PCR原理及應(yīng)用

1、 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)，是一項在短時間內(nèi)大量擴(kuò) 增特定的片段的分子生物學(xué)技術(shù)。 PCR又稱為無細(xì)胞克隆系統(tǒng)或特異性DNA序 列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，它可將極微量 的靶DNA在數(shù)小時內(nèi)特異地擴(kuò)增上百萬倍。 70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原 理。Saiki（1985）和Mullis（1986）兩家研究室分 別用改進(jìn)的Kleppe法獲得了大量染色體DNA單拷貝 基因。當(dāng)時的PCR技術(shù)須在每次變性和退火后，擴(kuò) 增反應(yīng)前重新加入DNA聚合酶。 1988年，由于在PCR系統(tǒng)引入了熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，這是從水生棲熱菌（Th

2、ermus aquaticus）中提取的耐熱DNA聚合酶。多次循 環(huán)后的Taq DNA聚合酶仍然具有活性，因此反 應(yīng)體系自動往復(fù)多次地進(jìn)行對所需的DNA的片 段的酶促合成，使反應(yīng)產(chǎn)物按指數(shù)增長，所以命 名為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 PCRPCR基本原理 PCR是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.它包括 三個基本步驟: (1) 變性(Denaturation):目的雙鏈DNA片段在 94下解鏈; (2) 退火(Annealing):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng) 溫度(50左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3) 延伸(Extension): DNA模板引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶 的作用下，以

3、dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基 配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互 補(bǔ)的鏈。 PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增 量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用 計算。 C代表DNA片段擴(kuò)增后的拷 貝數(shù)，表示擴(kuò)增開始時DNA模板數(shù)，P表示 平均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò) 增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均 效率達(dá)不到理論值。 PCRPCR的反應(yīng)動力學(xué) 反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指 數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增 的DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性 增長期或靜止期， 即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” 這 種效應(yīng)稱平臺期，平臺期受PC

4、R 擴(kuò)增效率、 DNA聚合酶的種類和活性及非特異性產(chǎn)物 的競爭等因素的影響。 PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段 兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個 引物鏈55端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短 產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模 板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在 第一個反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNADNA為模板， 引物是從33端開始延伸， 其55端是固定的，3 3 端則沒有固定的止點(diǎn)，長短不一，這就是“長 產(chǎn)物片段”。 PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要 同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié) 時， 由于新鏈模板的

5、5端序列是固定的， 這就等于這次 延伸的片段3端被固定了止點(diǎn)， 保證了新片段的起點(diǎn)和 止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn) 物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加， 而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加， 幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純 DNA片段供分析與檢測用。 PCR反應(yīng)的特點(diǎn) 引物與模板DNA特異正確的結(jié)合 堿基配對原則 Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性 靶基因的特異性與保守性。 靈敏度高PCRPCR反應(yīng)特點(diǎn) PCRPCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克 (pg=10(pg=10- 12 - 12) )量級的起始待測

6、模板擴(kuò)增到微克( ( g=10 g=10-6 -6) ) 水平。能從100100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病 毒的檢測中，PCRPCR的靈敏度可達(dá)3 3個PFU(PFU(空斑形成 單位) )；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3 3個細(xì)菌。 PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加 好后，即在DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在 24 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析。 PCRPCR反應(yīng)特點(diǎn)簡單、快速 不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA DNA 粗制 品及總RNARNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床 標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、 活組織等粗制的DNA

7、DNA擴(kuò)增檢測。 PCRPCR反應(yīng)特點(diǎn)對標(biāo)本的純度要求低 PCRPCR反應(yīng)體系優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系 引物 dNTPdNTP MgMg2+ 2+ TaqTaq聚合酶 模板 反應(yīng)緩沖液 引物設(shè)計的3 3條基本原則： 引物與模板的序列要緊密互補(bǔ) 引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)， 引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNADNA聚合反應(yīng)( (即 錯配) )。 PCRPCR反應(yīng)體系引物 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大 于38bp，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的

8、 序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如 GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機(jī)率增加。 引物3端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不 同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯 配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿 基A。另外，兩條引物3 3端若互補(bǔ)，或者單條引物自身形成發(fā)夾結(jié) 構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。 PCRPCR反應(yīng)體系引物設(shè)計注意事項 5端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。 可在引物設(shè)計時加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、 缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等. . 通

9、常應(yīng) 在5 5端限制酶位點(diǎn)外再加1-21-2個保護(hù)堿基。 簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子, , 例如選用只有一種密碼子的 Met, 3Met, 3端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。 兩引物間最好不存在4 4個連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反 應(yīng)，因為GCGC含量決定了DNADNA雙鏈的解鏈溫度（TmTm）。另外，上下游引 物的GC含量不能相差太大。 PCRPCR反應(yīng)體系引物設(shè)計注意事項 引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72左右可使復(fù)性條件最佳。 Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm4( (G+C) )2( (A+T)

10、 )，在 Oligo軟件中使用的是最鄰近法( (the nearest neighbor method) ) 。 G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿 基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端G值較低（絕對值不超過9），而5 端和中間G值相對較高的引物。引物的3端的G值過高，容易在錯配 位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生 引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。 對引物的修飾一般是在5端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗中要插 入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。 PCRPCR反應(yīng)體系引

11、物設(shè)計注意事項 一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0mol/L。引物過多會 產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體, 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外 分光光度計, 可精確計算引物濃度, 在1cm光程比色杯 中,260nm下,引物濃度可按下式計算： X mol/L OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩爾濃度, A、C、G、T: 引物中4種不同堿基個數(shù)。 引物濃度計算PCRPCR反應(yīng)體系 PCRPCR反應(yīng)體系 PCRPCR反應(yīng)體系 PCRPCR反應(yīng)體系模板 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵 環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SD

12、S和 蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶 解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而 破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能 與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白 質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑 酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇 或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用 于PCR反應(yīng)。 PCRPCR反應(yīng)體系模板的提取方法 PCRPCR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)體系 PCRPCR反應(yīng)體系 擴(kuò)增效率 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析 凝膠電泳分析 (1) 瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用12%的瓊脂糖 凝 膠， 供檢測用。 (2) 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：6

13、10%聚 丙烯酰胺凝膠 電泳分離效果較瓊脂糖好 酶切分析 分子雜交 測序 功能 引物設(shè)計 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析 DNADNA基序(motif)(motif)查找 同源性分析 常規(guī)PCR技術(shù)及幾類PCR新技術(shù) q熱啟動PCR qTouch-down PCR qRT-PCR q簡并引物PCR q巢氏PCR q反向PCR q不對稱PCR q原位PCR q連接酶鏈反應(yīng) qRACE-PCR qAFLP q免疫PCR(immuno-PCR)PCR(immuno-PCR) 熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異 性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫 度在72，聚合酶在室溫仍然

14、有活性。因此，在進(jìn)行PCR 反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退 火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦 形成，就會被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計的位點(diǎn)因為遺傳 元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用 于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有 效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR 反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜， 但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異 性產(chǎn)物的擴(kuò)增。 熱啟動PCR 熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合 成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加 入Taq

15、DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動 方法十分煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用。其他 的熱啟動方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分， 如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分， 如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán) 時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合 在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護(hù)層 法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量 應(yīng)用。 Platinum DNA聚合酶對于自動熱啟動 PCR來說方便高效。Platinum Taq DNA聚 合酶的成分為復(fù)合有抗Taq DNA聚合酶單克 隆抗體的重組Taq DNA聚合酶。此酶在常溫 下活性被封閉，要在94 95下加熱數(shù) 分鐘才能夠恢復(fù)酶活性。同經(jīng)化學(xué)修飾用于

16、熱啟動的Taq DNA聚合酶相比，Platinum 酶不需要在94延時保溫（10到15分鐘） 以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚 合酶，在94進(jìn)行2分鐘就可以恢復(fù)90的 Taq DNA聚合酶活性。 熱啟動PCR Touch-down PCR又稱降落PCR。即選定一個溫度范圍， 如5035 ，每降1-2 進(jìn)行1-2個循環(huán)，然后在50度 下進(jìn)行15個循環(huán)。 Touch-down的原理：隨著退火溫度的降低，特異性逐 步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經(jīng)擴(kuò)增出來，其濃 度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性 條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。 選擇初始復(fù)性溫度的原則：起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的

17、 Tm值高出5-10度，然后每個循環(huán)遞減1-2度 Touch-down PCR low copy of targeted DNA; high degree degeneracy (or less specific) of the first set of primers; RT-PCR using oligo-dT. Touch-down PCR的應(yīng)用范圍 RT-PCR RNA的多聚酶反應(yīng)（RT-PCR）是以RNA 為模板，聯(lián)合逆 轉(zhuǎn)錄反應(yīng) （reverse transcription，RT）與PCR，可用于檢測單個細(xì) 胞或少數(shù) 細(xì)胞中少于10個拷貝的RNA模板。 RNA擴(kuò)增包括兩個步驟： 在

18、單引物的介導(dǎo)下和逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補(bǔ) cDNA 加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由 DNA聚 合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA， 最后擴(kuò)增靶DNA Doubl e strand cDNA AAAAA TTTTT RT AAAAA TTTTT RT RT AAAAA TTTTT Oligo dT primer is bound to mRNA Reverse transcript ase (RT) copies first cDNA strand Reverse transcript ase digests and displaces mRNA and copi

19、es second strand of cDNA RT-PCR A. Doub le stran d DNA B. Denat ure 96 50 C. Anne al prim ers 50 D. Polym erase binds 72 Taq Taq RT-PCR cDNAcDNA第二鏈的合成方法有以下幾種: : (1) (1) 自身引導(dǎo)法 合成的單鏈cDNA 3 cDNA 3 端能夠形成一短 的發(fā)夾結(jié)構(gòu), ,這就為第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物, ,當(dāng)?shù)谝绘?合成反應(yīng)產(chǎn)物的DNA:RNADNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNADNA聚合酶 Klenow Klenow片段或反轉(zhuǎn)錄酶合成

20、cDNAcDNA第二鏈, ,最后用對單鏈特異 性的S1S1核酸酶消化該環(huán), ,即可進(jìn)一步克隆。但自身引導(dǎo)合成法 較難控制反應(yīng)，而且用S1S1核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)時無一例外地將 導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA 5mRNA 5端序列出現(xiàn)缺失和重排, ,因而該方法目前 很少使用。 (2) (2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉(zhuǎn)錄酶作用下產(chǎn) 生的cDNA:mRNAcDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性, ,而是在dNTPdNTP存在下, ,利用RNARNA 酶H H在雜交鏈的mRNAmRNA鏈上造成切口和缺口。從而產(chǎn)生一系列RNARNA 引物, ,使之成為合成第二鏈的引物, ,在大腸桿菌DNADNA聚合酶的 作用下

21、合成第二鏈。該反應(yīng)有3 3個主要優(yōu)點(diǎn): (1) : (1) 非常有效; ; (2) (2) 直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物, ,無須進(jìn)一步處理和純化; (3) ; (3) 不必使用S1S1核酸酶來切割雙鏈cDNAcDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。 RT-PCR RT-PCR優(yōu)化條件 模板 ：作為模板的RNA分子必須是完整的，并且不含DNA、蛋白和其 他雜質(zhì)。RNA中即使含有最微量的DNA，經(jīng)擴(kuò)增后也會出現(xiàn)非特異性 擴(kuò)增；蛋白若未除干凈，與RNA結(jié)合后會影響逆轉(zhuǎn)錄和PCR；殘留的 RNase極易將模板RNA降解掉。 逆轉(zhuǎn)錄酶： 1)1)目前商品化反轉(zhuǎn)錄酶有從禽類成髓細(xì)胞瘤病毒純化到的 禽類成髓細(xì)胞病毒(AMV)(

22、AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶和從表達(dá)克隆化的 MoloneyMoloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸桿菌中分離到的 鼠白血病病毒(MLV)(MLV)反轉(zhuǎn)錄酶。AMVAMV反轉(zhuǎn)錄酶包括兩個具有 若干種酶活性的多肽亞基, ,這些活性包括依賴于RNARNA的DNADNA合 成, ,依賴于DNADNA的 DNADNA合成以及對DNA:RNADNA:RNA雜交體的RNARNA部分 進(jìn)行內(nèi)切降解(RNA(RNA酶H H活性) )。MLVMLV反轉(zhuǎn)錄酶只有單個多肽亞 基, ,兼?zhèn)湟蕾囉赗NARNA和依賴于DNADNA的DNADNA合成活性, ,但降解 RNADNARNADNA雜交體中的RNARNA的能力較弱, ,且

23、對熱的穩(wěn)定性較AMVAMV反 轉(zhuǎn)錄酶差。 2)普通逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)溫度為37-42度，然而一些有豐富二級結(jié)構(gòu)的 復(fù)雜模板或者高GC含量的模板在常溫下擴(kuò)增困難，需要將逆轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)置于較高溫度下進(jìn)行改善擴(kuò)增。對于較高的反應(yīng)溫度，建議使 用cMASTER-RT酶，該酶在37-60度的溫度范圍內(nèi)都能保持良好的 活性，使用cMASTER-RT酶，可以增加反應(yīng)產(chǎn)量，還可以增加逆 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的特異性。因為，對于使用基因特異性引物（GSP）進(jìn)行 cDNA合成時，較高的反應(yīng)溫度允許使用Tm值較高的基因特異性引 物。 Taq酶 普通的Taq酶擴(kuò)增能力很強(qiáng)但是錯配率高，雖然高產(chǎn)但是最 大只能 擴(kuò)增3-5kb的片段；而本身

24、帶有校讀功能的高保真酶有很高的 保真度，不易出錯，可擴(kuò)增較長的片段，但是產(chǎn)量偏低。 TripleMaster酶則是一個高保真的混合酶在保留Taq酶的高聚合能 力，保證高產(chǎn)的同時，還有效降低了Taq的錯配率，大大提高了保真 性。 RT-PCR buffer 引物：(1)(1)上下游引物設(shè)計在跨內(nèi)含子的兩個外顯子的3 3端和下一個 外顯子的5 5端，這樣不會在基因組上擴(kuò)出來。(2)(2)設(shè)計在兩個離得遠(yuǎn)的 外顯子上，這樣從基因組和cDNAcDNA上得到的片段長度不一樣，可以一 引兩用。 Random 9mers 適用于長的及具有Hairpin構(gòu)造的RNA。適用于 rRNA、mRNA、tRNA等所有

25、RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) (用Random 9mers合成cDNA后，任何特異性的 Primer pair都可用于PCR反應(yīng))。 Oligo dT-Adaptor Primer適用于具有Poly(A)+ tail的RNA。 注: 原核生物的RNA、真核生物的rRNA及tRNA (某 些種類真核生物的mRNA)不具有Poly(A) tail。本 Primer設(shè)計巧妙，反轉(zhuǎn)錄效率高。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后， 用M13 Primer M4可進(jìn)行3-RACE。 一步法： 利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、 Taq酶、4種dNTP 直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)Taq酶 不僅具有DNA多聚酶的作

26、用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙 重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后PCR擴(kuò) 增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化。所需樣品量減少到最低限 度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢測出總RNA中 小于1ng的低豐度mRNA。該法可用于低豐度mRNA的cDNA文庫 的構(gòu)建及特異cDNA的克隆，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合， 使得自動反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在單管中進(jìn)行。 RT-PCR一步法和兩步法 兩步法：由于單管反應(yīng)時RT和PCR都不能在最佳條件下 進(jìn)行并且 容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴(kuò)增 較短的基因，及定量PCR。兩步法則是將RT和

27、PCR分別 進(jìn)行，這樣使得兩個反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點(diǎn)，更為靈 活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些GC含量、二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或 者是未知模板，以及多個基因的RT-PCR。 RT-PCR一步法和兩步法 兼并引物PCR（Degenerate Primer） 密碼子的簡并性 氨基酸密碼子數(shù) 、 、 、 、 簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能 性的不同序列的混合物。簡并度越低，產(chǎn)物特異性越 強(qiáng)。設(shè)計引物時應(yīng)盡量選擇簡并性小的氨基酸，并避 免引物33末端簡并，因為3 3端最后3 3個堿基的退火足以 在錯誤位點(diǎn)起始PCRPCR；次黃嘌呤可以同所有的堿基配 對，降低引物的退火溫度。 兼并引物PCR（Degen

28、erate Primer） 巢氏PCR（Nested PCR） 巢氏PCR需要兩到三對引物，一般采用第一套引物擴(kuò)增15- 30個循環(huán)，再用擴(kuò)增DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15- 30個循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增，而次級結(jié)構(gòu) 卻很少擴(kuò)增。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而 增加了特異性擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率。 若將套式PCR的內(nèi)外引物稍加改變，延長外引物長度 （25-30bp），同時縮短內(nèi)引物長度（15-17bp），使外引物 先在高退火溫度下復(fù)性，做雙溫擴(kuò)增，然后改換至三溫循環(huán)， 使內(nèi)引物在外引物擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，在低退火溫度復(fù)性，直到 擴(kuò)增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入

29、。 反向PCR（Inverse PCR） 反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也 就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合 成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知 染色體序列，因此又稱為染色體步移。這時選擇的引物雖然 與核心DNA兩末端序列互補(bǔ)，但引物3端是相互反向的。 反向PCR的操作流程：擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品 DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀分子，通過反向 PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段。 選擇多種限制性內(nèi)切酶，基本準(zhǔn)則是選擇不能在 非酶切位點(diǎn)切斷靶DNADNA的酶。裂解核心區(qū)的內(nèi)切 酶使反向PCRPCR只能擴(kuò)增引物所定模

30、板( (依賴于引物) ) 的上游或下游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩側(cè)序 列都擴(kuò)增 SouthernSouthern雜交來確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化 及反向PCRPCR的片段的末端片段 大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列， 所以往往需要兩組到三組嵌套引物 反向PCR（Inverse PCR） 不對稱PCR（Asymmetric PCR） 不對稱PCRPCR的基本原理是采用不等量的引物產(chǎn)生大量的 單鏈DNADNA（ss-DNAss-DNA）。這兩種引物分別稱為限制性引物與 非限制性引物；其最佳比例一般為1 1：501501：100100，關(guān)鍵是 限制引物的絕對量。限制性引物太多太少，均

31、不利于ss-ss- DNADNA。 不對稱PCRPCR反應(yīng)過程：一般來說，在不對稱PCRPCR反應(yīng)中， 在 開始的20-2520-25個循環(huán)中，兩個比率不對稱的擴(kuò)增引物產(chǎn)生 出雙鏈DNADNA，當(dāng)限量的那個引 物耗光后，隨后的5-105-10個循 環(huán)就產(chǎn)生出ssDNAssDNA。 產(chǎn)生的ds-DNAds-DNA與ss-DNAss-DNA由于分子量不同，可以通過電 泳分離。 一般對100lPCR反應(yīng)體系而言，當(dāng)引物比 率為50pmo:0.5pmol，經(jīng)過30個循環(huán)后，大約可 產(chǎn)生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的產(chǎn)量可用下列 幾種方法來估計: a)在ss-DNA合成過程中，摻入32P-dN

32、TP。取 10%的反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)過瓊脂糖電泳分離后，放 射自顯影。 b)取5%的反應(yīng)物來走膠，轉(zhuǎn)移到膜上，并用與 ssDNA互補(bǔ)的寡核苷酸為探針雜交。 不對稱PCRssDNA產(chǎn)物量 解決不對稱PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率低的方法： 增加PCR循環(huán)的次數(shù) 在最后五個循環(huán)中多加Tab聚合 酶(2U) 試一下相反的不對稱引物比率。有時，相反的 不對稱引物比率可能給出不 同產(chǎn)量的ssDNA。 In situ PCR 原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)， 它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度 特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞學(xué)科研與 臨床診斷領(lǐng)域里的一項有較大潛力的新技術(shù). 原位PCR是Hasse等于1

33、990年建立的，實(shí)驗用 的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì) 胞等.其基本方法為固定組織或細(xì)胞:將組織細(xì)胞固 定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處 理，再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶.蛋白酶K消 化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片 55消化處理2h后，962min以滅活蛋白酶K. PCR擴(kuò)增:在組織細(xì)胞片上，加PCR反應(yīng)液，覆 蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板 上，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增.有的基因擴(kuò)增儀帶有專 門用于原位PCR的裝置.雜交:PCR擴(kuò)增結(jié)束 后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交. 顯微鏡觀察結(jié)果. 原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞

34、，又 能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞 水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理 的轉(zhuǎn)歸有重大的實(shí)用價值.其特異性和敏感性 高于一般的PCR. 原位PCR 連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction(Ligase chain reaction，LCR)LCR)，是一種新 的DNADNA體外擴(kuò)增和檢測技術(shù)，主要用于點(diǎn)突變的研究及靶基因 的擴(kuò)增. . 連接酶鏈反應(yīng)是Backman1997Backman1997年為檢出靶基因序列中的點(diǎn) 突變而設(shè)計發(fā)明，并申報了專利.1988.1988年LandegrenLandegren也進(jìn)行了 該項研究.1988.1988年BackmanBa

35、ckman等又因分離熱穩(wěn)定的連接酶，而申 報專利，19911991年BackmanBackman和BaranyBarany分別用耐熱DNADNA連接酶進(jìn)行 了LCRLCR試驗. .耐熱DNADNA連接酶可以在熱循環(huán)中保持活性，提高連 接反應(yīng)的特異性，排除了背景擴(kuò)增和免除了不斷補(bǔ)充酶的繁 瑣程序. . 連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction(Ligase chain reaction，LCR)LCR) LCRLCR的基本原理為利用DNADNA連接酶. .特異地將雙鏈DNADNA片 段連接，經(jīng)變性- -退火- -連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶基因 序列大量擴(kuò)增. .其程序為: :在

36、模DNADNA、DNADNA連接酶、寡核苷酸引 物以及相應(yīng)的反應(yīng)條件下，首先加熱至一定溫度下(94(94 95)95)使DNADNA變性，雙鏈打開，然后降溫退火(65)(65)，引物與 之互補(bǔ)的模板DNADNA結(jié)合并留下一缺口，如果與靶序列雜交的 相鄰的寡核苷酸引物與靶序列完全互補(bǔ)，DNADNA連接酶即可連 接封閉這一缺口，則LCRLCR反應(yīng)的三步驟( (變性- -退火- -連接) )就 能反復(fù)進(jìn)行，每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中作模 板，使更多的寡核苷酸被連接與擴(kuò)增. .若連接處的靶序列有 點(diǎn)突變，引物不能與靶序列精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空 間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，也就不能

37、形成連接產(chǎn) 物. . 連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction(Ligase chain reaction，LCR)LCR) Ligase chain reaction (LCR) Ligase chain reaction (LCR) Denaturati on 70C Annealing and Ligation 40C Denaturati on 70C Ligase chain reaction (LCR) LCRLCR的引物是兩對分別互補(bǔ)的引物，引物長度為 20202626個，以保證引物與靶序列的特異性結(jié)合，LCRLCR 識別點(diǎn)突變的特異性高于PCRPCR，其特異性首先取決于 引物與模板的特異性結(jié)合，其次是耐熱連接