01提取工藝：川桐皮中總黃酮提取工藝的研究

1、金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院JIN HUA COLLEGE OF PROFESSION AND TECHNOLOGY畢業(yè)教學(xué)環(huán)節(jié)成果（2012 屆）題目川桐皮中總黃酮的提取工藝研究學(xué)院制藥與材料工程學(xué)院專業(yè)生物制藥技術(shù)班級(jí)制藥093學(xué)號(hào)200931100380346姓名羅超超指導(dǎo)教師鄭柏勤2012年5月22日金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)教學(xué)環(huán)節(jié)成果目錄摘要錯(cuò). 誤！未定義書簽。1 材料與設(shè)備 錯(cuò). 誤！未定義書簽。1.1 材料錯(cuò). 誤！未定義書簽。1.1.1實(shí)驗(yàn)藥材錯(cuò). 誤！未定義書簽。1.1.2 化學(xué)試劑錯(cuò). 誤！未定義書簽。1.2 儀器與設(shè)備 錯(cuò). 誤！未定義書簽。2 方法與結(jié)果 錯(cuò). 誤！未定義書簽。2.1

2、 總黃酮含量的測(cè)定 10 錯(cuò). 誤！未定義書簽。2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 錯(cuò). 誤！未定義書簽。2.1.2 樣品液制備與樣品總黃酮含量的測(cè)定 錯(cuò)誤！未定義書簽。2.2 提取工藝研究 錯(cuò). 誤！未定義書簽。2.2.1 提取溶劑對(duì)提取率的影響 錯(cuò). 誤！未定義書簽。2.2.2 粉碎度對(duì)提取率的影響 錯(cuò). 誤！未定義書簽。2.2.3 乙醇濃度對(duì)提取率的影響 錯(cuò). 誤！未定義書簽。2.2.4 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響 錯(cuò). 誤！未定義書簽。2.2.5 浸提溫度對(duì)提取率的影響 錯(cuò). 誤！未定義書簽。2.2.6 液料比對(duì)川桐皮黃酮類化合物提取的影響 錯(cuò)誤！未定義書簽。2.2.7 正交試驗(yàn) 83結(jié)果與討論

3、錯(cuò).誤！未定義書簽。參考文獻(xiàn) 錯(cuò). 誤！未定義書簽。謝辭錯(cuò). 誤！未定義書簽。川桐皮中總黃酮的提取工藝研究制藥與材料工程學(xué)院生物制藥技術(shù)專業(yè) 羅超超 摘要： 為充分利用川桐皮資源，對(duì)川桐皮中總黃酮的提取工藝進(jìn)行研究 ，對(duì)乙 醇濃度、溫度、時(shí)間、料液比分別進(jìn)行了單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，乙 醇提取法的最佳工藝條件為：提取溫度70 C,乙醇濃度70%，提取時(shí)間120min，料液比1:25(g/mL)，該工藝條件下提取總黃酮含量為 54.12 mg/g。 關(guān)鍵詞： 川桐皮 正交試驗(yàn) 總黃酮 提取Study on Extraction Technology of TotalFlavonoids

4、from Cortex KalopanacisLUO Chao-chao( Major of Biopharmaceutical Technology,School of Pharmaceutical Science and MaterialsEngineering)Abstract： To make full use of Cortex Kalopanacis resources, the extraction technology of total flavonoids from Cortex Kalopanacis was studied by single factor tests a

5、nd orthogonal experiment design method. The optimized extraction technology was that the Cortex Kalopanacis were extracted by 70% ethanol at 70 C with a materialliquid ratio of 1:25(g/mL) for 120 min. With this technological conditions, the concentration 54.12 mg/g of the total flavonoids extraction

6、 was obtained.Key words ： Cortex Kalopanacis Orthogonal experiment Total flavonoids Extraction川桐皮為五加科植物刺楸 Kalopanaxsepteml- obus (Thunb.) Koidz.或毛刺楸 K. septem lobus var. margni? cus(Zabel) Hand-Mazz. 的干燥樹皮。 刺楸為落葉喬 木，枝有粗刺。生于山地疏林中。產(chǎn)于安徽、湖北、湖南、廣西。全年可采，以 春季為好，曬干 1。依照現(xiàn)行的四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)( 1987 年版)收載了川桐皮的性狀、鑒 別、炮制、

7、性味、功能與主治、用法用量和貯藏的內(nèi)容。性狀為質(zhì)脆，斷面纖維 性，略呈層片狀。 性味為氣微， 味微辛， 略有麻舌感。 功能與主治為具有祛風(fēng)濕， 通絡(luò)，止痛作用。用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰膝疼痛、外用跌打損傷 2。樹皮含黃酮、香豆素、樹酯、精油及少量生物堿 ;根皮含刺楸毒甙( kalotoxin )、刺楸皂甙3。 。生物總黃酮是指黃酮類化合物， 是一大類天然產(chǎn)物。 黃酮類化合物是指具有C6-C3-C6基本結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物，大部分是色原酮的衍生物，根據(jù)兩端苯環(huán)與中 間三碳的連接方式、位置、直連或環(huán)及其氧化水平，衍生而成的一大類化合物。 黃酮類化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、保肝、止咳祛痰、抗氧化和

8、雌 激素樣的作用 4-8。黃酮類化合物廣泛存在于植物中，主要有黃酮和黃酮醇、二 氫黃酮和二氫黃酮醇、異黃酮和二氫異黃酮、查耳酮和二氫查耳酮類、橙酮類、 花色素和黃烷醇類、其他黃酮類七大類 9。由于人工合成的總黃酮存在著副作用大及價(jià)格昂貴等多方面缺陷， 人們逐漸 把注意力轉(zhuǎn)向從植物中提取總黃酮， 從天然物質(zhì)中提取的總黃酮具有較好的藥理 作用，且毒副作用小?？傸S酮的主要提取方法是有機(jī)溶劑提取法、 超聲波輔助提取法、微波提取法、 超臨界CO2萃取法、酶浸漬萃取法、超高壓輔助提取法等等。比較各提取方法 的優(yōu)缺點(diǎn)和考慮到當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)室條件， 本研究采用有機(jī)溶劑提取法。 目前對(duì)于川 桐皮的有關(guān)研究國內(nèi)報(bào)導(dǎo)的

9、比較少。 鑒于此， 筆者探討川桐皮中的總黃酮提取工 藝參數(shù)，旨在尋找一種提高川桐皮中總黃酮提取量的方法， 也為全面開發(fā)利用川 桐皮資源提供科學(xué)依據(jù)。1 材料與設(shè)備1.1 材料1.1.1實(shí)驗(yàn)藥材 川桐皮采自四川省成都市山區(qū)， 經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定和藥用植物教研 室李敏教授鑒定，為五加科植物刺楸 KaIopanax septemIobus(Thunb)Koidz 或 毛刺楸尼 septem-lobus vat margni，icus(Zabel)Hand-Mazz.的干燥樹皮。1.1.2 化學(xué)試劑乙醇 甲醇 石油醚(30C 60C)乙醚：廣東汕頭市西隴化工廠；乙酸乙酯： 天津市北方化玻采購銷售

10、中心；丙酮：成都市聯(lián)合化工試劑研究所；濃鹽酸：德 陽市孝泉師范化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉：重慶北碚精細(xì)化工廠；三氯化鋁 亞硝酸 - 2 -鈉：天津市科密化學(xué)試劑開發(fā)中心；硝酸鋁：天津市福晨化學(xué)試劑廠；以上試劑均為分析純。標(biāo)準(zhǔn)蘆丁( 98.5 %):成都超人植化有限責(zé)任公司。1.2儀器與設(shè)備DFT 200型手提式高速中藥粉碎機(jī)：溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生華儀器有限公司；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州市長城科工貿(mào)有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇醫(yī)療器械廠；UV-8紫外 可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；BP121S電子天平：德國賽多利斯股份

11、公司。2方法與結(jié)果2.1總黃酮含量的測(cè)定10 2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備準(zhǔn)確稱取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥(60 C, 0.09 MPa )至恒重的蘆 丁標(biāo)準(zhǔn)品0.077g，用60 %乙醇溶解，定容至250 mL ,搖勻，得濃度為0.292 6 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，放置于低溫暗箱內(nèi)，及時(shí)檢測(cè)分別吸取標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，用60 %乙醇添至10 mL ,加入5 %亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，再加入10 %硝酸鋁溶液1.0 mL ,6 min后加入4 % NaOH10 mL ,混勻，再用60 %的乙醇定容至刻度，搖

12、勻，放置15 min后，在波長510 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖 1A度 光 吸蘆丁濃度/(mg/mL)圖1蘆丁與吸光度的線性關(guān)系2.1.2樣品液制備與樣品總黃酮含量的測(cè)定準(zhǔn)確稱取1.0 g川桐皮粉，放入索氏抽提器中，用 40mL95%的乙醇，回流 浸提至回流液呈無色，用乙醇洗滌接收瓶2次3次。合并提取液與洗滌液，定容 為適當(dāng)濃度的樣品液30 mL 0準(zhǔn)確吸取1.0 mL樣品液置于25 mL容量瓶中，用60 %乙醇添至10 mL， 其它操作同2.1.1，測(cè)得吸光度Ao樣品的總黃酮濃度C=2.079 X A+0.033樣品的總黃酮含量=CX V X 25/M式中：M為樣品質(zhì)量，g；為定

13、容容積，mL ;C為樣品液的總黃酮濃度，（mg/mL ） 2.2提取工藝研究2.2.1提取溶劑對(duì)提取率的影響精確稱取多份2.5g粉碎度為100目的川桐皮粉，分別加入水、甲醇、乙醇（95%）、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（3060 C）各100 mL,在溶劑沸點(diǎn)溫度下， 回流浸提3h，抽濾、洗滌、定容，測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果見表1、圖2o(一里 含 酮 黃 總水甲醇乙醇丙酮乙酸石油醚 乙酯70650403020O表1提取劑種類對(duì)提取率的影響溶液種類水甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯石油醚總黃酮含量（mg/g）12.4157.8650.1620.399.981.25圖2提取劑種類對(duì)提取率的影響由圖2可見，實(shí)驗(yàn)的幾種溶

14、劑對(duì)川桐皮總黃酮提取能力的大小順序是：甲醇乙醇丙酮 水 乙酸乙酯石油醚222粉碎度對(duì)提取率的影響將川桐皮粉碎，篩得20、40、60、80、100、120、140目川桐皮粉備用。精確稱取2.5g不同粉碎度的川桐皮粉，用100 mL95%的乙醇，在溶劑沸點(diǎn)溫度條 件下，回流浸提3h,抽濾、洗滌、定容，分別測(cè)定總黃酮的含量，結(jié)果見表2、圖3。l)r.ag(M 含 酮 黃 總50501表2粉碎度對(duì)提取率的影響粉碎粒度/目20406080100120140總黃酮含量（mg/g）5.0513.8632.4237.2636.0238.3235.86粉碎粒度/目圖3粉碎度對(duì)提取率的影響由圖3可以看出，粉碎度不

15、同，川桐皮中總黃酮提取量有很大的差異。 粉碎 度在20目80目之間時(shí)，隨粉碎度的增加，總黃酮的浸提量增加；當(dāng)粉碎度超 過80目后，進(jìn)一步提高粉碎度，總黃酮的提取量增加不明顯。2.2.3乙醇濃度對(duì)提取率的影響精確稱取多份2.5g的80目川桐皮粉，以不同濃度乙醇為提取劑，在沸點(diǎn)溫 度條件下，回流浸提 3h，抽濾、洗滌、定容，分別測(cè)定總黃酮的含量，結(jié)果見 表3、圖4。表3乙醇濃度對(duì)提取率的影響乙醇濃度/% （體積濃度）405060708095總黃酮含量/（mg/g）28.1234.4242.2246.2345.4243.18乙醇濃度/%（體積濃度）!)rag.c/ 里含酮#(總圖4乙醇濃度對(duì)提取率的

16、影響從圖4可以看出，不同乙醇濃度（體積分?jǐn)?shù)）條件下，川桐皮黃酮類化合物 的浸提率差異較大。當(dāng)乙醇濃度為 40%70% （體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，黃酮類化合物的 浸出率隨乙醇濃度的增加而提高；乙醇濃度 70% （體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，提取率最高； 超過70% （體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，隨乙醇濃度增加黃酮類化合物浸提率略有降低。2.2.4浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響精確稱取多份2.5g的80目川桐皮粉，以70%的乙醇溶液為提取劑，在沸點(diǎn) 溫度下，分別回流浸提不同時(shí)間，抽濾、洗滌、定容，測(cè)定黃酮類化合物的含量, 結(jié)果見表4、圖5。表4浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響浸提時(shí)間/min6090120150180210總黃酮含量/（mg/g）28.

17、1236.2150.1451.2250.5449.82浸提時(shí)間/min量 含 酮#( 總圖5浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響從圖5可以看出，浸提時(shí)間在120min以內(nèi)，隨提取時(shí)間的增加，總黃酮的浸出量也隨之增加。當(dāng)浸提時(shí)間超過 120min后，川桐皮總黃酮的浸出量增加不 明顯。浸提超過150min后，總黃酮量略有降低。225浸提溫度對(duì)提取率的影響精確稱取多份2.5g的80目川桐皮粉，加入70% （體積分?jǐn)?shù)）乙醇為提取溶 劑，分別在25 （室溫）、40、50、60、70、80、90C條件下回流浸提，抽濾、洗 滌、定容，分別測(cè)定黃酮類化合物的含量，結(jié)果見表 5、圖6。表5浸提溫度對(duì)提取率的影響XJQragf

18、 卓里 含 酮 黃 總6000浸提溫度/c25405060708090總黃酮含量/（mg/g）10.1422.2138.1250.4550.9849.8647.16浸提溫度/（攝氏度）圖6浸提溫度對(duì)提取率的影響從圖6可以看出，溫度低于70C后，隨溫度的升高，黃酮類化合物的浸出率 提高；25C （室溫）時(shí)川桐皮黃酮類化合物浸出率最低， 70 C時(shí)黃酮類化合物 的浸出率最高。當(dāng)溫度超過70C后，其浸出率隨溫度升高而略有下降。2.2.6液料比對(duì)提取率的影響精確稱取2.5g的80目川桐皮粉，分別按料液比/（g/mL）為1:10、1:15、1:20、 1:25、1:30加入70% （體積分?jǐn)?shù)）乙醇，在7

19、0C條件下回流浸提120min,抽濾、 洗滌、定容，測(cè)定黃酮類化合物的含量，結(jié)果見表 &圖7。表6液料比對(duì)提取率的影響料液比/(g/mL)1:101:151:201:251:30總黃酮含量/(mg/g)28.1836.7650.5554.1256.3450403020100一里 含 酮 黃 總1:101:151:201:251:30料液比(g/ml)圖7液料比對(duì)提取率的影響從圖7可以看出，隨料液比/(g/mL)從1:10 (g/mL)增加為1:25 (g/mL)，總 黃酮的浸出率明顯增加；超過1:25(g/mL)后浸出率增加緩慢。227正交試驗(yàn)在乙醇濃度、液料比、浸提溫度、浸提時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中

20、，選擇單因子試驗(yàn)結(jié)果較好的參數(shù)，設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，結(jié)果見表7、表&表7 四因素三水平表A料液比/(g/mL)B乙醇濃度/%C時(shí)間/minD溫度/C11: 20601206021: 25701507031: 308018080表8正交試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)號(hào)A料液比/(g/mL)B乙醇濃度/%C時(shí)間/minD溫度/C黃酮含量/(mg/g)1111132.012122244.093133339.604212342.575223149.466231252.137313245.288321351.679332143.94K1115.70119.86135.81125.41/K2144.16145.22130.60

21、141.50/K3140.89135.67134.34133.84/R9.4868.4541.7375.364/從正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，極差 RaRbRdRc,液料比對(duì)川桐皮中總黃酮 浸出率的影響最大，其次是乙醇的濃度，提取的溫度值，提取時(shí)間對(duì)總黃酮浸出 率的影響最小。乙醇回流浸提川桐皮中總黃酮的最佳浸提條件為A2B2C1D2即料液比為1:25(g/mL)，提取溫度為70C，提取時(shí)間為120 min，乙醇濃度為70 % 在此條件下，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，川桐皮中總黃酮的含量為 54.12 mg/g。3結(jié)果與討論(1) 提取溶劑對(duì)提取率的影響的實(shí)驗(yàn)可以看出甲醇和乙醇是較好的川桐皮中總黃酮提取劑。分析原因

22、可能與川桐皮中總黃酮的結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)有關(guān)。因?yàn)檐蘸蛙赵?、單糖苷、雙糖苷或三糖苷等在不同的溶劑中有不同的溶解度。從川桐皮總黃酮在甲醇、乙醇中浸出率較高，在丙酮、乙酸乙酯、石油醚中浸出率較低 的事實(shí)，結(jié)合黃酮、黃酮醇、查耳酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇等的性質(zhì)，可以推 測(cè)，川桐皮總黃酮中黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類的含量相對(duì)較高。雖然甲 醇的浸出率略高于乙醇，但由于甲醇有毒，考慮到試劑的價(jià)格和安全性，所以， 本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為提取劑。(2) 粉碎度對(duì)提取率的影響的實(shí)驗(yàn)可以看出川桐皮粉碎到過80目篩是總黃 酮提取時(shí)適宜的粉碎度。分析原因，可能與總黃酮存在于川桐皮的特定組織有關(guān)。 隨粉碎度的增加，

23、更多的組織結(jié)構(gòu)被破壞，其總黃酮能被溶劑更多地提取出來， 但當(dāng)粉碎達(dá)到一定程度后，進(jìn)一步提高粉碎度，提取量不表現(xiàn)為繼續(xù)增加。（ 3）乙醇濃度對(duì)提取率的影響的實(shí)驗(yàn)可以看出不同乙醇濃度（體積分?jǐn)?shù)） 條件下，川桐皮總黃酮的浸提率差異較大。 分析原因， 可能與川桐皮黃酮類化合物 中既含有苷， 又含有一定量的苷元有關(guān)。 因?yàn)樵诓煌瑵舛鹊囊掖既芤褐兴鸵掖?的相對(duì)含量是不同的， 苷和苷元在不同濃度的乙醇溶液中有不同的浸出特性； 在 乙醇濃度為 70%（體積分?jǐn)?shù)）左右時(shí)，苷和苷元被浸提出的總量較高。提高乙 醇濃度，浸提率因苷的溶解度降低而降低。 鑒于此， 后續(xù)研究選擇了 70%乙醇溶 液為提取劑。（ 4）浸提

24、時(shí)間對(duì)提取率的影響的實(shí)驗(yàn)可以看出不同時(shí)間段下，川桐皮總黃酮的浸提率差異較大。分析原因可能與總黃酮中的某些組分在試驗(yàn)溫度下分解損 失，或與浸提時(shí)間延長，淀粉糊化量增加而阻礙了部分總黃酮被浸提出來有關(guān)。（5）浸提溫度對(duì)提取率的影響的實(shí)驗(yàn)可以看出不同溫度范圍內(nèi)，川桐皮總 黃酮的浸提率差異較大。 分析原因， 可能與在一定溫度范圍內(nèi)升高溫度有利于提 高總黃酮溶解度有關(guān)；但當(dāng)溫度超過70C后，可能因淀粉部分糊化阻礙總黃酮浸出，或因部分熱不穩(wěn)定成分受熱被破壞有關(guān)。（6）料液比對(duì)提取率的影響的實(shí)驗(yàn)可以看出不同料液比條件下，川桐皮總 黃酮的浸提率差異較大。 分析原因可能與川桐皮中總黃酮含量較高， 而在溶劑內(nèi) 的

25、溶解度又有限有關(guān)。當(dāng)溶劑用量在一定范圍內(nèi)增加時(shí)，總黃酮的浸出量增大， 浸出率增加。但當(dāng)溶劑用量增加到一定程度后， 川桐皮中總黃酮幾乎已全部溶出， 此時(shí)增加溶劑用量不能進(jìn)一步提高浸出率。 因此，選擇適當(dāng)?shù)囊毫媳葘?duì)提高川桐 皮黃酮的浸出率和減少溶劑用量有著重要的意義。（7）在進(jìn)行正交試驗(yàn)時(shí)，依照單因子試驗(yàn)結(jié)果較好的參數(shù)：乙醇濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比。得出料液比對(duì)川桐皮總黃酮浸出率的影響最大，乙 醇濃度、提取溫度次之，提取時(shí)間對(duì)總黃酮的浸出率影響最小。在溫度為70 C條件下，以70 % （體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液為提取劑，料液比 1:25（g/mL），回流浸 提120 min，川桐皮總黃酮提取量達(dá)到54.12 mg/g。參考文獻(xiàn)1 周長海刺楸資源的培育及開發(fā)利用林業(yè)科技開發(fā)，2005， 19（2）， 57-58.2 四川省衛(wèi)生廳四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn) S 1 9873 朱瑋，賈夏，張鞍靈，等刺楸屬植物化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展 J ， - 11 -西北林學(xué)院學(xué)報(bào) ,2004，19(3) ，119-124.4 匡海學(xué).中藥化學(xué)專論 M. 北京:人民衛(wèi)生出版社 ,2010:33