兔巴氏桿菌-波氏桿菌二聯(lián)蜂膠疫苗的研制及安全、效力試驗

1、兔巴氏桿菌 -波氏桿菌二聯(lián)蜂膠疫苗的研制及安全、 效力試驗 兔巴氏桿菌 - 波氏桿菌二聯(lián)蜂膠疫苗的研制及安全、效力試驗 文章標題：兔巴氏桿菌 - 波氏桿菌二聯(lián)蜂膠疫苗的研制及安全、效力試驗 兔巴氏桿菌 - 波氏桿菌二聯(lián)蜂膠疫苗的 研制及安全、效力試驗 兔多殺性巴氏桿菌?。≒m）和兔支氣管敗血波氏桿菌?。˙b）是家兔的兩種主要細 菌性傳染病 , 它們傳播迅速 , 一旦在兔場暴發(fā)流行 , 很難根除 , 經(jīng)濟損失慘重。 進行 疫苗接種是預防這兩種疾病的最有效的措施。 免疫原性好的菌 （毒）種和良好的免 疫佐劑是保證疫苗免疫效力的必要條件。因此 ，在Pm和Bb基礎菌種研究的基礎 上,對蜂膠的提取工藝進

2、行了研究 ,選取了蜂膠乙醇提取液的水溶物作為佐劑 ,研 制疫苗 , 并進行了疫苗的安全及效力試驗?，F(xiàn)將該研究結(jié)果報告如下。 1材料與方法 1.1 儀器及材料 1.1.1菌種兔多殺性巴氏桿菌Pm90株（對家兔的致死劑量為8-10個活菌,對小鼠 的致死劑量為100個活菌）;兔支氣管敗血波氏桿菌Bb82株（對小鼠的致死劑量為 1X 107個活菌,對家兔的致病劑量為1 X 108個活菌）。 1.1.2 試驗動物不同日齡的健康大耳白兔 1.1.3培養(yǎng)基含3小牛血清的馬丁瓊脂平板（SMS）、馬丁肉湯（MB）、硫乙醇酸鹽 培養(yǎng)基 （T.G）、酪胨瓊脂（G.A）、葡萄糖蛋白胨湯（G.P）等。 1.1.4 細胞

3、瓶 1.1.5 蜂膠 1.1.6 儀器 GQ（F）75 管式分離機、索氏回流裝置、溫控式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 1.2 試驗方法 1.2.1Pm90菌液的制備及檢驗 1.2.1.1 一級種子的繁殖與鑒定用滅菌生理鹽水適當稀釋 Pm90株第9代凍干菌 種，接種于0.1綿羊血紅素的馬丁瓊脂平板（BMS）上,37 C培養(yǎng)18h,然后選取5-10 個典型菌落,分別接種于 10綿羊鮮血瓊脂斜面若干 ,同上培養(yǎng)后,作為一級種子。 在4C保存,可使用7日。繼代次數(shù)不超過3代。 1.2.1.2二級種子的繁殖及鑒定將Pm90株一級種子接種于適量馬丁肉湯中,置37C 振蕩培養(yǎng)18h,取樣用SMSS養(yǎng)基作純粹檢驗；置4C保存,

4、可使用3日。 1.2.1.3制苗用菌液的培養(yǎng)將Pm9（株二級種子接種于SMS養(yǎng)基,37 C培養(yǎng)18h, 無菌水洗下菌苔 , 取樣做純粹檢驗 , 同時用平板菌落計數(shù)法計算菌液濃度 , 將菌液 濃度調(diào)整為200X 108個/ml。 1.2.1.4菌液的滅活加入0.4的甲醛溶液于菌液中，容器密封后,37 C滅活48h, 其間振搖 6-8 次, 然后進行滅活檢驗。本研究滅活檢驗及無菌檢驗用的培養(yǎng)基 為:SMS T.G、G.A和G.P。置37C條件下培養(yǎng)48h,無細菌生長說明已完全滅活。 1.2.1.5 菌液的離心、凍融滅活檢驗合格的菌液用管式分離機離心除去甲醛,無 菌刮下菌苔 , 用等量的滅菌生理鹽水

5、配成原濃度的菌液。小量分裝后反復凍融 3 次, 再次進行無菌檢驗。 1.2.2Bb82菌液的制備與檢驗將Bb82株第7代凍干菌種接種于BMS 養(yǎng)基 上,37 C 條件下培養(yǎng)24h,然后選5-10個典型菌落，分別接種于10綿羊鮮血瓊脂斜面若干， 同上培養(yǎng)后，作為一級種子。置4C保存,可使用7日。繼代不超過3代。二級種 子的繁殖以及制苗用菌液的培養(yǎng)、滅活、離心及凍融參照 1.2.1 1.2.3 蜂膠佐劑的制備經(jīng)過工藝優(yōu)化選擇 , 我們采用了醇提水溶法來制備蜂膠佐 劑。蜂膠原膠在-20C冰柜中冷凍過夜使變脆，取出后研磨粉碎，放入深色瓶中， 按1:4的比例加入80的乙醇,充分攪拌,置70C索氏回流2h

6、,然后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 中50C濃縮成浸膏狀。通過試驗,選擇合適的助溶劑,將蜂膠浸膏溶于pH7.4的 磷酸鹽緩沖液（PBS）,然后配制成40mg/ml的溶液4C避光保存?zhèn)溆谩?1.2.4配苗將上述Pm90菌液與Bb82菌液等量混勻后作為水相,蜂膠乙醇提取液 作為佐劑相 , 水相與佐劑相等量混勻后加入終濃度為 0.01 的硫柳汞 , 置膠體磨中 以8000r/min攪拌5min,然后120 xxr/min攪拌5min。無菌檢驗合格的,即可分裝 至疫苗瓶中，加塞、封蠟置4C保存?zhèn)溆?。實驗室共生產(chǎn)兔巴氏桿菌-波氏桿菌二 聯(lián)蜂膠疫苗 6批, 批號分別為 :010510、010521、010615、0106

7、28、010709和010720。 1.2.5 成品檢驗 6 個批次的兔巴氏桿菌 -波氏桿菌二聯(lián)蜂膠滅活疫苗均進行了物 理性狀、無菌檢驗以及安全檢驗。其中安全檢驗分 3 組進行, 每組均使用了不同 日齡（30、 90、 180天）的健康大耳白兔各 20只。接種后觀察 3周, 記錄家兔的臨 床反應、體溫以及是否有組織病變。 3 個組的試驗設計如下 : 一次單劑量接種組 的疫苗接種量為2ml/只;單劑量重復接種組為2次接種，中間間隔1周,劑量為 2ml/只;一次大劑量接種組的疫苗免疫量為6ml/只,采用皮下多點注射的方式進 行。 1.2.6 兔巴氏桿菌波氏桿菌二聯(lián)滅活苗的效力試驗兔巴氏桿菌部分取

8、4 批二 兔巴氏桿菌 -波氏桿菌二聯(lián)蜂膠疫苗的研制及安全、效力試驗第 2 頁 聯(lián)苗（批號:010521 、 010615、 010709、 010720）, 分為 3個免疫劑量 :1 、 2、 3ml, 分別注射 1 月齡左右的健康家兔各 20只,5 只作正常對照。 3周后每只接種 Pm90 株致死量 , 觀察 14 天, 記錄每組的死亡數(shù)。 兔波氏桿菌部分取 4 批二聯(lián)苗 （批號:010615、 010628、 010709、 010720）, 分為 3 個免疫劑量 :1 、 2、 3ml, 分別注射 1 月齡左右的健康家兔各 20 只,5 只作正常對 照。 3 周后每只接種 Bb82 株致

9、病量 , 以家兔咳嗽、鼻腔排出水樣或膿樣的鼻液 , 取鼻腔拭子能分離到Bb82株作為發(fā)病標準。觀察14天，記錄每組的發(fā)病數(shù)。 2 結(jié)果 2.1 疫苗的物理性狀檢驗 本品為棕黃色均勻混懸液 , 長期靜置后底部有少許沉淀 , 可混勻。 2.2 疫苗的無菌檢驗 待檢菌液在 SMS、 T.G、 G.A、 G.P 培養(yǎng)基上進行無菌檢驗 , 均無細菌生長。 2.3 疫苗的安全性檢驗 各批次的疫苗接種家兔后 ,家兔的體溫、食欲無明顯變化 , 注射部位也無紅腫及硬 結(jié)。 2.4 疫苗的效力試驗 2.4.1 家兔對巴氏桿菌的免疫保護試驗結(jié)果對照組的家兔在 3 天內(nèi)全部死亡 ,從 兔體的心、肝、脾、腎中都分離到了

10、巴氏桿菌。2ml以上試驗組的死亡保護率均 在 90以上（見表 1）。 表 1 家兔對巴氏桿菌的免疫效力試驗 批次 攻毒保護率（） 1ml 組 2ml 組 3ml 組 對照組 010521 60 95 95 0 010615 60 90 100 0 010709 55 100 100 0 010720 65 95 90 0 2.4.2 家兔對波氏桿菌的免疫保護試驗結(jié)果對照組的家兔在 3 天內(nèi)全部發(fā)病并自 鼻腔拭子中分離到了兔支氣管敗血波氏桿菌 ,2ml 以上試驗組的發(fā)病保護率均在 90以上（表 2）。 表 2 家兔對波氏桿菌的免疫效力試驗 批次 攻毒保護率（） 1ml 組 2ml 組 3ml 組

11、 對照組 010615 70 100 90 0 010628 60 95 100 0 010709 75 100 95 0 010720 65 95 90 0 3 結(jié)論與討論 3.1 關于菌液的生產(chǎn)工藝 制苗用兔巴氏桿菌及波氏桿菌菌液的培養(yǎng)采用了 （ 血清）馬丁瓊脂平板培養(yǎng)的方 法, 不僅容易得到高濃度的純菌液 ,也避免了液體培養(yǎng)時菌液中非抗原物質(zhì)對動 物機體的影響 ;菌液滅活后經(jīng)管式分離機離心去甲醛 , 從而避免了疫苗中的非抗 原性化學物質(zhì)對動物造成不必要的刺激 ; 離心后的菌液經(jīng)反復凍融 , 可使細菌的 細胞壁破裂或通透性增加 , 細菌細胞內(nèi)的多種抗原成分被釋放出來 , 這樣配苗時 各抗原

12、組分與蜂膠佐劑的相互作用更加充分 , 從而可增強疫苗的免疫效果。 3.2 關于蜂膠佐劑的提取工藝 蜂膠疫苗自問世以來 , 已在多種畜禽傳染病的預防中得到應用。 遺憾的是 , 用于疫 苗佐劑的蜂膠 ,大多是蜂膠的乙醇粗提液。本研究中 ,我們采用了 80 的乙醇來提 取蜂膠 , 既能提取到蜂膠中的黃酮類等醇溶成分 , 又能保留一部分水溶性的活性 物質(zhì)。所得的蜂膠醇提液用溫控式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)掉乙醇 , 然后通過大量試驗 , 選擇了適當?shù)闹軇?, 使蜂膠浸膏可以以任意比例與水互溶 , 這樣就避免了乙醇 對動物體強烈的刺激作用 ,增強了疫苗的安全性。 疫苗的效力試驗表明 ,我們選擇 的這種助溶劑不會降低蜂膠的佐劑效應。值得注意的是 , 目前市場上的蜂膠原膠 質(zhì)量良莠不齊 ,