lc480-software1.5中文說明書維護(hù)sop--3-10講解學(xué)習(xí)

1、LightCycler480 熒光定量 PCR 儀操作規(guī)程1 每次反應(yīng)最后一步都必須做降溫，降至 40 度，維持至少 30 秒。 2在操作過程中，切忌戴有粉末的乳膠手套接觸光學(xué)透性封板膜。3試劑加完樣，封膜完畢后， 在板式離心機(jī)中1500X g (3000rpm )離心兩分鐘，以排 除氣泡。4先開電腦在開儀器，先關(guān)儀器再關(guān)電腦。打開總電源，打開連接LightCycler480 熒光定量 PCR 儀的電腦，并打開 LightCycler480 Software 軟件，然后打開 LightCycler480 儀 器后方的電源開關(guān)，此時(shí)儀器會(huì)在與電腦軟件接通后進(jìn)行自檢，儀器正面右邊兩盞桔黃 色的燈會(huì)

2、閃爍。自檢完畢后，左邊的燈會(huì)變綠，右邊的燈仍為桔黃色。這時(shí)按一下燈右 邊帶雙箭頭的開關(guān)，儀器的載板器會(huì)自動(dòng)伸出，將準(zhǔn)備好的反應(yīng)板放入載板器中( 反應(yīng) 板的切角方向應(yīng)與載板器的切角方向相應(yīng)才能將反應(yīng)板正確放入，切勿用裸手接觸反應(yīng) 板的光學(xué)透性封板膜 )。再按一下帶雙箭頭的開關(guān)，儀器的載板器會(huì)自動(dòng)縮入儀器內(nèi)， 此時(shí)儀器能自動(dòng)檢測(cè)到反應(yīng)板，原來呈桔黃色的燈會(huì)變綠， LightCycler480 Software 中 Start Run按鈕也同時(shí)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。5. 設(shè)定完實(shí)驗(yàn)程序并編輯完樣本后，點(diǎn)擊軟件中Start Run按鈕，運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。6. 軟件界面上出現(xiàn)Run Complete.標(biāo)識(shí)時(shí)，說明實(shí)驗(yàn)運(yùn)

3、行完畢，按一下儀器上帶雙箭 頭的按鈕，使載板器伸出，取下反應(yīng)板，再按一下帶雙箭頭的按鈕，使載板器縮回，關(guān) 閉 LightCycler480 儀器后方的電源開關(guān)，在電腦上分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。7. 分析完實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后保存結(jié)果，打印報(bào)告，并關(guān)閉電腦，關(guān)閉總電源。實(shí)驗(yàn)員在離開PCR擴(kuò)增區(qū)時(shí)帶走用完的反應(yīng)板。維護(hù) SOPLightCycler 480 是一臺(tái)免維護(hù)的儀器。 做任何維護(hù)工作前，須確認(rèn)主機(jī)電源已被關(guān)閉。預(yù)防性維護(hù)：1檢查 LightCycler 480 主機(jī)兩側(cè)與背后空間，確保無任何阻礙空氣流通的物品，包 括書本、紙張或其他任何物品；2若主機(jī)表面和桌面有灰塵，用不起毛的軟布蘸少量清水擦拭干凈。清潔性

4、維護(hù)：若有需要，可用性質(zhì)溫和的商品化清潔劑或70的乙醇溶液對(duì) LightCycler 480 主機(jī)表面、熱循環(huán) 96 孔模塊和熱蓋進(jìn)行清潔。清潔 96 孔熱循環(huán)模塊：1. 用移液器移取125 70 %乙醇溶液或異丙醇至所有孔內(nèi)；2. 1 5分鐘后，使用移液器對(duì)孔內(nèi)溶液進(jìn)行多次吹洗；3. 移除孔內(nèi)的液體，并使 96孔模塊孔內(nèi)自然風(fēng)干；注意操作時(shí)不要讓清洗液腐蝕熱循環(huán) 模塊的涂層。LightCycler480 Software 1.5 軟件操作（中文版）第一部分基本界面及圖標(biāo)概述:Overview 界面Eli Iuuni l MasLuMiMDdLightCycler?480 Software r

5、elease 1.5.0VttHM 1 5.坤AlExit :關(guān)閉LC480軟件Log off :從目前使用的數(shù)據(jù)庫中退出并可登陸其他的數(shù)據(jù)庫Overview :點(diǎn)擊該圖標(biāo)進(jìn)入“ Overview ”界面Navigator :點(diǎn)擊該圖標(biāo)進(jìn)入“ Navigator ”界面，可進(jìn)行數(shù)據(jù)的導(dǎo)入導(dǎo)出等操作,詳見 OOOOOOSave：點(diǎn)擊該圖標(biāo)進(jìn)行保存Export :導(dǎo)出當(dāng)前打開的文件Close：關(guān)閉當(dāng)前打開的文件Print :打印當(dāng)前打開的窗口Tools:打開“ Tools”界面，可進(jìn)行密碼修改，建立和編輯用戶，系統(tǒng)設(shè)置，查看 數(shù)據(jù)庫狀態(tài)、儀器狀態(tài)、濾光片組合等操作Help :查看軟件版本，操作說明

6、書等、New Experiment 界面WiRderir肓冥Irrm畠卻“hum HawfltU切PcaTHnPnjqnim NiMHSiiiinl K-：il ienfRua Wc*CfrchEGAaatyis Mode:M 口 Bfl LiijlitCpcJcE JiA|訕.Iratrijlii8iruiiipi1: Vpnyil I 術(shù)刷誕加HOi W 餉海m i N1 C*itii*Gt40曲6 Mf Caourfii肝血rt|atVteji Izg亠tep Deli aylr hoa：ao：oi:忙勺QD護(hù):Run Module :編輯、運(yùn)行或查看 PCR程序及查看PCR實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)Su

7、bset Editor :點(diǎn)擊該模塊后可進(jìn)行子集的編輯S-am pieEdiiarSample Editor :點(diǎn)擊后進(jìn)行樣品信息的編輯Arztysis|Analysis Module:點(diǎn)擊進(jìn)行結(jié)果分析或查看已保存的分析結(jié)果D4IL1Report Module :選擇需要的內(nèi)容以報(bào)告的形式給出結(jié)果Summary Module :查看實(shí)驗(yàn)的總體概況，包括實(shí)驗(yàn)名稱，所用的程序，檢測(cè)模 式，濾光片組合等。概況的內(nèi)容由系統(tǒng)自動(dòng)生成Navigator 界面| NvwRHMDlMlImport :導(dǎo)入一個(gè)文件 Export :導(dǎo)出一個(gè)文件Batch Import :導(dǎo)入一批數(shù)據(jù) Batch Export

8、:導(dǎo)出一批數(shù)據(jù)New：新建一個(gè)實(shí)驗(yàn)或文件夾New Folder :新建一個(gè)文件夾Open:打開一個(gè)文件Ren ame:重命名Delete：刪除選中的目標(biāo)Copy:拷貝選中的目標(biāo)Note :所有上述圖標(biāo)在深藍(lán)色時(shí)為激活狀態(tài)，灰色時(shí)為滅活狀態(tài)也就是不可用狀態(tài) 各圖標(biāo)的功能在不同狀態(tài)下以顏色來區(qū)分是否具備。軟件操作打開軟件打開電腦，Windows操作系統(tǒng)的用戶名為operator，密碼為L(zhǎng)C480 (區(qū)分大小寫)，電腦操作系統(tǒng)啟動(dòng)完畢，檢查電腦右下角是否有圖標(biāo)。如果沒有，點(diǎn)擊桌面“Exor4 for XDMS_R ”快捷方式文件。然后右鍵點(diǎn)擊 守圖標(biāo)，左鍵點(diǎn)擊“ Show” 一欄，如最后一句話顯示“

9、 Exor 4 server is running”表示數(shù)據(jù)庫加載成功。如果顯示“ Exor4 failed to start”則表示數(shù)據(jù)庫沒有加載上，關(guān)閉該窗口，右鍵點(diǎn)擊劉圖標(biāo)，選“Shutdown” 一欄，退出數(shù)據(jù)庫，重新點(diǎn)擊桌面“ Exor4 for XDMS_T ”文件，加載數(shù)據(jù) 庫。然后點(diǎn)擊桌面“ LightCycler480 Software”快捷方式文件，運(yùn)行該軟件。輸入用戶名和密碼。用戶名默認(rèn)為 admin (管理者權(quán)限)，密碼為L(zhǎng)ightCycler480 (區(qū)分 大小寫)，如用戶已經(jīng)建立新用戶名，則可以按照新用戶名登錄。二. 用戶管理為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效管理，可以建立不同級(jí)別

10、的用戶。如：標(biāo)準(zhǔn)用戶(Sta ndard Use)、專業(yè)用戶(Expert User)、管理者(LocalAdministrator)。一般實(shí)驗(yàn)室建議建立專業(yè)用戶(Expert User)用戶名，然后以該用戶名 登錄軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。建立新用戶操作：打開LightCycler480操作軟件，點(diǎn)擊右側(cè)匚按鈕打開“ Tools” 工具欄，選擇“ User Access/Users and Groups選項(xiàng)。在右邊窗口中點(diǎn)擊“ New User” 鍵，在右邊“ Enter the users full name” 一欄中填寫用戶的全名，在“”Enter the namethe user wants

11、to log in as 一欄填寫用戶登錄名，在“ Enter the users password 一欄中輸 入密碼(密碼須含有6個(gè)以上字母，1個(gè)以上數(shù)字，其中有至少一個(gè)字母大寫)，在“Confirm the password 一欄中重新輸入一次密碼，加以確認(rèn)，在“Select the user srole” 一欄中選擇用戶級(jí)別，然后點(diǎn)擊右下方“ Close”按鈕加以確認(rèn)。在G “ Tools”工具欄中的“ System Sett in gs界面中可以設(shè)置各用戶級(jí)的權(quán)限, 以及密碼的時(shí)效。三. 儀器自檢每次開機(jī)時(shí)，儀器會(huì)自動(dòng)進(jìn)行初始化自檢程序。自檢通過，儀器左側(cè)指示燈變綠。 如放置了樣本，儀

12、器右側(cè)指示燈變綠。在自檢時(shí)，不能放置反應(yīng)板，否則自檢無法通 過。四. 建立實(shí)驗(yàn)程序打開LightCycler480操作軟件，成功登錄后點(diǎn)擊 按鈕，進(jìn)入 New Experiment/Run Protocol程序設(shè)置界面。在“ Detection Format” 一欄中選擇所使用的熒光檢測(cè)技術(shù)，可選擇各類探針和染料，如常見的SYBR Green I染料、Mo no ColorHydrolysis Probe單色 TaqMan 水解探針、Multi Color Hydrolysis Probe 多色 TaqMan 水解-Setu p探針。Datectioon Format I Bule iColo

13、r HydrolysisPrctoJ在進(jìn)行多色熒光PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，須點(diǎn)擊更巫5按鈕選擇用戶所采用的熒光檢測(cè)通道, 點(diǎn)擊“V”確認(rèn)。在Reaction Volume 20欄中填寫反應(yīng)體積。在“ Programs界面中設(shè)置實(shí)驗(yàn)程序：在“ Program Name下方命名程序，“ Cycles ” 一欄內(nèi)填寫該程序的循環(huán)數(shù)，在“ Analysis Mode ”一欄選擇該程序的分析模式。定量分 析選擇“ Quantification”，溶解曲線分析選擇 “Melting Curves，顏色補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)選擇“ Color Compe nsation”。而后在“ Temperature Targets ”界面內(nèi)

14、設(shè)置所指定程序的內(nèi)容，在“ Target( C)處填寫目標(biāo)溫度，“ Acquisition Mode ”處選擇信號(hào)采集方式，“ Hold”一欄填寫該溫度 所持續(xù)的時(shí)間，“ Ramp Rate(C/s)”處填寫升降溫速率(注：如目標(biāo)溫度為50C以下時(shí)，為了減少硬件的損耗，必須將降溫速率調(diào)至1.5C/s以下)。如一個(gè)程序有多個(gè)步增加步驟；也可點(diǎn)擊上下箭頭驟，則在Temperature Targets 界面的左側(cè)處點(diǎn)擊蘭調(diào)整各步驟的先后順序。如一個(gè)實(shí)驗(yàn)中有多個(gè)程序，也可在“Programs界面左側(cè)點(diǎn)擊，增加程序，也可點(diǎn)擊上下箭頭調(diào)整各程序的先后順序。實(shí)驗(yàn)程度設(shè)置完成后，在下方“ Overview ”

15、界面內(nèi)會(huì)自動(dòng)生成溫度隨時(shí)間變化的溫 控曲線，以及估計(jì)的運(yùn)行時(shí)間，綠色點(diǎn)表示采集熒光信號(hào)的溫度和時(shí)間點(diǎn)。可以依照該 圖檢查一下程度設(shè)置是否正確。kradiumerit:Vlnudiittll 監(jiān) 主樺出m A； Mol QinnedEtllDdldibdse! Cdimipiidtr fhfstdiLJtlUMF!S停gm Adminr(rtor Comp IPliuti-Setup 一Oepctiwri Fnunair | Brill：.丄H羅血燈丄夕弓活 FtuB 討 CuxiomuSlock Si zeFl* ID ffteedrioH Vrblume 向I 4 Ma1Cycles押i耳

16、Mrjd gp-deiLa.1 titE腫并tueQyaAtiflectionjjf iii i 引fiJnf1! kfiefttiDTi4Q：|血 WLaq CwcveMQlLmINumPiOrfncHhia.山riNHHk啟tkn TeniperdtuirTryenTrgyt f q他qSite I|imr m|H：57J1U7：33t1 孔剝OOTTO &QE4D.Eid PfiigfriiHijH、* IO1 Cjcilea寶釉n Ault雖1 i設(shè)置好的實(shí)驗(yàn)程序可以保存成模板文件，下次使用同樣的實(shí)驗(yàn)程序時(shí)可以調(diào)用。具|i1S0Swb As體操作如下：點(diǎn)擊按鈕右側(cè)的下拉箭頭，選中“ S

17、ave As Template選項(xiàng)，系統(tǒng)默認(rèn)將實(shí)驗(yàn)程序模板文件保存在所登錄的用戶名下“Templates目錄中，用戶可將其存放在其下的子目錄“ Run Templates下，填寫該程序模板文件的名稱，點(diǎn)擊“V 按 鈕即完成保存。調(diào)用模板程序時(shí)可點(diǎn)擊“ Apply Template ”按鈕，從目錄樹中選定所要調(diào) 用的模板，點(diǎn)擊“V”按鈕確認(rèn)。五. 樣本設(shè)置1樣本亞組編輯：LightCycler480軟件擁有一個(gè)獨(dú)特的樣本編輯管理功能一一亞組編輯 (Subset Editor)，即將反應(yīng)板上所有的樣本根據(jù)用戶需要分成亞組，對(duì)亞組進(jìn)行獨(dú)立地分析定量。具體操作如下：在“ New Experime nt

18、”按鈕新建亞組，并給其命名 所選定亞組的名稱，點(diǎn)擊“界面中，點(diǎn)擊左側(cè)S按鈕，進(jìn)入Subset設(shè)置界面，點(diǎn)擊I丿按鈕可更改Delete按鈕可刪除所選定的亞組。設(shè)置亞組：在Subsets界點(diǎn)擊按鈕可復(fù)制所選定的亞組，點(diǎn)擊面中選定要設(shè)置的亞組名，在右邊反應(yīng)板孔位處選定該亞組所包含的孔位，使所選定的孔位中都出現(xiàn)深蘭色凹陷的，點(diǎn)擊下方I “h 按鈕加以確認(rèn)。 tff Bl hfll巒吧杠好心出也出典UliWiNtirit Ylml LihK.ytier UHJ 料| ? Hir OnMCKiiUMntlow:Sum,hew E gBdiwI一呂 ubBBtSS.wdQfn Ari rainJAI27nE

19、+PC二DEF0IH!Uw:設(shè)置亞組可以在一塊反應(yīng)板上實(shí)現(xiàn)多個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)，前提是這些檢測(cè)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)運(yùn) 行程序都一致（這在使用TaqMan水解探針時(shí)比較容易實(shí)現(xiàn)），由于各檢測(cè)項(xiàng)目均有各 自的質(zhì)控對(duì)照，因而，設(shè)定亞組可以單獨(dú)對(duì)各檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行分析。2 樣本屬性編輯點(diǎn)擊New Experiment界面左側(cè) 實(shí)驗(yàn)方案：SampleC filler按鈕設(shè)置樣本信息。在Workflow ”一欄在選擇Abs Qua nt:絕對(duì)定量或定性分析； Rel Qua nt:相對(duì)定量；Sea nning：基因掃描; Color Comp：顏色補(bǔ)償；Tm:熔解溫度檢測(cè)；Melt Geno：熔解曲線法基因分型; En

20、dpt Ge no：終點(diǎn)法基因分型。-Step 1: Select Workflowr Abs Quant - Rel Ouant C Scanning C Color CompC Tm- Melt Geno C Endpt Geno在Select Samples/Subse選項(xiàng)中選定待編輯的樣本亞組:-Step 2: Select SamplesSubset: HEV samples在界面右方編輯各樣本的名稱屬性等:Pos：樣本在96孔板或384孔板上的座標(biāo)位置；Repl Of :重復(fù)樣本設(shè)置；-AIjs QuantSample Name 樣本名稱； Quantification Sampl

21、e Type： 定量樣本類型； Concentration： 度；Target Name：檢測(cè)類型。-Sele cl f ilier Combinations* jL1卜PosColorRepl OfSample NameQuantificationSample TypeConcentrationTarget NameAlSTDlStandard1.00E2HBVA2STDZStanda匸負(fù)1,00E3BlSTD3Standard1.00E4HBPE2STD4Standard1.00E5HBVClUCM0 gat ive C o n t 匸！丄HB7C2PositivePositive Cen

22、tro丄HBVDiDi5ampLeiUnknownHBVD2DlS amp Le 1UnkncunHBVElVnknQ可口HB712ELSampLe2UnkncunKBVFlFLUnknownHBVT2FlSampLe3UnknownHBV-31JG1SampledTJnlcnawnHB7$G2GLSajpUritenosmHBVBlHlSampledTJnknownH2HLSamp le5Uft.tencwnHB7F 483533 廠 558-610Units |在進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，參與實(shí)驗(yàn)的樣本有標(biāo)準(zhǔn)品（一般4至5個(gè)）、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、未知樣本。各樣本的名稱可參考以上“Sampl

23、e Namd中的命名習(xí)慣（STD表示標(biāo)準(zhǔn)品、NC表示陰性對(duì)照、Positive表示陽性對(duì)照、Sample表示待檢測(cè)的未 知樣本），也可以自行編輯。在“ Qua ntificatio n Sample Type” 一欄內(nèi)需要對(duì)各樣本的類型進(jìn)行明確地編輯（標(biāo)準(zhǔn) 品選Standard類型、陰性對(duì)照選 Negative Control類型、陽性對(duì)照選 Positive Control類 型、未知樣本選Unknown類型），此外標(biāo)準(zhǔn)品系已知濃度的陽性樣本，其設(shè)定為 Sta ndard類型后還需在Co nee ntration 欄中對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)品分別設(shè)定其相應(yīng)的濃度，以及在 Abs Quant/Units填寫

24、框中填寫相應(yīng)的濃度單位，如 copies、pg等。在Target Name一欄中可以填寫該檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所要檢測(cè)的指標(biāo)，如乙肝病毒、禽流感病 毒、沙門氏菌等。如在實(shí)驗(yàn)中需要設(shè)置重復(fù)樣本的，可在Repl Of 一欄中填寫該樣本其所重復(fù)的樣本的座標(biāo)號(hào)（注意，只能填寫座標(biāo)號(hào)，不能填寫樣本名）。如進(jìn)行的是多色熒光 PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，則在Select Filter Combinations欄中選定各檢 測(cè)通道，分別進(jìn)行樣本編輯。在進(jìn)行定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，參與實(shí)驗(yàn)的樣本有陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、未知樣本。設(shè)置 相應(yīng)較簡(jiǎn)單，可參考以下設(shè)置rAbs Quant-Units-Select Filter Combitkaiion

25、sF 48333 r 556-610PosColorRepl OfSample NameQ uantification Sample TypeCon centra-tionTarget MameAlSampLe1UnknownA2Unknown直ElSainp Le3Unknownaiv瓏SainpLetUnknownklVClSample5UatencwiiAIVC2S ainp Le 6UnknownAIVPlZBSamp Le7UnknownilVDSamp let；UnknownkTVElSainple?Unk口口聞門A TVE2SampL&8UnknownAIVFlS rumple?

26、UnknownALVT2Sainp LeiOUnknownaivG1S ainp LellUnknownAIVG2aSairip Lel2nhricwnAIVHl口+Positive ControlAIV卜H2ZB一Me gat ive Co nt r:AI7六. 運(yùn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)程序和樣本均設(shè)置完畢后，即可運(yùn)行實(shí)驗(yàn)，具體操作：進(jìn)入“ NewExperime nt”界面，點(diǎn)擊左側(cè)安鈕，如反應(yīng)板已經(jīng)放入儀器，儀器主機(jī)正面右側(cè)的LED燈會(huì)由桔黃色變?yōu)榫G色，軟件界面右下邊的這時(shí)點(diǎn)擊“Start Run ”按鈕，軟件界面跳出一對(duì)話框提示用戶給該實(shí)驗(yàn)文件命名，以保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一般建設(shè)用戶以時(shí)間命名，以方便日

27、后查找實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如 20080816-HBV-1, 20080817-AIV-2等。命名后點(diǎn)擊確 認(rèn)鍵，儀器就開始運(yùn)行了，在運(yùn)行過程中可觀察到溫度和熒光信號(hào)的變化曲線。如進(jìn)行多重?zé)晒釶CR實(shí)驗(yàn)，可在熒光歷史“ Fluoresce nee History界面內(nèi)上的下拉菜單中切換 不同的檢測(cè)通道，以分別觀察其擴(kuò)增情況。在實(shí)驗(yàn)運(yùn)行過程中，用戶可以根據(jù)需要，點(diǎn)擊 “+ 10 Cycles”按鈕增加正在運(yùn)行的 程序10個(gè)循環(huán)，也可以點(diǎn)擊“End Program ”按鈕終止正在運(yùn)行的子程序，直接進(jìn)入下 一個(gè)子程序。七. 數(shù)據(jù)分析（定性和定量）ArkAlyRi實(shí)驗(yàn)運(yùn)行完畢后，點(diǎn)擊界面左側(cè)的按鈕分析數(shù)據(jù)?；蛘?/p>

28、打開LightCycler480軟件，成功登錄后點(diǎn)擊右側(cè)圖標(biāo)，進(jìn)入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定之前已完成的實(shí)驗(yàn)文件，點(diǎn)擊下方“ Open”按鈕，或雙擊文件名打開實(shí)驗(yàn)文件，點(diǎn)擊左側(cè) o按鈕，進(jìn)入分析界面。在“Create new analysiS窗口內(nèi)顯示了可使用的分析方法，在“ Open existing analysis”窗口內(nèi)顯示已經(jīng)進(jìn)行分析的結(jié)果內(nèi)容。要進(jìn)行定性和定量分析可以選擇 Abs Qua nt分析功能，其有兩種分析模式，2nd Derivative Max二階最大求導(dǎo)法和Fit Points點(diǎn)擬合法。選定分析功能類型后會(huì)跳出對(duì)話 框，用戶可以自行選擇分析類型、選擇要

29、分析的亞組（Subse），以及命名分析結(jié)果（Name）。點(diǎn)擊“/按鈕確認(rèn)。在 An alysis 界面中選擇 Abs Qua nt/ 2nd Derivative Max，點(diǎn)擊“ Calculate” 按鈕，生 成Cp值，如實(shí)驗(yàn)中有標(biāo)準(zhǔn)品，則同時(shí)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且計(jì)算出各未知樣本的濃度值。 該方法在反應(yīng)體系優(yōu)化得比較成熟，信號(hào)噪音比較低時(shí)使用較好。Iiwtrnwieni： Vlniil LiqktCWr 96 $ Nev GjnnflOs叩訓(xùn)* |nrinci Ah fluapi wish SYHR finrnvi IExprri*wrritAn-dlyltS b 艸mJ: 二口cl Dexi

30、v at ive 自elkInigfiriiM 州非SulisLEtlrbsiEditorMO旦7|t丄7 AMMTehllH鬥即X 吋-亠亠丁7廠廠廠廠廠廠廠匚口Xtt FFFFffFFFFFfTFT 匚廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠 L廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠廠 L.ill KrlrtJMi-j-Ljq 1 Hf|帀匚口Rd 帥11 R7lBiBL_ 1 .*UJJF 卡 FFFI I rrrr IJj 廠廠廠廠廠廠廠廠I rnrrrrrrhz-5 O.iaiit refu.lt s OtiiUw 1 H 殲鋼* Sruhdini用:AdlininU4l13 24114 24192i14JMr

31、|-O.T1 S3tv)dlsirl CurveCfllEzulalE口劃切Mfy Computer (TigqSid CunrtrAwplificUHi Gurv39 J* Igrxfl.OnsCfEserty9301Eh.QHDri-wac-pt orooUnk 0.QK、制&価It叫有時(shí)從原始熒光曲線能觀察到有個(gè)別樣本的曲線不正常，信號(hào)噪音比較高，則可選 用Fit Points點(diǎn)擬合法加以人工調(diào)整。具體操作如下：在 An alysis 界面中選擇 Abs Qua nt/ Fit Poi nts，在“ Cycle Rang6中 First Cycle 和 Last Cycle兩欄分別設(shè)置分

32、析數(shù)據(jù)的起始和終止循環(huán)數(shù)。選定具體數(shù)據(jù)后，軟件只分析該 區(qū)間內(nèi)的實(shí)驗(yàn)曲線?！?Background” 一欄設(shè)置熒光信號(hào)本底的區(qū)域，一般將熒光值呈S形曲線增長(zhǎng)前趨于水平的循環(huán)區(qū)域作為背景本底區(qū)。點(diǎn)擊“ Noise Band按鈕，上下移動(dòng)紅色的噪音本底線來消除個(gè)別樣本由于信號(hào)噪音 較高而對(duì)結(jié)果造成的影響。一般將紅線置于盡可能低，但又要足以蓋過陰性線和曲線不 平的噪音線，與熒光信號(hào)曲線交于線性增長(zhǎng)區(qū)。軟件只分析紅色噪音本底線上方的曲線 數(shù)據(jù)，所以要確保其上方無曲折不平的噪音信-lojxOaitahwe- 聊 Compirter (TrmUver：AdminU p ma Ah i Quanfl vii

33、h W1R Gienn I Lh_jNCYjur?4eOSuhvwrri：mhMW L,IU(npHiem： Vlnijl Lq htCyclw 4flO 96 * Nd ConnerTeirfWiriduiw-點(diǎn)擊“ Analysis”按鈕，再點(diǎn)擊“ Threshold按鈕，使用顯示“ Auto ”字樣，然后點(diǎn)Calculate擊下方按鈕，生成各樣本的CP值。若是定量分析，則會(huì)生成各標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及各樣本的濃度值。二圖標(biāo)，將分析結(jié)果保存入實(shí)驗(yàn)文件，或在目錄樹中另找保存位點(diǎn)擊軟件右側(cè)的 置。在進(jìn)行多色熒光PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，同時(shí)使用相鄰兩個(gè)檢測(cè)通道進(jìn)行檢測(cè)需要通過顏色補(bǔ) 償功能來校正相鄰?fù)ǖ赖臒晒庑盘?hào)

34、干擾，詳見顏色補(bǔ)償一章。八. 報(bào)告生成打開一個(gè)分析完結(jié)果的文件，或者剛分析完結(jié)果并貯存后，點(diǎn)擊左側(cè)工具欄中Riipopi：按鈕，進(jìn)入結(jié)果報(bào)告的界面?？稍凇癎en era”和“ Detailed ”兩欄中選擇實(shí)驗(yàn)報(bào)告 所要包含的內(nèi)容?！?Gen era” 一欄中顯示的選項(xiàng)為本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果均需要顯示的報(bào)告參 數(shù)；“ Detailed” 一欄則顯示本次實(shí)驗(yàn)多次分析中所要的報(bào)告參數(shù)的明細(xì)。點(diǎn)擊“ Gen erate按鈕，生成報(bào)告預(yù)覽。點(diǎn)擊右上方“ PDF”按鈕可將報(bào)告保存為*pdf文 件。報(bào)告顯示所包括的內(nèi)容可以保存成模板文件，同類報(bào)告要求的實(shí)驗(yàn)可以調(diào)用相同的報(bào)告模板。在“ Genera”和“ Deta

35、iled”兩欄中選定了內(nèi)容后點(diǎn)擊下方Applyv|As ：側(cè)的下拉箭頭，點(diǎn)擊“ Save As Template將其保存至Templates/Report Templates目錄 下，點(diǎn)擊“/按鈕確認(rèn)。調(diào)用報(bào)告模板時(shí)點(diǎn)擊“ Apply Template ”按鈕，選定模板文 件，點(diǎn)擊“V”按鈕確認(rèn)。九. 數(shù)據(jù)導(dǎo)出與導(dǎo)入該軟件所產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均保存在其自帶的數(shù)據(jù)庫中，從Win dows操作系統(tǒng)中無法找到其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的文件。這樣可以很好地保護(hù)實(shí)驗(yàn)文件不被誤刪和竊取。如用戶希望將 實(shí)驗(yàn)結(jié)果備份保存，可以將數(shù)據(jù)從數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)出生成可見的文件，保存于其它電腦中或 本電腦的其它目錄下。同時(shí)，也可以將實(shí)驗(yàn)文件導(dǎo)入

36、數(shù)據(jù)庫查看文件內(nèi)容或?qū)ξ募M(jìn)行 分析。導(dǎo)出單個(gè)實(shí)驗(yàn)文件的方法：打開 LightCycler480軟件，成功登錄后點(diǎn)擊右側(cè)圖標(biāo),進(jìn)入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定實(shí)驗(yàn)文件，點(diǎn)擊下方 按鈕，選擇保存文件的目錄位置，點(diǎn)擊“ Save”按鈕將文件導(dǎo)出。導(dǎo)出整個(gè)文件夾中所有文件的方法：打開LightCycler480軟件，成功登錄后點(diǎn)擊右側(cè) 圖標(biāo)，進(jìn)入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定要導(dǎo)出文件所在的文件夾，點(diǎn) 擊軒町按鈕，在“ Select FolderS 欄中選定保存預(yù)導(dǎo)出文件的目錄，點(diǎn)擊 按鈕，將所要導(dǎo)出的文件目錄均選至右側(cè)對(duì)話框，點(diǎn)擊勿進(jìn)入“ Target”界面，點(diǎn)擊“ Br

37、owse ”按鈕選定導(dǎo)出的文件所要存放的目錄，點(diǎn)擊“Next ”按鈕進(jìn)入“Opti ons”界面，去除不需要導(dǎo)出的文件前的“V”，用戶也可設(shè)定導(dǎo)出文件的限制。 點(diǎn)擊“Next”按鈕，進(jìn)入“ Start”界面，點(diǎn)擊“ Next”按鈕，軟件顯示文件導(dǎo)出的過程和狀態(tài)，完成后進(jìn)入“ Done”界面，顯示導(dǎo)出文件的報(bào)告。點(diǎn)擊“ Done”按鈕確認(rèn)導(dǎo)入單個(gè)文件的方法：打開LightCycler480軟件，成功登錄后點(diǎn)擊右側(cè)圖標(biāo),進(jìn)入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定實(shí)驗(yàn)文件，點(diǎn)擊下方“Import”按鈕，選定所要導(dǎo)入的文件，點(diǎn)擊“ Open”按鈕，即導(dǎo)入該文件導(dǎo)入整個(gè)文件夾中所有文件的方法：打開L

38、ightCycler480軟件，成功登錄后點(diǎn)擊右側(cè)匡圖標(biāo)，進(jìn)入Navigator導(dǎo)航界面，在目錄樹內(nèi)選定實(shí)驗(yàn)文件，點(diǎn)擊下方“BatchImport”按鈕，進(jìn)入“ Source”界面，點(diǎn)擊“ Add”按鈕選定待導(dǎo)入的文件所在的文件 夾，點(diǎn)擊“ Next”按鈕，進(jìn)入“ Target”界面，選定放置導(dǎo)入文件的文件夾，點(diǎn)擊“Next”按鈕進(jìn)入“ Start”界面，點(diǎn)擊“ Next”按鈕，進(jìn)入“ Status ”界面，開始導(dǎo)入 文件，最后進(jìn)入“ Done”界面，生成導(dǎo)入文件報(bào)告，點(diǎn)擊“ Done確認(rèn)。十.單點(diǎn)定標(biāo)同一種同一批號(hào)的試劑盒以相同的反應(yīng)程序進(jìn)行多輪定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，無須每次都 做四至五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品來

39、作標(biāo)準(zhǔn)曲線。第一輪檢測(cè)實(shí)驗(yàn)成功完成后，可以將該實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的標(biāo) 準(zhǔn)曲線保存下來，下一輪檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，只需選與第一輪實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)的一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品參 與實(shí)驗(yàn)即可。在分析數(shù)據(jù)時(shí)可以調(diào)用第一輪的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的保存：使用四至五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品以及多個(gè)未知樣本進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)后，分析數(shù) 據(jù)，最終得到數(shù)據(jù)結(jié)果后，點(diǎn)擊標(biāo)準(zhǔn)曲線下方“Std Curve (In run) ”右側(cè)下拉前頭、孚口 tasI：. .flirltnHjl.1 上 1Lis 昭 Fffltray，選中 Save as external選項(xiàng)。命名標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將其保存于 SpecialDataStd Curve文件夾下，點(diǎn)擊“V”按鈕確認(rèn)已有標(biāo)準(zhǔn)曲

40、線的調(diào)用：在使用單點(diǎn)定標(biāo)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，所選用的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品仍然定 義為“ Standard類型，并且其濃度在已有的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)。在分析數(shù)據(jù)時(shí)，一 開始無標(biāo)準(zhǔn)曲線生成，點(diǎn)擊“ Sta ndard Curve(ln Ru n”按鈕右側(cè)下拉箭頭，選中“ Std Curve(external)”選項(xiàng)，雙擊所要調(diào)用的標(biāo)準(zhǔn)曲線文件，點(diǎn)擊“Calculate”按鈕，即可調(diào)用先前實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)的定量分析。注意：保存標(biāo)準(zhǔn)曲線文件時(shí)所采用的分析模式必須與調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的分析模式 致才能成功調(diào)用標(biāo)準(zhǔn)曲線。十一.相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析進(jìn)行相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意，一般而言，每個(gè)樣本均做三個(gè)重復(fù)，以得到

41、標(biāo)準(zhǔn)誤的 數(shù)據(jù)，進(jìn)行相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)時(shí)樣本編輯最關(guān)鍵，樣本編輯正確了，分析數(shù)據(jù)完全可以一鍵 完成。1、相似相對(duì)定量所謂相似相對(duì)定量是指默認(rèn)看家基因和靶基因這兩對(duì)引物的PCR擴(kuò)增效率均為2.00時(shí)進(jìn)行的相對(duì)定量的算法，其主要是以 Cp值的差值來推算濃度的差異。PCR手冊(cè)規(guī)定， 靶基因和看家基因這兩對(duì)引物的 PCR擴(kuò)增效率差異不超過0.1的情況下，可進(jìn)行相似相 對(duì)定量計(jì)算，看一下某基因 mRNA水平表達(dá)量變化的趨勢(shì)，如果其擴(kuò)增效率差異超過 0.1,則不能使用相似相對(duì)定量算法(否則在很多期刊發(fā)文章時(shí)會(huì)被要求補(bǔ)實(shí)驗(yàn)或重新做 定量實(shí)驗(yàn))。出現(xiàn)這種情況時(shí)，方法一：重新設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，使擴(kuò)增效率差 異小

42、于0.1;方法二：采用準(zhǔn)確相對(duì)定量算法，見下第 2進(jìn)行相似相對(duì)定量時(shí)，可同時(shí)設(shè)定多個(gè)靶基因跟同一個(gè)看家基因進(jìn)行比較。如下Subset后，點(diǎn)擊圖：三個(gè)樣本，分別用一個(gè)看家基因Referenee Gene兩個(gè)不同靶基因Target A和TargetB進(jìn)行相對(duì)定量。在建立了含有所有本次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)樣本孔位的鈕，在Rel Qua nt相對(duì)定量界面內(nèi)設(shè)置樣本信息1! 03ColarUepl 01Sample NameCoimbined Sample and Target Typ包CoricenitratiDril arge! blametHidencyJlIAL芻amp LeilieE P 3C a LI

43、Lti r atd reTerer.ce Gen=z.na12il.LS：3mp Leikef PosCs1ihraterteerercfe Gena2-OQA3ALS-smplelRef PosCaLUaratcrPfiiereRce Gene203AlSampLeSRa UnJmownGene2：. 00A5刖畑1upRef UnSaiovaS.cfcrcr;c;c.2,0DASSzuup leiRe. CTnkiLuircjReei_eiic：e Gen=2.03A7S-5tni Le3FJ.eC UnFtnownReference Gen=2.05ASRer oni-oiounel e

44、rer.ee Gen=Z,03ii.7Samp le3Ret UnknoirnSefereirep Gene2roaA.1QNUV.-fgatPsf金 口曇2,Q0AILUJCMCRcE Has口ti京口*=fercnac Gens2.00A12AIDNCRef Me gatIveeEEuec C-cn2,0331BLSsiuple.1Target PosCalibj aLtor:T=ll get Gene, k2.01332EL3：=iinplel7arge匸 Fos匚且丄IUiim匸cu:Taxae匸 Geiie kz.ooBLTarget PoscalIbratorTarget Gene

45、 AB4R41 2ghiJPt TTmEamnT卡 g兀 Gpm- HBSE斗Simp L*2Tftirget UnteneirnTarget G暢垃舊A.2.0IJ36B4Target UnknaunTarget Gene A2,03 7B7S-snap Le3Target UnfcaotrnTarget Gene k2.033BB7ScLLupleSTarget UnkuiaunTmr get 3LuplelTarget PosCa 1 ibi:a*oizT-sr get Geiie. Ba.onC3CLS-aunplelTarget PosCa 1 ib.EatgrTax get Gen

46、e B2. COClCl丁二口匚 t UnJcciounT-mqcC Gunc B2.0UC5C4弐Tairaei. unJcrwunTaircfec oene BZ. 00C6S-amp le2larger Un Jr no wnTarget Gene- B2 * DOC7c?Target UnJEavnT-argstB2. & jCBC7 zmp LsSTarget UaknaTrnTar get Cene B2.013C9C?SSiYjp Le2Target UaknairnTer get Gene. B2.00CIOCIONC丁 sir ere t Necrot ivcT-ar qet

47、 Gems B3.03C1LCIONCTaraet- Ifca-at IveTax lt Gene DZ.,00CIScirNCNp(jritiveTar gee flene B3.00在Repl of 一欄中填寫其所要重復(fù)試驗(yàn)的樣本的座標(biāo)號(hào)，如在A2和A3位進(jìn)行A1位樣本的兩次重復(fù)試驗(yàn)，則在 A2和A3位的Repl of 一欄填寫A1即可。在Sample Nam欄填寫樣本名，注意，只要是加同一模板的反應(yīng)孔位，均給其命 名為相同的樣本名。例如A1、B1、C1孔位，雖然是用不同的引物分別擴(kuò)增不同的基 因，但所加的樣本模板是相同的，所以在 Sample Name一欄中填寫相同的樣本名，可以 用鍵盤

48、“ Ctrl+C”復(fù)制Referenee Gen啲樣本名，然后用鍵盤“ Ctrl+V”粘貼至Target Gene A和Target Gene B的樣本名中，以確保所命名一致。另外，一定要設(shè)置陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，即其它反應(yīng)體系均不變，只是不加PCR模板的質(zhì)控，一般命名為NC或NTC(No Template Control )在Sample Type一欄中分別選擇各樣本的不同類型?？醇一虻臋z測(cè)孔位均選擇帶 有Referenee的類型，靶基因的檢測(cè)孔位均選擇帶有Target的類型，如上圖。其中將Sample1的類型選為Calibrator即標(biāo)準(zhǔn)樣本，在相對(duì)定量計(jì)算時(shí)，其它樣本均與該標(biāo)準(zhǔn)樣 本進(jìn)行比較

49、，以得到基因表達(dá)量更多或更少的數(shù)據(jù)。一般可以將實(shí)驗(yàn)中的空白對(duì)照樣本 選為標(biāo)準(zhǔn)樣本，例如用不同的藥物 A、B、C處理一批細(xì)胞，其它有一批細(xì)胞是正常培養(yǎng)，沒有處理的，則沒有用藥物處理的細(xì)胞可設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)樣本Calibrator,其它用藥組樣本均與該樣本進(jìn)行比較。而這些處理組的樣本類型均可以選定為Unkown，檢測(cè)看家基因的孔位類型選為Referenee Unknown,檢測(cè)靶基因的孔位類型選為 Target Unknown。陰性對(duì) 照樣本可根據(jù)其所用引物的不同選定類型為Referenee Negative和Target Negative在Target Name一欄中填寫檢測(cè)的基因名，如以 B-aetin作為看家基因的話，在所有 看家基因樣本的Target Name一欄均填寫B(tài)-aetin;而靶基因以此類推，如上圖。Effieiency默認(rèn)為2.00。將以上樣本編輯完成后，設(shè)置 PCR反應(yīng)程