完整版PCR技術(shù)包含引物設(shè)計

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）原理：DNA的半保留復(fù)制時，雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解 鏈 成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則 復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實驗條件下，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因 此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子， 加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。PCR類 似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡 核昔酸引物。PCR由變性-退火（復(fù)性）-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94 C左右一定時間后， 使模板DNA雙鏈

2、或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單 鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈 后，溫度降至4060 C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列 配 對結(jié)合； 引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，于72C左右，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿 基配 對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”， 而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分 鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。PCR技術(shù)分類（常用）（1）反向PCR

3、技術(shù)（Inverse PCR, IPCR）:反向PCR是克隆已 知序列旁側(cè)序列的一種方法主要原理是用一種在已知序列中無切點 的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA.后酶切片段自身環(huán) 化以環(huán)化的 DNA作為模板，用一對與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴增夾 在中間的未知序列。該擴增產(chǎn)物是線性的DNA片段，大小取決于上 述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼DNA序列內(nèi)部的酶切位點分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA,再通過反向PCR獲得未知片段。(2) 錨定PCR技術(shù)(Anchored PCR,APCR):用酶法在一通用弓I物 反轉(zhuǎn)錄CDNA3-末端加上一段已知序列，然后以此序列為引物

4、結(jié)合 位點對該cDNA進行擴增，稱為APCRo(3) 不對稱PCR技術(shù)(asymmetric PCR):兩種引物濃度比例 相差較 大的PCR技術(shù)稱不對稱PCRo在擴增循環(huán)中引入不同的引物濃度， 常用50-100- 1比例。在最初的1015個循環(huán)中主要產(chǎn)物還是 雙鏈DNA,但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后，高濃度引物介導(dǎo)的PCR反 應(yīng)就會產(chǎn)生大量單鏈DNAo(4) 反轉(zhuǎn)錄 PCR 技術(shù)(reverse transcription PCR, RT-PCR):當(dāng) 擴 增模板為RNA時，需先通過反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進行 擴增。應(yīng)用非常廣泛，無論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗等都經(jīng)常采 用。(5) 巢式P

5、CR技術(shù)(NEST-PCR):先用一對靶序列的外引物擴 增以提高模板量，然后再用一對內(nèi)引物擴增以得到特異的PCR帶，此為巢式PCRo若用一條外引物作內(nèi)引物則稱之為半巢式PCRo 為減少巢式PCR的操作步驟可將外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長些，且用 量較少，同時在第一次PCR時采用較高的退火溫度而第二次采用較 低的退火溫度，這樣在第一次PCR時，由于較高退火溫度下內(nèi)引物 不能與模板結(jié)合，故只有外引物擴增產(chǎn)物，經(jīng)過若干次循環(huán)，待外 接進行PCR擴增。這不僅減少操作步驟，同時也降低了交叉污染的引物基本消耗盡，無需取出第一次PCR產(chǎn)物,只需降低退火即可直機會。這種PCR稱中途進退式PCR,主要用于極少量DNA

6、模板的擴增。(6) 多重PCR技術(shù)(multiplex PCR):在同一反應(yīng)中用多組引物 同時 擴增幾種基因片段，如果基因的某一區(qū)段有缺失，則相應(yīng)的電泳譜 上這一區(qū)帶就會消失。主要用于同一病原體的分型及同時 檢測多種病原體、多個點突變的分子病的診斷。(7) 重組PCR技術(shù)：重組PCR技術(shù)是在兩個PCR擴增體系中： 兩對引物分別由其中之一在其5-端和3-端引物上帶上一段 互補的 序列，混合兩種PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)變性和復(fù)性，兩組PCR產(chǎn)物互 補序列發(fā)生粘連，其中一條重組雜合鏈能在PCR條件下發(fā)生聚合延伸反應(yīng)，產(chǎn)生一個包含兩個不同基因的雜合基因。(8) 原位PCR技術(shù)：利用完整的細胞作為一個微小的反

7、應(yīng)體 系來 擴增細胞內(nèi)的目的片段，在不破壞細胞的前提下，利用一些特 定的 檢測手段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。直接用細胞涂片或石 蠟包埋組 織切片在單個細胞中進行PCR擴增，可進行細胞內(nèi)定位，適用于檢 測病理切片中含量較少的靶序列。(9) 熒光定量實時PCR技術(shù)反應(yīng)動力學(xué)PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升，最 終 DNA擴增量可用丫=(1+X)n計算，丫代表DNA片段擴增后的拷貝 數(shù)，X表示平均每次的擴增效率，n表示循環(huán)次數(shù)。平均擴增效率理 論值為100%,但實際情況達不到，反應(yīng)初期靶序列DNA片段的增 加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴 增的DNA片段不 再呈指數(shù)增

8、加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效 應(yīng)”，此效應(yīng)稱平臺期，與DNA聚合酶數(shù)量和活性、PCR擴增效率、非特異性產(chǎn)物的競爭等因素有關(guān)。PCR擴增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分，短產(chǎn)物片段的長度嚴格 地限定在兩個引物鏈5 端之間，是需要擴增的特定片段。短、長產(chǎn) 物片段是由于引物所結(jié)合的模板不同而形成的，以一個原始模板為 例，在第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3, 端開始延伸，其5,端是固定的，3,端則沒有固定的止點，長短不 這就是長產(chǎn)物片段。進入 第二個反應(yīng)周期后，引物除與原始模 板結(jié)合外，還要同新合成 的鏈(長產(chǎn)物片段)結(jié)合引物在與新鏈結(jié)合 時，由于新鏈模板

9、的5,端序列是固定的，故這次延伸的片段3端 被固定了止 點，保證了新片段的起點、止點都限定于引物擴增的序列以內(nèi)，形 成長短一致的短產(chǎn)物片段。由于短產(chǎn)物片段是按指數(shù)倍數(shù)增加，而 長產(chǎn)物片段則以算術(shù)倍數(shù)增加，故可忽略不計，使 得PCR的反應(yīng)產(chǎn) 物不需再純化既可以保證足夠純的DNA片段供分析、監(jiān)測。反應(yīng)五要素引物、模板、DNA聚合酶、四種dNTPv Mg2+(1 )引物設(shè)計 引物長度：15-30bp,常用為20bp左右。 引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb 的片段。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC

10、最好隨機分布，引物自身 連續(xù)互補堿基不能超過3個，一對引物間也不易多于四個連續(xù)堿基 的互補性?！疽锏腉C含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)：Tm=4 ( G+C) +2 ( A+T)】 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3,端 的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 引物3，端為關(guān)鍵堿基，是PCR延伸的起始端，不能進行任 何修飾，也不能形成二級結(jié)構(gòu)的可能，一般 3 端也不能發(fā)生 錯配，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。5,端無嚴格限制，只起限定PCR產(chǎn)物長度的作用，對 擴增 特異性影響不大，因此常用來引進修飾位點或標(biāo)記物o 引物中有或能加上合適的酶切位

11、點，被擴增的靶序列最好有 適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源 性。 引物量：每條引物的濃度0.11umol或10100pmol,以 最低 引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。(2) DNA聚合酶：目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從 棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程 酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量0.5-2.5 U/50 ml ,濃 度過高可 引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。(3) dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP

12、溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成 高濃度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)至IJ 7.07.5,小量分裝，-20C冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50-200umol/L,尤其是注意4種 dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于 其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低 又會降低 PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。（4）模板（靶基因）核酸：模板核酸的量與純化程度，是PCR 成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的 DNA純化方法通常采用SDS和 蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂 類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞

13、細胞膜，并解離細胞中的核蛋 白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與 氯仿 抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核 酸。提取的核酸即可作為模板用于 PCR反應(yīng)。（5）Mg2+濃度：Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時， Mg2+濃度為1.520mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反 應(yīng)特異性降 低出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。RT-PCR -是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U 增 （PCR相

14、結(jié)合的技術(shù)?？俁NA提?。?70 C保存）Trizol 法：1、取組織100啞于玻璃勻漿器中，加入1ml Trizol冰上抽打勻 漿 （邊勻漿邊暫停）2、移入1.5mlEP管中，顛倒混勻，室溫保存5min3、加氯仿0.2ml （總體積的1/5 ）,振蕩混合，室溫放置5min4、4 C,離心 12000 rpm , 15min5、取上層液相（約400卩I）移入一新1.5ml EP管中，加等體積異 丙醇（約400卩I）,振蕩混合，室溫保存10min6、4 C,離心 12000 rpm , 10min7、棄上清液，力Q 1ml 75%無水乙醇（4C保存）,振蕩混合& 4 C,離心 7500 rpm

15、, 5min 9、棄上清液，室溫放置20min （EP管倒置在濾紙上）使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、力口 20ul DEPC水至EP管中，在60 C孵育3-5min （或手握3-5min）,使RNA充分溶解（可保存在液氮或低溫冰箱-70 C）測RNA濃度：走RNA變性電泳觀察18s、28s條帶，分光光度 計檢 測260/280吸光度比值 調(diào)零:750ul DEPC 水測量：745ul DEPC 水 + 5ul RNA總RNA濃度=OD260X40X稀釋倍數(shù)（150倍）ug/ml=OD260 40Xl5Xug/ml=OD2606 ug/ul XA1/A2應(yīng)在1.8-2.0之間注意：提取R

16、NA的質(zhì)量主要是要通過260/280的比值看是不是在2.0左右，當(dāng)OD260/OD280V1.8時提示有蛋白或酚的污 染，需要 進一步純化RNA;還要跑膠看看28s、18s、5s的三條 帶是不是清晰，一般質(zhì)量好的RNA, 28s:18s的亮度比例在2:1左右，最后一條5s的應(yīng)該比較淡。逆轉(zhuǎn)錄RT （cDNA: 一周內(nèi)-20 C保存，長期70 C保存）RT反應(yīng)體系：20ul體系第一步：約20分鐘RNA抽提物Radome引物2卩IRNAsin0.5 口 11 v 65 C 15 分鐘2、立即放入冰浴第二步：約2小時RNAsi n 10mM 0.5 dNTP5X RT 緩 沖液 25mM MgCI2

17、AMV 1 v 37C 1.5 小時2、94 C 5-10 分鐘3、反應(yīng)物保存于-20 C或進行PCR聚合酶鏈反應(yīng)PCR （產(chǎn)物-20 C保存）PCR反應(yīng)體系:100 al體系約4.5小時約5小時25mM MgCI22al3a10 X PCR緩沖液5al5al10mMdNTP1a I1a10pmol/ a 1上游引物2.5 a I2.5 a I10pmol/ a 1下游引物2.5 a I2.5 a IcDNA模板2.5 a I5alddH2O34a I 30Taq酶0.5卩丨1卩I輕質(zhì)石蠟油50卩I 50卩I1、94 C 2分鐘，55 C 1分鐘，72 C 2分鐘為第一個步1個循環(huán)2、94C4

18、5秒，55 C 40秒，72 C 1分鐘為第二步30/40個循環(huán)3、72C 10 分鐘4、取出后4 C保存，5分鐘后-20 C保存或走電泳 瓊脂糖凝膠電泳：約1.25小時1、配制0.5 X TBE電泳緩沖液300 ml2、配制凝膠濃度1.7% （40ml 0.5 X TBE加0.68g膠），微波爐中 火2分鐘溶解膠，冷卻至60 C加入漠乙錠2!卩I （10mg/ml的終濃 度0.5卩g/ml ）,充分混勻3、將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30 45min后現(xiàn)進行電泳4、加樣8卩I PCR反應(yīng)產(chǎn)物+2卩I漠酚蘭，空一格加DNA marker5、電泳50-80V 5電場強度不宜高

19、于5V/cm6、在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成 像系統(tǒng)拍照保存。電泳緩沖液（5X TBE貯存液）：Tris54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA 20ml pH80、加蒸溜水至1000ml o使用時，將5X TBE稀 釋10倍成0.5XTBE就可以在電泳時使用（工作濃度）。上樣緩沖液（6 X緩沖液，4 C保存）：0.25%漠酚藍、0.25%二甲 苯青FF、30%甘油瓊脂糖凝膠配制：（1.0% ）1.0g瓊脂糖+100ml電泳緩沖液，微波爐加熱至沸騰（如果首次煮膠，一定要煮透，以不出現(xiàn)泡沫為標(biāo)志），熔化的瓊脂物冷卻至60 C時加入10mg/ml漠化乙錠5卩I,充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在 室溫下放置30-45min （可以放入4度冰箱加快瓊脂糖凝固