課題申請書99mtc標記促凋亡蛋白smac多肽進行腫瘤顯像的基礎(chǔ)研究

1、摘要：腫瘤的發(fā)生是細胞增殖與細胞凋亡失衡所致,凋亡抑制蛋白（iap）是一類內(nèi)源性caspases家族抑制因子,其過度表達引起的凋亡不足與腫瘤發(fā)生,治療耐藥密切相關(guān)。線粒體促凋亡蛋白smac可通過其n端的4個氨基酸與多種iap特異性結(jié)合，解除iap的抑制作用。因此基于腫瘤高表達iap, smac多肽可特異性結(jié)合iap這一特性，借助nhs-mag3雙功能螯合劑，99mtc標記融合細胞穿透序列的smac 6肽，進行腫瘤顯像，量化iap表達，比較腫瘤治療前后腫瘤攝取顯像劑的差異，評估腫瘤治療療效。該方法的建立，不僅可豐富核醫(yī)學(xué)腫瘤顯像方法，還可將此多肽用治療性核素如188re標記，以凋亡抑制蛋白為靶點

2、進行腫瘤核素內(nèi)放射治療，具有極大的研究前景關(guān)鍵詞：凋亡抑制蛋白；促凋亡蛋白smac；多肽標記；腫瘤核素顯像報告正文一 立項依據(jù)與研究內(nèi)容立項依據(jù) 細胞凋亡是受基因調(diào)控的細胞自主死亡的過程，是一系列凋亡相關(guān)分子及其正、負調(diào)節(jié)分子相互作用的結(jié)果，這一過程對消除機體內(nèi)老化細胞及具有潛在異常生長的細胞,保持機體處于穩(wěn)態(tài)起著重要的作用。凋亡中, caspases家族即半胱天冬酶家族具有重要地位。caspases按其在凋亡過程中的功能分為啟動酶和效應(yīng)酶。啟動酶包括caspase2,8,9,10；效應(yīng)酶包括caspase3, 6,7。效應(yīng)酶通過切斷細胞間的信號傳遞,重組細胞骨架,關(guān)閉dna 復(fù)制和修復(fù),破壞

3、dna和細胞核結(jié)構(gòu),誘導(dǎo)凋亡小體形成來執(zhí)行凋亡功能1。 caspases家族以無活性的前體形式存在,該前體需經(jīng)級聯(lián)性的蛋白水解作用而被激活。而凋亡抑制蛋白( inhibitor of apoptosis proteins, iaps)是caspases家族的內(nèi)源性抑制因子，其成員包括xiap,c-iap1,c-iap2,survivin,livin,naip,apollen/bruce,ilp2。該家族成員均含有13個桿狀病毒iap重復(fù)序列( baculoviral inhibitor of apoptosis repeats,bir)，利用此結(jié)構(gòu)區(qū)與caspase3,7, 9結(jié)合而發(fā)揮凋亡抑

4、制作用。比如xiap含有3個bir結(jié)構(gòu)區(qū)，其中bir1,2 連接區(qū)抑制caspase3,7，bir3特異性地抑制caspase9。livin含有一個bir區(qū)，可特異性抑制caspase9;survivin也通過其bir區(qū)直接抑制caspase3,72,3。同樣，iaps抗凋亡的能力也受到調(diào)節(jié)。線粒體促凋亡蛋白smac( second mitochondrial activator of caspase) /diablo(direct iap binding protein with low pi) 可與多種iaps包括xiap,c-iap1,c-iap2, survivin,livin的bir

5、區(qū)特異性結(jié)合，解除iap的抑制作用,釋放活化的caspases。smac，25kda大小，前體存在于正常細胞線粒體,在凋亡信號刺激下, 其n端55個氨基酸被剪切，形成成熟的smac釋放到細胞質(zhì)而發(fā)揮作用4。x線晶體衍射成像顯示成熟的smac通過n端前4個氨基酸：丙氨酸纈氨酸脯氨酸異亮氨酸（avpi）與iap家族的bir結(jié)構(gòu)域表面凹槽結(jié)合，從而解除對caspase的抑制，發(fā)揮促凋亡作用5。（圖1：caspases，iap和smac相互作用關(guān)系示意圖，圖2：smac解除iap抑制caspase作用示意圖）利用此特性， arnt等分別將成熟smac 氨基端的4個氨基酸（avpi）、6個氨基酸(avp

6、iaq)、8個氨基酸(avpiaqks)與果蠅觸角轉(zhuǎn)錄因子穿透序列（rqikiwfqnrrmkwkk）相連接，合成可穿透細胞的融合多肽，與一些上皮來源的腫瘤細胞如乳腺癌細胞株mcf-7,t47d孵育，通過免疫共沉淀的方法證實各種融合多肽的確能穿透細胞膜，與內(nèi)源性的xiap,ciap1結(jié)合，并能提高化療藥物如依托泊苷、紫杉醇誘發(fā)的凋亡，其中smac 6肽能力最強6。vucic等也合成了含有果蠅觸角轉(zhuǎn)錄因子穿透序列smac 9肽（avpiaqkse），利用極化熒光分析技術(shù)證實smac9肽不僅可以和xiap的bir3區(qū)結(jié)合，同樣也可和livin的bir區(qū)結(jié)合7。sun等利用核磁共振分光法證實smac

7、多肽也可類似結(jié)合xiap與survivn結(jié)合 8。iap家族成員在多種人類惡性腫瘤中表達明顯增高，以survivin, xiap，c-iap1,c-iap2,livin為著。如肺癌（85.5）、胰腺癌（88）、食道癌（70%）、結(jié)腸癌（53%）、乳腺癌（60）、結(jié)腸癌（53.2）、膀胱癌（58）和胃癌（68）表達survivin，且其表達與腫瘤的惡性程度和預(yù)后顯著相關(guān) 9-12 。在惡性黑色素瘤、肺癌、胃癌、膀胱癌、絨毛膜癌中有l(wèi)ivin表達，尤其在惡性黑色素瘤組織中的陽性率可達47.6%70.6%，明顯高于黑色素細胞痣（21.4 25.0%）13。xiap也在白血病、肝癌、肺癌、子宮頸癌等多

8、種惡性腫瘤中表達增高。本課題負責人所在之研究小組利用組織芯片及免疫組化技術(shù)對1100余例人類腫瘤中iap家族成員的表達情況進行分析，也得到了相似結(jié)果。腫瘤治療過程中, 許多抗腫瘤藥物及放療均是通過啟動細胞凋亡機制完成的, 而凋亡過程的抑制常常導(dǎo)致腫瘤細胞耐藥14。iap在腫瘤細胞中過表達是腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)督的主要原因,iap基因表達增高,細胞凋亡受抑,導(dǎo)致腫瘤耐藥。如kato等的研究表明,食道癌survivin的高表達能夠?qū)箍拱┧幰鸬牡蛲?在化療效果好的患者的腫瘤組織中survivin表達水平明顯低于化療效果差的患者,提示survivin表達量能夠預(yù)測腫瘤對化療的反應(yīng)12。li等檢測了卵

9、巢癌細胞中xiap的表達情況,發(fā)現(xiàn)耐藥細胞株xiap的表達水平明顯強于對化療藥物敏感細胞株,敏感細胞株經(jīng)順鉑處理后, xiap的表達下降,凋亡指數(shù)上升,而對耐藥細胞株, 順鉑未能影響xiap的水平及細胞凋亡15。因此，定量分析iap 表達對評估腫瘤的惡性程度、預(yù)后及治療反應(yīng)有極大的幫助。大多數(shù)腫瘤高表達iap，smac多肽可特異性結(jié)合iap。多肽具有組織滲透迅速、血液中清除快、免疫原性低和合成方便的特性。因此, 若用某些可被探測的物質(zhì)如放射性同位素標記該多肽，注射入體內(nèi)，采用spect或pet則可進行腫瘤顯像，同時還可以進行定量分析，量化iap的表達，為臨床醫(yī)生評估腫瘤的惡性程度及預(yù)后，制定疾

10、病的治療方案提供重要的幫助，同時還可為治療藥物的篩選提供有力的幫助。99mtc是目前運用廣泛的純核素，具有優(yōu)良的理化性質(zhì)，能標記多種化合物，在核醫(yī)學(xué)臨床診斷和實驗研究中得到了廣泛的運用。巰基乙酰三甘氨酰-n-羥基丁二酰亞胺酯(nhs-mag3) 作為一種有效的雙功能螯合劑, 在90 年代中后期被用于人多克隆免疫球蛋白、抗體、小分子肽、dna 寡核苷酸及肽核酸等的99m tc 標記16。通過nhs-mag3 得到的標記產(chǎn)物, 血漿蛋白結(jié)合率低, 特別適合小分子物質(zhì)的標記。因此本研究選擇nhs-mag3作為螯合劑，對融合了穿透序列的成熟smac氨基端的前6個氨基酸avpiaq-rqikiwfqnr

11、rmkwkk 進行99m tc 標記, 探討用于腫瘤診斷，預(yù)后以及腫瘤耐藥評價的可行性。試圖通過基于凋亡抑制基因進行的顯像，擴展腫瘤核素顯像方法，為臨床評估腫瘤預(yù)后、治療療效提供有用信息。如該方法的確可行，還可對其進行188re標記，以凋亡抑制蛋白為靶點進行腫瘤核素內(nèi)放射治療，具有極大的研究前景。圖1 凋亡信號傳導(dǎo)通路示意圖（fuentes-prior p，2004）圖2 smac/diablo 解除iap蛋白抑制caspase作用示意圖（verhagen am ，2001）a caspase 9通過其p10 亞單位與xiap的bir3結(jié)構(gòu)域凹槽緊密結(jié)合b capase3的催化部位同bir2上

12、游的連接體區(qū)結(jié)合（capase7也類似）c smac/diablo n端氨基酸 與caspase9 類似，可競爭性結(jié)合bir3凹槽，解除iap對caspase9的抑制d smac/diablo 可與bir2上游的連接體區(qū)結(jié)合，解除對caspase3，7抑制參考文獻1: jacobson md, weil m, raff mc, et al. programmed cell death in animal development. cell. 1997;88(3):347-54. .2: verhagen am, coulson ej, vaux dl. inhibitor of apoptos

13、is proteins and their relatives: iaps and other birps. genome biol. 2001;2(7):reviews3009. 3: shi y. mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis. mol cell. 2002;9(3):459-70. 4: du c, fang m, li y, et al. smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase

14、activation by eliminating iap inhibition. cell. 2000;102(1):33-42. 5: wu g, chai j, suber tl, et al. structural basis of iap recognition by smac/diablo. nature. 2000;408(6815):1008-12. 6: arnt cr, chiorean mv, heldebrant mp, et al. synthetic smac/diablo peptides enhance the effects of chemotherapeut

15、ic agents by binding xiap and ciap1 in situ. j biol chem. 2002;277(46):44236-43. 7: vucic d, deshayes k, ackerly h, et al. smac negatively regulates the anti-apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis (ml-iap). j biol chem. 2002;277(14):12275-9. 8: sun c, nettesheim d, liu z, et al. solut

16、ion structure of human survivin and its binding interface with smac/diablo. biochemistry. 2005;44(1):11-7.9: kennedy sm, odriscoll l, purcell r, et al. prognostic importance of survivin in breast cancer. br j cancer. 2003;88(7):1077-83.10: sarela ai, verbeke cs, ramsdale j, et al. expression of surv

17、ivin, a novel inhibitor of apoptosis and cell cycle regulatory protein, in pancreatic adenocarcinoma. br j cancer. 2002;86(6):886-92.11: ku jh, kwak c, lee hs, et al. expression of survivin, a novel inhibitor of apoptosis, in superficial transitional cell carcinoma of the bladder. j urol. 2004;171(2

18、 pt 1):631-5. 12: kato j, kuwabara y, mitani m, et al. expression of survivin in esophageal cancer: correlation with the prognosis and response to chemotherapy. int j cancer. 2001;95(2):92-5.13: gong j, chen n, zhou q, et al. melanoma inhibitor of apoptosis protein is expressed differentially in mel

19、anoma and melanocytic naevus, but similarly in primary and metastatic melanomas. j clin pathol. 2005;58(10):1081-5.14: johnstone rw, ruefli aa, lowe sw. et al. apoptosis: a link between cancer genetics and chemotherapy. cell. 2002;108(2):153-64. 15: li j, feng q, kim jm, et al. human ovarian cancer

20、and cisplatin resistance: possible role of inhibitor of apoptosis proteins. endocrinology. 2001;142(1):370-80.16: winnard p jr, chang f, rusckowski m, et al. preparation and use of nhs-mag3 for technetium-99m labeling of dna. nucl med biol. 1997;24(5):425-32.項目的研究內(nèi)容、研究目標以及擬解決的關(guān)鍵問題研究內(nèi)容 99m tc標記mag3-s

21、mac及其性質(zhì)鑒定 人工合成融合了細胞穿透序列的smac 6肽avpiaq-rqikiwfqnrrmkwkk，對照肽為smac n端6肽反向排列qaipva- rqikiwfqnrrmkwkk；以及不含穿透序列的smac 6肽avpiaq 四步法合成nhs-mag3，偶聯(lián)合成肽，99mtc標記； 標記物純化、測定放化純以及檢測標記物的穩(wěn)定性和血漿蛋白結(jié)合率。 99m tc-smac體外生物學(xué)性質(zhì)鑒定. 檢測腫瘤細胞攝取99m tc-smac的能力； 利用大腸桿菌表達xiap、survivin、livin蛋白；表面等離子體共振技術(shù)測定標記物與xiap、survivin、livin蛋白結(jié)合的kd值

22、。 動物模型的建立與動物體內(nèi)顯像的研究研究99m tc-smac 在動物體內(nèi)的生物學(xué)分布、血液清除、體內(nèi)代謝；荷瘤裸鼠建立，將99m tc-smac注射入動物模型后spect顯像，分析腫瘤細胞內(nèi)放射性強度；通過注射顯像劑后不同時間顯像結(jié)果分析，確定最佳顯像時間； 荷瘤裸鼠放療或化療后，比較腫瘤攝取顯像劑的差異；評價治療療效；腫瘤組織xiap、survivin、livin染色陽性細胞數(shù)與腫瘤攝取顯像劑強度的相關(guān)性分析。研究目標 (1) 借助nhs-mag3雙功能螯合劑，使用99m tc標記可和腫瘤高表達的凋亡抑制基因結(jié)合的smac多肽，實現(xiàn)腫瘤顯像的可能性，從而建立一種新型腫瘤顯像方法；(2)

23、該顯像方法除了可對腫瘤進行多次顯像外，還能定量測定凋亡抑制基因的表達水平，對評估腫瘤預(yù)后、治療療效提供有用信息，充分體現(xiàn)分子核醫(yī)學(xué)與臨床應(yīng)用中的價值。擬解決的關(guān)鍵問題 99m tc標記mag3-smac，要有優(yōu)良的標記特性，保持與iap蛋白的結(jié)合力，確能進入腫瘤細胞，實現(xiàn)腫瘤顯像、評估腫瘤預(yù)后、治療療效的可能性。擬采取的研究方案及可行性分析研究方案合成99m tc-smac，經(jīng)純化、性質(zhì)鑒定后測定其與iap蛋白親和力、靶特異性、生物穩(wěn)定性。其在動物體內(nèi)生物學(xué)分布、體內(nèi)代謝、血液清除速率等將通過荷瘤裸鼠加以研究。注射99m tc-smac后進行spect顯像，定量分析放射性強度,并比較治療前后放

24、射性強度變化；顯像結(jié)果通過腫瘤組織免疫組化加以驗證。99m tc-smac的合成以及性質(zhì)鑒定1合成smac多肽融合了細胞穿透序列的smac 6肽avpiaqrqikiwfqnrrmkwkk（smac a），對照肽為smac n端6肽反向排列qaipva- rqikiwfqnrrmkwkk（smac b）；以及不含穿透序列的smac6肽avpiaq（smac c），可交于公司合成。2合成nhs-mag3, 偶聯(lián)smac多肽 參照hnatowich 提供方法（nucl med biol. 1997）合成nhs-mag3, 溶于無水二甲基甲酰胺，將smac多肽分別溶于hepes緩沖液（ph8.0），

25、邊振蕩邊逐滴加入nhs-mag3溶液，使nhs-mag3和smac的摩爾比為10201，采用不同的連接時間進行偶聯(lián)，用活化的sep-pak c18反相柱純化smac-mag3,甲醇或醋酸胺溶液洗脫，紫外分光光度計測260nm的吸光度，合并峰管，即為目的標記物，分裝、冷凍干燥，-20保存。 3 放射性標記 將smac-mag3溶于醋酸胺溶液，用新鮮配制的0.5m酒石酸鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至7.6,使酒石酸鈉最終濃度為67g/l。依次加入99mtco4- 新鮮淋洗液74mbq和新鮮配制的1g/l氯化亞錫溶液，混勻后在室溫下反應(yīng)15min，依上述方法分離純化。通過hplc方法測定標記率。紙層析測定放射化

26、學(xué)純度。4 99m tc-smac穩(wěn)定性檢測室溫下將99m tc-smac洗脫液分別放置1h，2h，4h, 紙層析測定其放化純; 將99m tc-smac加入2 倍體積新鮮人血清中, 37 分別孵育1h，2h，4h, 進行紙層析, 測定其放化純。5 99m tc-smac 兔血漿蛋白結(jié)合實驗新鮮兔血漿中分別加入37 74 kbq 99m tc-smac a,b,c, 37 孵育1.5h,三氯醋酸沉淀法測定血漿蛋白結(jié)合率。 99m tc-smac體外細胞實驗1細胞攝取6 孔板接種肺癌a549細胞，前列腺癌lncap，pc-3，du145細胞，惡性黑色素瘤a375，a875，sk，m14細胞,子宮

27、頸癌hela細胞,臍靜脈內(nèi)皮細huvec304細胞，常規(guī)培養(yǎng)24h 后吸棄培養(yǎng)基,每3 孔為1 組,分別加入含74 kbq 99m tc-smac a,b,c的無血清培養(yǎng)基2ml ,37 繼續(xù)孵育10,20,40,60 和120min，收集、清洗細胞,分別測定細胞及清洗液中的放射性,計算攝取率= 細胞中放射性計數(shù)/(細胞中放射性計數(shù)+ 清洗液中放射性計數(shù)) 100 %。2表面等離子體共振技術(shù)測定標記物與iap蛋白結(jié)合的kd值利用rt-pcr法,從惡性黑色素腫瘤細胞a375，,擴增xiap, survivin, livin cdna的編碼序列,克隆至pmd-t載體, dna序列測定后再克隆到原核

28、表達載體pgex-2t中,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌bl21后經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達獲得包涵體融合蛋白,并經(jīng)western印跡鑒定。通過超生霧化將80%的1,2-二油酰-sn-丙三氧基-3-磷酸-l-絲氨酸(dops),19%的1,2-二油酰-sn-丙三氧基-3-磷酸膽堿(dopc)制成單層小囊泡（suv）。suv的結(jié)合通過表面共振儀測定。將sa芯片安裝在儀器上，以5-l/分的流速將suv均勻鋪在sa上以形成磷脂膜模型。當膜表面的共振單位達到2000以上并穩(wěn)定以后，磷脂膜模型即做好。將未標記的mag3-smac a,b,c和99m tc標記smac a,b,c的用hepes-p緩沖液（0.1m的hepes

29、,0.15mnacl,0.005%的p20）以及5mm的cacl2稀釋成不同的濃度，然后將50l的蛋白注射到膜表面（固定相），隨即用250l的緩沖液洗脫（解離相）。測量spr角的變化監(jiān)測蛋白與多肽分子間相互作用。由spr曲線可獲得哪些分子發(fā)生了相互作用,相互作用的強度,結(jié)合和解離的速度,樣品中分析物濃度,是否存在異構(gòu)效應(yīng),結(jié)合位點分析,復(fù)合物中不同成分對結(jié)合的影響等。 99m tc-smac動物體內(nèi)顯像的研究1動物模型的建立將1106 的人惡性黑色素細胞a375和前列腺癌du145細胞接種于裸鼠的雙側(cè)后腿皮下。腫瘤長到直徑為5-7mm大小后進行裸鼠體內(nèi)分布和顯像的研究。2動物體內(nèi)生物學(xué)分布 尾

30、靜脈注射4mg/kg的99m tc-smac后于不同時間將小鼠殺死，分別取出腦、心、肺、肝、腎、脾、胃、小腸、肌肉、腫瘤組織、尿、大便等，分別稱重，記錄60s放射性計數(shù)，計算每克組織的放射性強度，得出各器官的時間放射性曲線。3血液半清除速率 尾靜脈注射4mg/kg的99m tc-smac 后，分別于不同時間取血，經(jīng)稀釋后測定放射性計數(shù)。畫出時間放射性曲線，計算半清除時間。4動物體內(nèi)顯像 spect顯像 尾靜脈注射4mg/kg的99m tc-smac，注射前（本底）及注射后0，0.3，1，2，4，6，12，24小時,采集圖像，窗寬15%，能量140kev，采集像素為128128。通過注射顯像劑后

31、不同時間顯像結(jié)果分析，確定最佳顯像時間。框畫roi，分別計算每個roi的放射性計數(shù)。 評價腫瘤放化療的療效將荷惡性黑色素瘤的裸鼠用2gy/次，共7次，3周后顯像，分別比較放射治療的腫瘤與未放射治療腫瘤內(nèi)放射性強度的差異。將荷前列腺癌lncap、du145的裸鼠用康士得（非甾體類的雄激素受體拮抗劑，其中l(wèi)ncap為激素治療敏感性，而du145為激素非依賴）1mg/kg/d,治療46周后顯像，比較激素治療前后放射性強度的差異，評價腫瘤治療的療效。 組織學(xué)染色顯像后，將每只小鼠的腦、心、肺、肝、腎、脾、胃、小腸、肌肉、腫瘤組織取出，固定，石蠟包埋，做成組織芯片，xiap，survivin，livin

32、免疫組化染色。對各組織染色陽性細胞數(shù)與體內(nèi)相應(yīng)組織攝取顯像劑強度的相關(guān)性分析。 數(shù)據(jù)分析 采用spss統(tǒng)計分析軟件分析數(shù)據(jù)。兩組均數(shù)的比較用t 檢驗，多組間的比較用方差分析, 兩兩比較用lsd 法，相關(guān)性分析采用線性相關(guān)與回歸法；p0.05有統(tǒng)計學(xué)意義 可行性分析1 課題思路是申請者對凋亡及其凋亡相關(guān)家族進行細致深入學(xué)習和研究，參閱了大量文獻，并結(jié)合自己核醫(yī)學(xué)專業(yè)優(yōu)勢提出的。smac49肽均被證實可以和凋亡抑制蛋白中的xiap，survivin，livin結(jié)合，而這些凋亡抑制蛋白又在大多數(shù)腫瘤中高表達，因此利用smac多肽作為標記對象對腫瘤進行顯像，具有很好的立論基礎(chǔ)。加之多肽具有組織滲透迅速

33、、血液中清除快、免疫原性低、合成方便以及核素標記方法成熟的特性，技術(shù)上具有較高的可行性。 課題組成員均是具有豐富研究經(jīng)驗的研究者，課題組所在研究機構(gòu)具有較好的研究條件與完善的研究設(shè)備，為研究工作提供了堅實的硬件基礎(chǔ)。特色與創(chuàng)新 基于smac多肽能與腫瘤中高表達的凋亡抑制蛋白結(jié)合的特性，首次提出對smac多肽標記，針對凋亡相關(guān)家族進行腫瘤顯像。不僅可以反復(fù)多次顯像，還可量化凋亡抑制蛋白表達水平，評估療效，提示預(yù)后。該方法的建立可擴展腫瘤核素顯像方法，并可繼續(xù)深入研究，進行腫瘤靶向治療，因此有很好的研究前景。年度研究計劃2007.1-2007.6 合成99m tc-smac a，b，c及其標記物放

34、化性質(zhì)測定2007.6-2007.12 大腸桿菌克隆xiap，survivin，livin，表面等離子體共振技術(shù)測定標記物與iap蛋白結(jié)合的kd值2008.1-2008.3 蛋白99m tc-smac a，b，c腫瘤細胞攝取2008.4-2008.12 測定99m tc-smac a，b，c在動物體內(nèi)的生物學(xué)分布、血液清除、體內(nèi)代謝。動物體內(nèi)顯像，研究腫瘤的最佳顯像時間2009.1-2009.5 評價腫瘤治療后的療效2009.6-2009.12 數(shù)據(jù)處理及論文撰寫與發(fā)表預(yù)期研究結(jié)果利用99m tc標記smac穿透肽，實現(xiàn)腫瘤顯像，量化凋亡抑制蛋白表達水平，評估療效，提示預(yù)后。通過理論探索和技術(shù)

35、研究，使之可達到下一步開展臨床應(yīng)用研究的目的。顯像方法可申請技術(shù)發(fā)明專利，被開發(fā)為臨床應(yīng)用產(chǎn)品。通過省部級鑒定，申請科技成果獎。在sci收錄雜志發(fā)表論文23篇，研究結(jié)果在國際、國內(nèi)會議上交流。二研究基礎(chǔ)與工作條件工作基礎(chǔ) 本課題申請者在博士期間承擔國家自然基金課題nis和tpo基因轉(zhuǎn)染腫瘤細胞介導(dǎo)131i靶向治療的研究工作，具有扎實的核醫(yī)學(xué)實驗基礎(chǔ),并熟練掌握分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，發(fā)表相關(guān)論文3篇 ，并參加了第八屆亞太核醫(yī)學(xué)和生物學(xué)大會，口頭交流該課題研究結(jié)果。在前期的工作中，參加了實驗室對神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和惡性黑色素腫瘤中caspase和iap家族等凋亡調(diào)控蛋白的表達模式和水平及生物學(xué)意義研

36、究的工作，并獨立承擔構(gòu)建重組人smac基因的腺病毒載體，在惡性黑色素瘤、前列腺癌細胞株中進行生物學(xué)行為的研究，因此對凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制與腫瘤發(fā)生有較深入的理解和研究。本課題申請人和研究小組成員熟悉課題相關(guān)的學(xué)術(shù)前沿和動態(tài)，具有豐富的研究工作經(jīng)驗和研究技術(shù)。工作條件已具備的實驗條件spect 2臺beckman hplc 1臺超速低溫離心機 1臺icon核醫(yī)學(xué)專業(yè)計算機 2臺超凈工作臺 1臺質(zhì)譜儀 1臺表面共振儀 1臺超低溫冰箱 1臺生物搖床 1臺co2 孵箱 1臺lkb-自動層析分離儀 1臺beckman 純水儀 1臺pcr儀 1臺-80超低溫冰箱 1臺紫外分光光度儀 1臺、自動色層掃描儀 1臺

37、紫外可見自動掃描分光光度計 1臺登記序號： 項目編號：中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研項目課題設(shè)計書課題名稱：痛痹顆粒對骨關(guān)節(jié)炎細胞凋亡和增殖的機理研究申報單位： 江蘇省中醫(yī)院課題負責人： 朱萱萱計劃年限：郵政編碼： 210029 聯(lián)系電話： 8661714130306申報日期：江蘇省中醫(yī)藥局制填寫提綱一、立項依據(jù)：與選題直接相關(guān)的國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢；選題的理論和實踐依據(jù)；研究目的、意義；本研究達到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會經(jīng)濟效益和應(yīng)用推廣前景。二、科研假說或技術(shù)構(gòu)思，主要研究內(nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標（達到的主要技術(shù)指標或技術(shù)經(jīng)濟指標），技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。三、研究試驗方法及

38、技術(shù)路線（工藝路線）。四、現(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：開展本項研究的技術(shù)優(yōu)勢，現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備及應(yīng)用合格實驗動物的基本條件等；已有工作基礎(chǔ)，預(yù)試驗情況。五、計劃進度：根據(jù)總的研究期限、年度計劃進度，分別列出具體的目標和進度的考核指標。六、參加（協(xié)作）單位意見及具體分工（附協(xié)議書）。七、經(jīng)費概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據(jù)，以及分年度使用計劃。填寫說明一、內(nèi)容填寫自備附頁，用紙大小和封頁一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報要求上報。二、填寫提綱所列內(nèi)容，要全面詳細、如實填寫。三、封面上“登記序號”“項目編號”請勿填寫。1、 立項依據(jù)1.1 研究目的、意義骨關(guān)節(jié)炎（osteoa

39、rthritis，oa）又稱退行性關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年以后的慢性進行性關(guān)節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長而升高，據(jù)調(diào)查，在美國目前2億多人口中，就有骨關(guān)節(jié)炎4500萬，發(fā)病率占總?cè)丝诘?0%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，oa的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，5564歲的人群中發(fā)病率達40%，而65歲以上人群的患病率達60%90%。隨著計劃生育政策的長久實施及經(jīng)濟發(fā)展，我國已進入老齡化社會，oa的發(fā)病率還將越來越高，這不僅嚴重危害人民的生活、健康，對社會也將造成很大負擔。

40、同時世界其他國家也面臨著同樣的問題，因而oa引起了國際、國內(nèi)醫(yī)學(xué)界的相當重視。近年來對oa的研究頗多，在發(fā)病機制、檢測手段以及治療方法上均取得較大進步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進展。西藥治療oa的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點。雖然中藥治療oa也取得了一些經(jīng)驗，但對其具體的作用機制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對療效確切的中藥復(fù)方進行深入的機理研究，使中藥治療oa的療效在國際先進行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2 國內(nèi)外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢近十年來，國內(nèi)外對oa進行了較深入地研究，大致歸納如下：1.2.

41、1 流行病學(xué)研究已廣泛開展在近100種不同類型的關(guān)節(jié)疾病中，oa是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一，沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長，患病率也有增高的趨勢。felson等報道70歲以下人群膝oa患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學(xué)膝oa70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。butter等報道，44歲以下、4559歲、60歲以上人群中，放射血oa 患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國內(nèi)陳順樂等隊13541名鋼鐵工人的調(diào)查結(jié)果顯示，癥狀

42、性oa患病率2.2%；無癥狀性oa患病率53%，其中3039、4049、5059歲患病率各為11%、27%和62%。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計551例，結(jié)果40歲以下、4049、5059和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關(guān)節(jié)oa易感性不同。美國在衛(wèi)生統(tǒng)計中心調(diào)查結(jié)果，oa患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國內(nèi)陳順樂等調(diào)查結(jié)果oa是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖oa均以女性較多，且女性骨關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在framingham的研究中，felaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關(guān)節(jié)炎形成的風險相應(yīng)減少50%

43、。 saase等調(diào)查結(jié)果，膝oa患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據(jù)1994年統(tǒng)計，在美國，骨關(guān)節(jié)炎的消耗為155億美元，約為類風濕關(guān)節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國雖未作全國大范圍的普查，但隨著老齡化社會進程的不斷加快，oa的發(fā)病率會越來越高，這必將給家庭、社會帶來沉重負擔。1.2.2 病因、發(fā)病機制有了巨大突破目前基礎(chǔ)研究認為軟骨的損傷與退變是oa的根本，隨著分子生物學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，近年來眾多學(xué)者對oa關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進行了大量研究，其發(fā)病機制仍未完全明了，又提出了許多學(xué)說，如軟骨下骨內(nèi)高壓學(xué)說：由于骨血液動力學(xué)的改變，在骨髓腔容積不變的前提

44、下增加內(nèi)容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。骨內(nèi)高壓持續(xù)增高存在下關(guān)節(jié)滑液ph值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細胞的正常代謝導(dǎo)致細胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復(fù)，最終產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎。自由基學(xué)說：認為自由基對軟骨細胞dna和pg的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細胞后，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，使脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛增多，丙二醛可與dna發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細胞dna即合成dna所需的酶，使dna鏈斷裂、堿基損傷從而影響了dna的合成，也造成前列腺（pg）合成障礙。骨關(guān)節(jié)炎時，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細胞、巨嗜細胞浸潤，其表面受免疫復(fù)合物、補體等作

45、用能釋放大量o2-和h2o2；細胞因子學(xué)說：細胞因子對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細胞介素-1（il-1）、白細胞介素-6(il-6)、腫瘤壞死因子（tnf）等在oa中水平明顯增高。il-1具有刺激軟骨細胞分泌一氧化氮、前列腺e和il-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時il-1也是軟骨基質(zhì)降解的主要驅(qū)動因子；軟骨酶降解學(xué)說：oa軟骨細胞的基質(zhì)降解酶類的合成與分泌率明顯增加，并與關(guān)節(jié)炎的嚴重程度密切相關(guān)。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類可以增加達到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基質(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細胞外基質(zhì)的所

46、有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細胞和軟骨細胞產(chǎn)生的il-1和tnf的作用下，軟骨細胞以酶原的形式分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，而對金屬蛋白酶組織抑制劑無影響，使二者失衡從而增加對軟骨主要成分型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進行性破壞；一氧化氮學(xué)說：no是一種細胞間信使分子，可介導(dǎo)許多生物學(xué)現(xiàn)象。nos可催化重要炎性介質(zhì)no的產(chǎn)生，oa患者血清、滑液中no含量明顯高于正常。no可通過抑制軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時使軟骨細胞分泌透明質(zhì)酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細胞合成軟骨基質(zhì)，促進軟骨細胞糖

47、酵解，使軟骨破壞。細胞凋亡學(xué)說：細胞凋亡是細胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進與不足則會引起相關(guān)疾病，在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中軟骨細胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細胞數(shù)目與骨關(guān)節(jié)炎嚴重程度明顯相關(guān)。凋亡小體存在于軟骨細胞小孔或間隙內(nèi)，其產(chǎn)生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有ntpph（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細胞修復(fù)過程失敗，而逐漸發(fā)展成關(guān)節(jié)軟骨的完全丟失。oa軟骨細胞凋亡主要通過兩種相互獨立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關(guān)的途徑,由no介導(dǎo);另一種是同滑膜炎癥相關(guān)的途徑,由fas介導(dǎo)。典型

48、的oa不存在明顯的炎癥反應(yīng),此時軟骨細胞凋亡以no途徑為主;當產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時,則通過as途徑加劇軟骨細胞凋亡和關(guān)節(jié)破壞。no通過兩種方式造成組織及細胞損傷。一是高濃度的no能抑制多種與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是no與超氧化陰離子2-反應(yīng),生成氧化亞硝基陰離子onoo-,在酸性條件下(如病理條件)迅速分解為oh-和no2自由基,這兩種自由基具有很強的細胞毒性,可造成組織細胞損傷。在oa患者中,受損區(qū)軟骨細胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。fas表達的結(jié)果與其相符,oa受損區(qū)的fas表達遠高于未受損區(qū),提示fas表達可誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡。除no途徑和f

49、as途徑外,還有一些因素可導(dǎo)致軟骨細胞凋亡、關(guān)節(jié)破壞,如il-1、il-8、tnf-、pge2、aggrecan g1區(qū)等。1.2.3 治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療oa的藥物較多，西藥治療oa主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，oa多為老年人，長期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價格不菲，而且由于過分的鎮(zhèn)痛，導(dǎo)致病人失去警惕過分運動，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長期療效來看反而不佳，最新觀點認為乙酰氨基酚應(yīng)作為治療oa的首選藥，但尚有一定爭議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價格昂貴

50、，臨床上尚未廣泛運用；第三類為軟骨保護劑，尚未問世。關(guān)節(jié)清理術(shù)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，適應(yīng)癥較少，費用高，創(chuàng)傷大，病人難以接受。中哦藥治療oa的研究取得了可喜的進步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：多屬臨床經(jīng)驗，無對照組，特別是西藥對照組觀察，處方不固定。缺乏用客觀的最新的國際公認的、量化的臨床觀察指標及療效判斷標準為手段來尋找治療oa的中藥。未針對oa發(fā)病機制進行臨床及動物試驗從生化、免疫、病理、細胞分子水平來探討中藥的藥物作用機理。缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認為oa屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認為其病因與年老體衰、長期勞損、外感風寒濕邪有關(guān)，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為oa

51、的發(fā)病基礎(chǔ)，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎(chǔ)上，闡述了膝oa骨內(nèi)高壓血瘀證氧自由基之間的密切關(guān)系；謝林等論述了膝oa與血瘀證之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在為運用活血化淤藥治療oa提供理論依據(jù)。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對其病因病機采用益肝腎、強筋骨、補氣血治其本；散寒通絡(luò)、化痰勝濕治其標。獨活寄生湯是用于治療風寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補肝腎、活血通絡(luò)之功，臨床常見本方加減治療oa，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關(guān)節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報道用本方加減治療104例，總有效率91.

52、3%。1.2.4 實驗研究方面有了較大的進展隨著對oa發(fā)病機理的不斷深入認識，對oa的實驗研究方面也開始了向多層次多角度的方向發(fā)展。動物實驗不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗，現(xiàn)已使用針對oa的動物實驗，并采用相關(guān)的指標進行檢測。目前實驗研究內(nèi)容主要有以下幾個方面，研究最多的是oa的血液流變學(xué)、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗一般均可通過建立骨關(guān)節(jié)炎的模型來完成，也可通過使用其它相似的模型檢測相關(guān)指標來進行，如可建立急性血淤模型來檢查血液流變學(xué)指標，使用老齡動物通過檢測體內(nèi)sod及mda含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在no對oa影響的實驗中，一般采用硝酸還原酶法來測定no含量，運用p

53、t-pcr技術(shù)測定nos基因表達。il-1、il-6、tnf等細胞因子、軟骨降解酶尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥的物質(zhì)如纖溶酶原/纖溶酶原激活物和前列腺素pge2、軟骨細胞的細胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來越多地被作為檢測指標使用到實驗研究中來。1.3 選題的理論和實踐依據(jù)祖國醫(yī)學(xué)并無骨關(guān)節(jié)炎的病名，從歷代文獻來看本病應(yīng)歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。我們認為oa病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般oa病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關(guān)節(jié)腫脹畸形、活動受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質(zhì)之于痰淤?；诂F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對oa發(fā)病機理的深入研

54、究，我們在補益肝腎、活血通絡(luò)基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥對緩解軟骨降解，增加軟骨細胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于1995年即對備急千金要方中的獨活寄生湯進行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結(jié)制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝oa，方中以獨活為君藥，以祛下焦與筋骨間風寒濕邪；威靈仙舒筋通絡(luò)止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補肝腎，強筋骨，通經(jīng)絡(luò)，其中懷牛膝為引經(jīng)藥；當歸養(yǎng)血柔肝、舒筋活血；川芎則通達四肢關(guān)節(jié)，為血中氣藥；虎杖活血清熱解毒，同時防諸藥辛燥太過。諸藥合用共起補肝腎、祛風濕、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保護軟骨。通過36例的臨床研究、觀察，結(jié)果表

55、明本方療效顯著且副作用小。因此有必要對痛痹顆粒治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制尤其是該方對軟骨細胞的細胞凋亡與增殖機理做進一步的研究，冀能證實痛痹顆粒的臨床療效，明確其作用機制，并初步探討本病發(fā)病的可能機理，為新藥問世提供客觀的依據(jù)，所以進行設(shè)計并立題。1.4本研究達到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會效益和應(yīng)用推廣前景1.4.1繼承和發(fā)揚祖國醫(yī)學(xué)，保持中醫(yī)特色，以臨床療效為前提，以實驗研究為基礎(chǔ)，制造規(guī)范化大鼠的膝oa模型，從發(fā)病機理探討本藥的作用機制。本實驗采用可靠地國際公認的方法復(fù)制動物模型，并采用最新的檢測指標il-1、tnf、sod、mda、no等，總之本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對oa發(fā)病機制的最新研究成果，

56、從生化、免疫等多個角度多個層次，系統(tǒng)觀察并進行歸納總結(jié)，確保本課題不但可行而且先進，冀能填補省內(nèi)外運用中藥治療oa的空白，并希望以此為基礎(chǔ)，進一步從細胞水平（包括本藥對軟骨細胞及細胞凋亡與增殖的影響）研究中藥對oa的長久作用及影響，從而達到擠身國際先進水平的目的，讓中藥真正走向世界。1.4.2目前，中藥治療oa的方法頗多，但大多以臨床療效研究為主，大樣本、規(guī)范化的研究很少，中醫(yī)中藥治療機理的研究，雖有涉及，但大多分散且存在一定的重復(fù)性，理想的治療藥物尚未問世，具有公認療效的小兒遷延性腹瀉臨床治療方案尚未確立，其療效評價體系尚需研究確定，尤其是缺少中醫(yī)藥治療學(xué)整體研究思路與方法，使中藥復(fù)方治療oa的療效機理尚未能全面揭示，影響了該領(lǐng)域研究的深入。而痛痹顆粒是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下選用千金要方中獨活寄生湯進行加減所得，并采用可靠的實驗?zāi)Ｐ图白钚碌膰H公認的相關(guān)指標進行實驗研究，觀察其對oa的確切療效及作用機理，這必將對oa的中醫(yī)理論產(chǎn)生較大影響，同時對臨床治療也起到更好的指導(dǎo)作用，從而產(chǎn)生較好的社會經(jīng)濟效益。隨著改革開放的形勢發(fā)展，以及中國加入wto與國際接軌的進程的不斷完善，祖國醫(yī)學(xué)國際地位不斷的提高，我