從動物肝組織中分離提取純化和鑒定一種酶課件

1、從動物肝組織中分離提取純化和鑒定一種酶1 組員：孫鶴、林哲閩、姜 運秋、吳麗媛 從動物肝組織中分離提取純化和鑒定一種酶2 目的酶：由三種不同的亞基組成，目的酶：由三種不同的亞基組成， 為結合酶，為結合酶，pl=6.2 pl=6.2 從動物肝組織中分離提取純化和鑒定一種酶3 l 機械破碎法機械破碎法 粗處理時可將肝臟用剪刀剪成小塊粗處理時可將肝臟用剪刀剪成小塊 使用勻漿法時應先將大塊的組織或者細使用勻漿法時應先將大塊的組織或者細 胞團用組織搗碎機或研磨器械搗碎分散。胞團用組織搗碎機或研磨器械搗碎分散。 物理破碎法：凍融法、滲透壓法和超聲波物理破碎法：凍融法、滲透壓法和超聲波 破碎法均可。破碎法均

2、可。 使用凍融法應注意不能在過高的溫度使用凍融法應注意不能在過高的溫度 下操作，以免引起酶的變性失活。下操作，以免引起酶的變性失活。 化學破碎法：常用的化學試劑有：化學破碎法：常用的化學試劑有： 有機有機 試劑試劑 表面活性劑表面活性劑 螯合劑等。他們螯合劑等。他們 都可以增加細胞膜的通透性，使酶容易都可以增加細胞膜的通透性，使酶容易 釋放。釋放。 從動物肝組織中分離提取純化和鑒定一種酶4 ： 預防的措施是加入蛋白酶抑制劑。常用的絲預防的措施是加入蛋白酶抑制劑。常用的絲 氨酸蛋白酶抑制劑有苯甲基磺酰氟（氨酸蛋白酶抑制劑有苯甲基磺酰氟（PMSFPMSF）、）、 二異丙基氟磷酸；金屬蛋白酶抑制劑有

3、二異丙基氟磷酸；金屬蛋白酶抑制劑有EDTAEDTA 和和EGTAEGTA（乙二醇四乙酸）（乙二醇四乙酸） ： 一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸 污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀劑污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀劑 的選擇需要大量的試驗來選定，已知的有的選擇需要大量的試驗來選定，已知的有 1%2%1%2%的鏈霉素硫酸鹽、的鏈霉素硫酸鹽、PEGPEG、溶菌酶等。、溶菌酶等。 從動物肝組織中分離提取純化和鑒定一種酶5 ：鹽析法：鹽析法 蛋白質溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大蛋白質溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大 于蛋

4、白質，致使蛋白質分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時，于蛋白質，致使蛋白質分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時， 中性鹽加入蛋白質溶液后由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質表面中性鹽加入蛋白質溶液后由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質表面 的電荷大量被中和，更加導致蛋白質溶解度降低，之蛋白質分的電荷大量被中和，更加導致蛋白質溶解度降低，之蛋白質分 子之間聚集而沉淀。常作鹽析的無機鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫子之間聚集而沉淀。常作鹽析的無機鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫 酸鎂、硫酸銨等。酸鎂、硫酸銨等。 影響酶提取的主要因素：影響酶提取的主要因素： 酶在所使用溶劑中的溶解度；酶在所使用溶劑中的溶解度； 酶向溶劑擴散的速度：酶向溶

5、劑擴散的速度與溫度酶向溶劑擴散的速度：酶向溶劑擴散的速度與溫度 （）、黏度（）、黏度（）、擴散面積（）、擴散面積（）、擴散距離）、擴散距離 （）及兩相間的濃度差（）及兩相間的濃度差（）有密切關系；）有密切關系； 1.1. 溫度：在不影響酶活性的條件下，適當提高溫度，有溫度：在不影響酶活性的條件下，適當提高溫度，有 利于酶的提取。適當提高溫度，可以提高酶的溶解度，利于酶的提取。適當提高溫度，可以提高酶的溶解度， 也可以增大酶分子的擴散速度，但是溫度過高，易引也可以增大酶分子的擴散速度，但是溫度過高，易引 起酶的變性失活，所以提取時溫度不宜過高。起酶的變性失活，所以提取時溫度不宜過高。 從動物肝組

6、織中分離提取純化和鑒定一種酶6 ：提取時，溶液的：提取時，溶液的pHpH值不宜過高或過低，以值不宜過高或過低，以 免引起酶的變性失活，并避開酶的等電點。當免引起酶的變性失活，并避開酶的等電點。當pHpH 值等于某酶的等電點時，酶分子的溶解度最小。值等于某酶的等電點時，酶分子的溶解度最小。 ：增加提取液的用量，可以提高：增加提取液的用量，可以提高 酶的提取率。但是過量的提取液，會使酶的濃度酶的提取率。但是過量的提取液，會使酶的濃度 降低，對進一步的分離純化不利。因此，控制提降低，對進一步的分離純化不利。因此，控制提 取液的總量一般為原料體積的取液的總量一般為原料體積的3 35 5倍。倍。 鹽析法

7、之后要進行透析鹽析法之后要進行透析 從動物肝組織中分離提取純化和鑒定一種酶7 常用的酶分離方法有沉淀法、層析法、電泳法、離心法、過濾常用的酶分離方法有沉淀法、層析法、電泳法、離心法、過濾 和膜分離法、萃取法等。和膜分離法、萃取法等。 1.1.等電點沉淀法：利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，等電點沉淀法：利用兩性電解質在等電點時溶解度最低， 及不同兩性電解質的等電點不同這一特性，通過調節(jié)溶液的及不同兩性電解質的等電點不同這一特性，通過調節(jié)溶液的 pHpH值，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離的方法。值，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離的方法。 在溶液的在溶液的pHpH值等于溶液中某兩

8、性電解質的等電點時，該兩性值等于溶液中某兩性電解質的等電點時，該兩性 電解質分子的凈電荷為零，分子間的靜電斥力消除，使分子電解質分子的凈電荷為零，分子間的靜電斥力消除，使分子 能聚集在一起而沉淀下來。能聚集在一起而沉淀下來。因此可以通過調節(jié)介質的因此可以通過調節(jié)介質的pHpH，把，把 目的酶和雜蛋白分開。目的酶和雜蛋白分開。但由于蛋白質在但由于蛋白質在pIpI點附件一定范圍的點附件一定范圍的 pHpH內都可發(fā)生沉淀，只是沉淀的程度很不一樣，而且相當多內都可發(fā)生沉淀，只是沉淀的程度很不一樣，而且相當多 的蛋白質的的蛋白質的pIpI點很靠近，所以該法的回收率和純化倍數(shù)都不點很靠近，所以該法的回收率

9、和純化倍數(shù)都不 理想，一般只用于酶的粗分離階段。理想，一般只用于酶的粗分離階段。 從動物肝組織中分離提取純化和鑒定一種酶8 2.2.離子交換柱層析法離子交換柱層析法 酶提取液中含有目的酶提取液中含有目的 酶以及其他雜質?？擅敢约捌渌s質。可 用柱層析法進行進一用柱層析法進行進一 步的分離。步的分離。 將交換劑緩沖液的將交換劑緩沖液的phph 調節(jié)到目的酶的調節(jié)到目的酶的PLPL與與 雜質蛋白的雜質蛋白的PLPL之間使之間使 其中一類蛋白吸附在其中一類蛋白吸附在 交換劑或者慮過層析交換劑或者慮過層析 柱從而達到分離的目柱從而達到分離的目 的。的。 從動物肝組織中分離提取純化和鑒定一種酶9 ： l

10、 結晶是溶質以晶體形式從溶液中析出的過程，不僅結晶是溶質以晶體形式從溶液中析出的過程，不僅 為酶的結構與功能等的研究提供了適宜的樣品，而為酶的結構與功能等的研究提供了適宜的樣品，而 且為較高純度的酶的獲得和應用創(chuàng)造了條件。通常且為較高純度的酶的獲得和應用創(chuàng)造了條件。通常 酶的純度應當在酶的純度應當在50%50%以上，方能進行結晶。常用方以上，方能進行結晶。常用方 法有鹽析結晶法、有機溶劑結晶法、透析平衡結晶法有鹽析結晶法、有機溶劑結晶法、透析平衡結晶 法、等電點結晶法法、等電點結晶法 l 由于本實驗目的產(chǎn)物為酶，故采用鹽析結晶法。由于本實驗目的產(chǎn)物為酶，故采用鹽析結晶法。 l 原因：主要用于大

11、分子如蛋白質、酶、多肽等的結原因：主要用于大分子如蛋白質、酶、多肽等的結 晶。特點：不耐熱，對晶。特點：不耐熱，對pHpH變化及有機溶劑十分敏感。變化及有機溶劑十分敏感。 用中性鹽作為沉淀劑，安全、操作簡單。鹽析結晶用中性鹽作為沉淀劑，安全、操作簡單。鹽析結晶 法操作包括：加固體鹽法；飽和鹽溶液；透析擴散法操作包括：加固體鹽法；飽和鹽溶液；透析擴散 法。法。 有機溶劑結晶法：針對小分子物質的結晶。有機溶劑結晶法：針對小分子物質的結晶。 等電點結晶法：多用于一些兩性物質。等電點結晶法：多用于一些兩性物質。 從動物肝組織中分離提取純化和鑒定一種酶10 從低濃度酶液中除去部分水或其他溶劑而成為高濃度

12、從低濃度酶液中除去部分水或其他溶劑而成為高濃度 酶液的過程。濃縮的方法很多，離心分離、過濾與酶液的過程。濃縮的方法很多，離心分離、過濾與 膜分離、沉淀分離、層析分離等都能起到濃縮作用。膜分離、沉淀分離、層析分離等都能起到濃縮作用。 用各種吸水劑，如硅膠、聚乙二醇、干燥凝膠等吸用各種吸水劑，如硅膠、聚乙二醇、干燥凝膠等吸 去水分，也可以達到濃縮效果。去水分，也可以達到濃縮效果。 本實驗采用真空蒸發(fā)濃縮法。本實驗采用真空蒸發(fā)濃縮法。 真空蒸發(fā)濃縮：在一定的真空條件下，使酶液在真空蒸發(fā)濃縮：在一定的真空條件下，使酶液在6060 以下汽化蒸發(fā)，進行濃縮的過程。以下汽化蒸發(fā)，進行濃縮的過程。 一般說來，

13、在一般說來，在 不影響酶活力的前提下，適當提高溫度、降低壓力、不影響酶活力的前提下，適當提高溫度、降低壓力、 增大蒸發(fā)面積都可以使蒸發(fā)速度提高。增大蒸發(fā)面積都可以使蒸發(fā)速度提高。 將固體、半固體或濃縮液中的水分或其他溶劑除去一部分，將固體、半固體或濃縮液中的水分或其他溶劑除去一部分， 以獲得含水分較少的固體物質的過程。以獲得含水分較少的固體物質的過程。 常用方法有真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥和吸常用方法有真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥和吸 附干燥等。附干燥等。 從動物肝組織中分離提取純化和鑒定一種酶11 ：真空干燥是在與真空系統(tǒng)相連接的密閉：真空干燥是在與真空系統(tǒng)相連接的密閉

14、 干燥器中，一邊抽真空一邊加熱，使酶液在較低的溫度條干燥器中，一邊抽真空一邊加熱，使酶液在較低的溫度條 件下蒸發(fā)干燥的過程。在真空泵之前需要設置水蒸氣凝結件下蒸發(fā)干燥的過程。在真空泵之前需要設置水蒸氣凝結 收集器，以免汽化產(chǎn)生的水蒸氣進入真空泵。酶液真空干收集器，以免汽化產(chǎn)生的水蒸氣進入真空泵。酶液真空干 燥的溫度一般控制在燥的溫度一般控制在6060以下。以下。 ：冷凍干燥是先將酶液降溫到冰點以下，：冷凍干燥是先將酶液降溫到冰點以下， 使之凍結成固態(tài)，然后在低溫下抽真空，使冰直接升華為使之凍結成固態(tài)，然后在低溫下抽真空，使冰直接升華為 氣體，而得到干燥的酶制劑。冷凍干燥得到的酶質量較高，氣體，而得到干燥的酶制劑。冷凍干燥得到的酶質量較高， 結構保持完整，活力損失少，但是成本較高。特別