHijH、* IO1 Cjcilea寶釉n Ault雖1 i設(shè)置好的實驗程序可以保存成模板文件，下次使用同樣的實驗程序時可以調(diào)用。具|i1S0Swb As體操作如下：點擊按鈕右側(cè)的下拉箭頭，選中“ S

17、ave As Template選項，系統(tǒng)默認將實驗程序模板文件保存在所登錄的用戶名下“Templates目錄中，用戶可將其存放在其下的子目錄“ Run Templates下，填寫該程序模板文件的名稱，點擊“V 按 鈕即完成保存。調(diào)用模板程序時可點擊“ Apply Template ”按鈕，從目錄樹中選定所要調(diào) 用的模板，點擊“V”按鈕確認。五. 樣本設(shè)置1樣本亞組編輯：LightCycler480軟件擁有一個獨特的樣本編輯管理功能一一亞組編輯 (Subset Editor)，即將反應(yīng)板上所有的樣本根據(jù)用戶需要分成亞組，對亞組進行獨立地分析定量。具體操作如下：在“ New Experime nt

18、”按鈕新建亞組，并給其命名 所選定亞組的名稱，點擊“界面中，點擊左側(cè)S按鈕，進入Subset設(shè)置界面，點擊I丿按鈕可更改Delete按鈕可刪除所選定的亞組。設(shè)置亞組：在Subsets界點擊按鈕可復(fù)制所選定的亞組，點擊面中選定要設(shè)置的亞組名，在右邊反應(yīng)板孔位處選定該亞組所包含的孔位，使所選定的孔位中都出現(xiàn)深蘭色凹陷的，點擊下方I “h 按鈕加以確認。 tff Bl hfll巒吧杠好心出也出典UliWiNtirit Ylml LihK.ytier UHJ 料| ? Hir OnMCKiiUMntlow:Sum,hew E gBdiwI一呂 ubBBtSS.wdQfn Ari rainJAI27nE

19、+PC二DEF0IH!Uw:設(shè)置亞組可以在一塊反應(yīng)板上實現(xiàn)多個檢測項目的實驗，前提是這些檢測項目的實驗運 行程序都一致（這在使用TaqMan水解探針時比較容易實現(xiàn)），由于各檢測項目均有各 自的質(zhì)控對照，因而，設(shè)定亞組可以單獨對各檢測項目進行分析。2 樣本屬性編輯點擊New Experiment界面左側(cè) 實驗方案：SampleC filler按鈕設(shè)置樣本信息。在Workflow ”一欄在選擇Abs Qua nt:絕對定量或定性分析； Rel Qua nt:相對定量；Sea nning：基因掃描; Color Comp：顏色補償；Tm:熔解溫度檢測；Melt Geno：熔解曲線法基因分型; En

20、dpt Ge no：終點法基因分型。-Step 1: Select Workflowr Abs Quant - Rel Ouant C Scanning C Color CompC Tm- Melt Geno C Endpt Geno在Select Samples/Subse選項中選定待編輯的樣本亞組:-Step 2: Select SamplesSubset: HEV samples在界面右方編輯各樣本的名稱屬性等:Pos：樣本在96孔板或384孔板上的座標位置；Repl Of :重復(fù)樣本設(shè)置；-AIjs QuantSample Name 樣本名稱； Quantification Sampl

21、e Type： 定量樣本類型； Concentration： 度；Target Name：檢測類型。-Sele cl f ilier Combinations* jL1卜PosColorRepl OfSample NameQuantificationSample TypeConcentrationTarget NameAlSTDlStandard1.00E2HBVA2STDZStanda匸負1,00E3BlSTD3Standard1.00E4HBPE2STD4Standard1.00E5HBVClUCM0 gat ive C o n t 匸！丄HB7C2PositivePositive Cen

22、tro丄HBVDiDi5ampLeiUnknownHBVD2DlS amp Le 1UnkncunHBVElVnknQ可口HB712ELSampLe2UnkncunKBVFlFLUnknownHBVT2FlSampLe3UnknownHBV-31JG1SampledTJnlcnawnHB7$G2GLSajpUritenosmHBVBlHlSampledTJnknownH2HLSamp le5Uft.tencwnHB7F 483533 廠 558-610Units |在進行絕對定量檢測實驗時，參與實驗的樣本有標準品（一般4至5個）、陰性對照、陽性對照、未知樣本。各樣本的名稱可參考以上“Sampl

23、e Namd中的命名習慣（STD表示標準品、NC表示陰性對照、Positive表示陽性對照、Sample表示待檢測的未 知樣本），也可以自行編輯。在“ Qua ntificatio n Sample Type” 一欄內(nèi)需要對各樣本的類型進行明確地編輯（標準 品選Standard類型、陰性對照選 Negative Control類型、陽性對照選 Positive Control類 型、未知樣本選Unknown類型），此外標準品系已知濃度的陽性樣本，其設(shè)定為 Sta ndard類型后還需在Co nee ntration 欄中對各標準品分別設(shè)定其相應(yīng)的濃度，以及在 Abs Quant/Units填寫

24、框中填寫相應(yīng)的濃度單位，如 copies、pg等。在Target Name一欄中可以填寫該檢測實驗所要檢測的指標，如乙肝病毒、禽流感病 毒、沙門氏菌等。如在實驗中需要設(shè)置重復(fù)樣本的，可在Repl Of 一欄中填寫該樣本其所重復(fù)的樣本的座標號（注意，只能填寫座標號，不能填寫樣本名）。如進行的是多色熒光 PCR檢測實驗，則在Select Filter Combinations欄中選定各檢 測通道，分別進行樣本編輯。在進行定性檢測實驗時，參與實驗的樣本有陰性對照、陽性對照、未知樣本。設(shè)置 相應(yīng)較簡單，可參考以下設(shè)置rAbs Quant-Units-Select Filter Combitkaiion

25、sF 48333 r 556-610PosColorRepl OfSample NameQ uantification Sample TypeCon centra-tionTarget MameAlSampLe1UnknownA2Unknown直ElSainp Le3Unknownaiv瓏SainpLetUnknownklVClSample5UatencwiiAIVC2S ainp Le 6UnknownAIVPlZBSamp Le7UnknownilVDSamp let；UnknownkTVElSainple?Unk口口聞門A TVE2SampL&8UnknownAIVFlS rumple?

26、UnknownALVT2Sainp LeiOUnknownaivG1S ainp LellUnknownAIVG2aSairip Lel2nhricwnAIVHl口+Positive ControlAIV卜H2ZB一Me gat ive Co nt r:AI7六. 運行實驗實驗程序和樣本均設(shè)置完畢后，即可運行實驗，具體操作：進入“ NewExperime nt”界面，點擊左側(cè)安鈕，如反應(yīng)板已經(jīng)放入儀器，儀器主機正面右側(cè)的LED燈會由桔黃色變?yōu)榫G色，軟件界面右下邊的這時點擊“Start Run ”按鈕，軟件界面跳出一對話框提示用戶給該實驗文件命名，以保存實驗結(jié)果。一般建設(shè)用戶以時間命名，以方便日

27、后查找實驗結(jié)果，如 20080816-HBV-1, 20080817-AIV-2等。命名后點擊確 認鍵，儀器就開始運行了，在運行過程中可觀察到溫度和熒光信號的變化曲線。如進行多重熒光PCR實驗，可在熒光歷史“ Fluoresce nee History界面內(nèi)上的下拉菜單中切換 不同的檢測通道，以分別觀察其擴增情況。在實驗運行過程中，用戶可以根據(jù)需要，點擊 “+ 10 Cycles”按鈕增加正在運行的 程序10個循環(huán)，也可以點擊“End Program ”按鈕終止正在運行的子程序，直接進入下 一個子程序。七. 數(shù)據(jù)分析（定性和定量）ArkAlyRi實驗運行完畢后，點擊界面左側(cè)的按鈕分析數(shù)據(jù)?；蛘?/p>

28、打開LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側(cè)圖標，進入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定之前已完成的實驗文件，點擊下方“ Open”按鈕，或雙擊文件名打開實驗文件，點擊左側(cè) o按鈕，進入分析界面。在“Create new analysiS窗口內(nèi)顯示了可使用的分析方法，在“ Open existing analysis”窗口內(nèi)顯示已經(jīng)進行分析的結(jié)果內(nèi)容。要進行定性和定量分析可以選擇 Abs Qua nt分析功能，其有兩種分析模式，2nd Derivative Max二階最大求導(dǎo)法和Fit Points點擬合法。選定分析功能類型后會跳出對話 框，用戶可以自行選擇分析類型、選擇要

29、分析的亞組（Subse），以及命名分析結(jié)果（Name）。點擊“/按鈕確認。在 An alysis 界面中選擇 Abs Qua nt/ 2nd Derivative Max，點擊“ Calculate” 按鈕，生 成Cp值，如實驗中有標準品，則同時生成標準曲線，并且計算出各未知樣本的濃度值。 該方法在反應(yīng)體系優(yōu)化得比較成熟，信號噪音比較低時使用較好。Iiwtrnwieni： Vlniil LiqktCWr 96 $ Nev GjnnflOs叩訓(xùn)* |nrinci Ah fluapi wish SYHR finrnvi IExprri*wrritAn-dlyltS b 艸mJ: 二口cl Dexi

30、v at ive 自elkInigfiriiM 州非SulisLEtlrbsiEditorMO旦7|t丄7 AMMTehllH鬥即X 吋-亠亠丁7廠廠廠廠廠廠廠匚口Xtt FFFFffFFFFFfTFT 匚廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠 L廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠 L.ill KrlrtJMi-j-Ljq 1 Hf|帀匚口Rd 帥11 R7lBiBL_ 1 .*UJJF 卡 FFFI I rrrr IJj 廠廠廠廠廠廠廠廠I rnrrrrrrhz-5 O.iaiit refu.lt s OtiiUw 1 H 殲鋼* Sruhdini用:AdlininU4l13 24114 24192i14JMr

31、|-O.T1 S3tv)dlsirl CurveCfllEzulalE口劃切Mfy Computer (TigqSid CunrtrAwplificUHi Gurv39 J* Igrxfl.OnsCfEserty9301Eh.QHDri-wac-pt orooUnk 0.QK、制&価It叫有時從原始熒光曲線能觀察到有個別樣本的曲線不正常，信號噪音比較高，則可選 用Fit Points點擬合法加以人工調(diào)整。具體操作如下：在 An alysis 界面中選擇 Abs Qua nt/ Fit Poi nts，在“ Cycle Rang6中 First Cycle 和 Last Cycle兩欄分別設(shè)置分

32、析數(shù)據(jù)的起始和終止循環(huán)數(shù)。選定具體數(shù)據(jù)后，軟件只分析該 區(qū)間內(nèi)的實驗曲線?！?Background” 一欄設(shè)置熒光信號本底的區(qū)域，一般將熒光值呈S形曲線增長前趨于水平的循環(huán)區(qū)域作為背景本底區(qū)。點擊“ Noise Band按鈕，上下移動紅色的噪音本底線來消除個別樣本由于信號噪音 較高而對結(jié)果造成的影響。一般將紅線置于盡可能低，但又要足以蓋過陰性線和曲線不 平的噪音線，與熒光信號曲線交于線性增長區(qū)。軟件只分析紅色噪音本底線上方的曲線 數(shù)據(jù)，所以要確保其上方無曲折不平的噪音信-lojxOaitahwe- 聊 Compirter (TrmUver：AdminU p ma Ah i Quanfl vii

33、h W1R Gienn I Lh_jNCYjur?4eOSuhvwrri：mhMW L,IU(npHiem： Vlnijl Lq htCyclw 4flO 96 * Nd ConnerTeirfWiriduiw-點擊“ Analysis”按鈕，再點擊“ Threshold按鈕，使用顯示“ Auto ”字樣，然后點Calculate擊下方按鈕，生成各樣本的CP值。若是定量分析，則會生成各標準曲線，以及各樣本的濃度值。二圖標，將分析結(jié)果保存入實驗文件，或在目錄樹中另找保存位點擊軟件右側(cè)的 置。在進行多色熒光PCR實驗時，同時使用相鄰兩個檢測通道進行檢測需要通過顏色補 償功能來校正相鄰?fù)ǖ赖臒晒庑盘?/p>

34、干擾，詳見顏色補償一章。八. 報告生成打開一個分析完結(jié)果的文件，或者剛分析完結(jié)果并貯存后，點擊左側(cè)工具欄中Riipopi：按鈕，進入結(jié)果報告的界面?？稍凇癎en era”和“ Detailed ”兩欄中選擇實驗報告 所要包含的內(nèi)容。“ Gen era” 一欄中顯示的選項為本次實驗結(jié)果均需要顯示的報告參 數(shù)；“ Detailed” 一欄則顯示本次實驗多次分析中所要的報告參數(shù)的明細。點擊“ Gen erate按鈕，生成報告預(yù)覽。點擊右上方“ PDF”按鈕可將報告保存為*pdf文 件。報告顯示所包括的內(nèi)容可以保存成模板文件，同類報告要求的實驗可以調(diào)用相同的報告模板。在“ Genera”和“ Deta

35、iled”兩欄中選定了內(nèi)容后點擊下方Applyv|As ：側(cè)的下拉箭頭，點擊“ Save As Template將其保存至Templates/Report Templates目錄 下，點擊“/按鈕確認。調(diào)用報告模板時點擊“ Apply Template ”按鈕，選定模板文 件，點擊“V”按鈕確認。九. 數(shù)據(jù)導(dǎo)出與導(dǎo)入該軟件所產(chǎn)生的實驗數(shù)據(jù)均保存在其自帶的數(shù)據(jù)庫中，從Win dows操作系統(tǒng)中無法找到其實驗數(shù)據(jù)的文件。這樣可以很好地保護實驗文件不被誤刪和竊取。如用戶希望將 實驗結(jié)果備份保存，可以將數(shù)據(jù)從數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出生成可見的文件，保存于其它電腦中或 本電腦的其它目錄下。同時，也可以將實驗文件導(dǎo)入

36、數(shù)據(jù)庫查看文件內(nèi)容或?qū)ξ募M行 分析。導(dǎo)出單個實驗文件的方法：打開 LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側(cè)圖標,進入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定實驗文件，點擊下方 按鈕，選擇保存文件的目錄位置，點擊“ Save”按鈕將文件導(dǎo)出。導(dǎo)出整個文件夾中所有文件的方法：打開LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側(cè) 圖標，進入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定要導(dǎo)出文件所在的文件夾，點 擊軒町按鈕，在“ Select FolderS 欄中選定保存預(yù)導(dǎo)出文件的目錄，點擊 按鈕，將所要導(dǎo)出的文件目錄均選至右側(cè)對話框，點擊勿進入“ Target”界面，點擊“ Br

37、owse ”按鈕選定導(dǎo)出的文件所要存放的目錄，點擊“Next ”按鈕進入“Opti ons”界面，去除不需要導(dǎo)出的文件前的“V”，用戶也可設(shè)定導(dǎo)出文件的限制。 點擊“Next”按鈕，進入“ Start”界面，點擊“ Next”按鈕，軟件顯示文件導(dǎo)出的過程和狀態(tài)，完成后進入“ Done”界面，顯示導(dǎo)出文件的報告。點擊“ Done”按鈕確認導(dǎo)入單個文件的方法：打開LightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側(cè)圖標,進入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定實驗文件，點擊下方“Import”按鈕，選定所要導(dǎo)入的文件，點擊“ Open”按鈕，即導(dǎo)入該文件導(dǎo)入整個文件夾中所有文件的方法：打開L

38、ightCycler480軟件，成功登錄后點擊右側(cè)匡圖標，進入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定實驗文件，點擊下方“BatchImport”按鈕，進入“ Source”界面，點擊“ Add”按鈕選定待導(dǎo)入的文件所在的文件 夾，點擊“ Next”按鈕，進入“ Target”界面，選定放置導(dǎo)入文件的文件夾，點擊“Next”按鈕進入“ Start”界面，點擊“ Next”按鈕，進入“ Status ”界面，開始導(dǎo)入 文件，最后進入“ Done”界面，生成導(dǎo)入文件報告，點擊“ Done確認。十.單點定標同一種同一批號的試劑盒以相同的反應(yīng)程序進行多輪定量檢測實驗時，無須每次都 做四至五個標準品來

39、作標準曲線。第一輪檢測實驗成功完成后，可以將該實驗產(chǎn)生的標 準曲線保存下來，下一輪檢測實驗時，只需選與第一輪實驗對應(yīng)的一種濃度的標準品參 與實驗即可。在分析數(shù)據(jù)時可以調(diào)用第一輪的標準曲線進行定量。標準曲線的保存：使用四至五個標準品以及多個未知樣本進行檢測實驗后，分析數(shù) 據(jù)，最終得到數(shù)據(jù)結(jié)果后，點擊標準曲線下方“Std Curve (In run) ”右側(cè)下拉前頭、孚口 tasI：. .flirltnHjl.1 上 1Lis 昭 Fffltray，選中 Save as external選項。命名標準曲線，并將其保存于 SpecialDataStd Curve文件夾下，點擊“V”按鈕確認已有標準曲

40、線的調(diào)用：在使用單點定標的檢測實驗中，所選用的一個標準品仍然定 義為“ Standard類型，并且其濃度在已有的標準曲線濃度范圍之內(nèi)。在分析數(shù)據(jù)時，一 開始無標準曲線生成，點擊“ Sta ndard Curve(ln Ru n”按鈕右側(cè)下拉箭頭，選中“ Std Curve(external)”選項，雙擊所要調(diào)用的標準曲線文件，點擊“Calculate”按鈕，即可調(diào)用先前實驗中的標準曲線進行本次實驗的定量分析。注意：保存標準曲線文件時所采用的分析模式必須與調(diào)用標準曲線時的分析模式 致才能成功調(diào)用標準曲線。十一.相對定量實驗設(shè)計和分析進行相對定量實驗時要注意，一般而言，每個樣本均做三個重復(fù)，以得到

41、標準誤的 數(shù)據(jù)，進行相對定量實驗時樣本編輯最關(guān)鍵，樣本編輯正確了，分析數(shù)據(jù)完全可以一鍵 完成。1、相似相對定量所謂相似相對定量是指默認看家基因和靶基因這兩對引物的PCR擴增效率均為2.00時進行的相對定量的算法，其主要是以 Cp值的差值來推算濃度的差異。PCR手冊規(guī)定， 靶基因和看家基因這兩對引物的 PCR擴增效率差異不超過0.1的情況下，可進行相似相 對定量計算，看一下某基因 mRNA水平表達量變化的趨勢，如果其擴增效率差異超過 0.1,則不能使用相似相對定量算法(否則在很多期刊發(fā)文章時會被要求補實驗或重新做 定量實驗)。出現(xiàn)這種情況時，方法一：重新設(shè)計引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，使擴增效率差 異小

42、于0.1;方法二：采用準確相對定量算法，見下第 2進行相似相對定量時，可同時設(shè)定多個靶基因跟同一個看家基因進行比較。如下Subset后，點擊圖：三個樣本，分別用一個看家基因Referenee Gene兩個不同靶基因Target A和TargetB進行相對定量。在建立了含有所有本次實驗中檢測樣本孔位的鈕，在Rel Qua nt相對定量界面內(nèi)設(shè)置樣本信息1! 03ColarUepl 01Sample NameCoimbined Sample and Target Typ包CoricenitratiDril arge! blametHidencyJlIAL芻amp LeilieE P 3C a LI

43、Lti r atd reTerer.ce Gen=z.na12il.LS：3mp Leikef PosCs1ihraterteerercfe Gena2-OQA3ALS-smplelRef PosCaLUaratcrPfiiereRce Gene203AlSampLeSRa UnJmownGene2：. 00A5刖畑1upRef UnSaiovaS.cfcrcr;c;c.2,0DASSzuup leiRe. CTnkiLuircjReei_eiic：e Gen=2.03A7S-5tni Le3FJ.eC UnFtnownReference Gen=2.05ASRer oni-oiounel e

44、rer.ee Gen=Z,03ii.7Samp le3Ret UnknoirnSefereirep Gene2roaA.1QNUV.-fgatPsf金 口曇2,Q0AILUJCMCRcE Has口ti京口*=fercnac Gens2.00A12AIDNCRef Me gatIveeEEuec C-cn2,0331BLSsiuple.1Target PosCalibj aLtor:T=ll get Gene, k2.01332EL3：=iinplel7arge匸 Fos匚且丄IUiim匸cu:Taxae匸 Geiie kz.ooBLTarget PoscalIbratorTarget Gene

45、 AB4R41 2ghiJPt TTmEamnT卡 g兀 Gpm- HBSE斗Simp L*2Tftirget UnteneirnTarget G暢垃舊A.2.0IJ36B4Target UnknaunTarget Gene A2,03 7B7S-snap Le3Target UnfcaotrnTarget Gene k2.033BB7ScLLupleSTarget UnkuiaunTmr get 3LuplelTarget PosCa 1 ibi:a*oizT-sr get Geiie. Ba.onC3CLS-aunplelTarget PosCa 1 ib.EatgrTax get Gen

46、e B2. COClCl丁二口匚 t UnJcciounT-mqcC Gunc B2.0UC5C4弐Tairaei. unJcrwunTaircfec oene BZ. 00C6S-amp le2larger Un Jr no wnTarget Gene- B2 * DOC7c?Target UnJEavnT-argstB2. & jCBC7 zmp LsSTarget UaknaTrnTar get Cene B2.013C9C?SSiYjp Le2Target UaknairnTer get Gene. B2.00CIOCIONC丁 sir ere t Necrot ivcT-ar qet

47、 Gems B3.03C1LCIONCTaraet- Ifca-at IveTax lt Gene DZ.,00CIScirNCNp(jritiveTar gee flene B3.00在Repl of 一欄中填寫其所要重復(fù)試驗的樣本的座標號，如在A2和A3位進行A1位樣本的兩次重復(fù)試驗，則在 A2和A3位的Repl of 一欄填寫A1即可。在Sample Nam欄填寫樣本名，注意，只要是加同一模板的反應(yīng)孔位，均給其命 名為相同的樣本名。例如A1、B1、C1孔位，雖然是用不同的引物分別擴增不同的基 因，但所加的樣本模板是相同的，所以在 Sample Name一欄中填寫相同的樣本名，可以 用鍵盤

48、“ Ctrl+C”復(fù)制Referenee Gen啲樣本名，然后用鍵盤“ Ctrl+V”粘貼至Target Gene A和Target Gene B的樣本名中，以確保所命名一致。另外，一定要設(shè)置陰性對照實驗組，即其它反應(yīng)體系均不變，只是不加PCR模板的質(zhì)控，一般命名為NC或NTC(No Template Control )在Sample Type一欄中分別選擇各樣本的不同類型?？醇一虻臋z測孔位均選擇帶 有Referenee的類型，靶基因的檢測孔位均選擇帶有Target的類型，如上圖。其中將Sample1的類型選為Calibrator即標準樣本，在相對定量計算時，其它樣本均與該標準樣 本進行比較

49、，以得到基因表達量更多或更少的數(shù)據(jù)。一般可以將實驗中的空白對照樣本 選為標準樣本，例如用不同的藥物 A、B、C處理一批細胞，其它有一批細胞是正常培養(yǎng)，沒有處理的，則沒有用藥物處理的細胞可設(shè)為標準樣本Calibrator,其它用藥組樣本均與該樣本進行比較。而這些處理組的樣本類型均可以選定為Unkown，檢測看家基因的孔位類型選為Referenee Unknown,檢測靶基因的孔位類型選為 Target Unknown。陰性對 照樣本可根據(jù)其所用引物的不同選定類型為Referenee Negative和Target Negative在Target Name一欄中填寫檢測的基因名，如以 B-aetin作為看家基因的話，在所有 看家基因樣本的Target Name一欄均填寫B(tài)-aetin;而靶基因以此類推，如上圖。Effieiency默認為2.00。將以上樣本編輯完成后，設(shè)置 PCR反應(yīng)程