冰凍切片步驟很全面

1、本文檔如對你有幫助，請幫忙下載支持！冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接用切片機(jī)切片。 它實際上 是以水為包埋劑， 將組織進(jìn)行冰凍至堅硬后切片的。 在冰凍切片前組 織不經(jīng)過任何化學(xué)藥品處理或加熱過程， 大大縮短了制片時間。 同時， 由于此法不需要經(jīng)過脫水、透明和浸蠟等步驟，因而較適合于脂肪、 神經(jīng)組織和一些組織化學(xué)的制片， 并作為快速切片的方法應(yīng)用在臨床 診斷。1. 取材：應(yīng)盡可能快地采取新鮮的材料，防止組織發(fā)生死后變化。2. 速凍：為了較好地保存細(xì)胞內(nèi)的酶活性或盡快制成切片標(biāo)本的需 要，一般在取材后就要立刻對組織塊進(jìn)行速凍，使組織溫度驟降，縮 短降溫的時間，減少冰晶的形成。液氮速凍切片法是實驗

2、室最常用的速凍切片方法。 具體做法是將 組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm）,如組織塊小可適量加 OCT 包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮 的小杯內(nèi), 當(dāng)盒底部接觸液氮時即開始?xì)饣序v, 此時小盒保持原位 切勿浸入液氮中,大約 10-20s 組織即迅速冰結(jié)成塊。在制成凍塊后, 即可置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。 若需要保存, 應(yīng)快速以鋁箔或塑料 薄膜封包，立即置入-80 C冰箱貯存?zhèn)溆谩?固定：樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，4C冰箱預(yù)冷5-10min讓OCT膠浸透組織。取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。組織置于樣品托上，其上再添一層 OCT膠，以

3、完全覆蓋為宜，速 凍架（PE 上30min。4.切片：恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī)， 其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī) 置于低溫密閉室內(nèi)， 故切片時不受外界溫度和環(huán)境影響， 可連續(xù)切薄 片至5-10 z。切片時，低溫室內(nèi)溫度以-15 C-20C為宜，溫度過低 組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切 勿上下移動。切好室溫放置 30min后，入4C丙酮固定510min，烘 箱干燥20min。PBS洗5minX3。進(jìn)行抗原熱修復(fù)，微波熱修復(fù)也可， 室溫自然冷卻。可用3%H2O2孵育510min,消除內(nèi)源性過氧化物酶 的活性。5免疫熒光染色：冰凍切片室溫晾干15min,可用含10%正常

4、山羊血清的PBS室溫 封閉切片 1 小時（此步可不洗）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液 （抗體的量視組織大小而 定,原則是可以均勻覆蓋組織面,且保證整個過程中不會使組織干 涸），將切片放在加了 PBS的免疫組化濕盒，室溫孵育 2小時或4C 過夜。第二天先將濕盒放到37C回溫1h，然后吸取片上的一抗進(jìn)行回 收，將切片插入到小染缸PBS沖洗。滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中37C孵育1 小時?；厥斩?，切片置于染缸內(nèi)，PBS洗 5minX3次。滴加 DAPI工作液染核，室溫10-20min（工作濃度 0.1%染色15min）。回收DAPI,滴加5-10卩抗熒光衰減封片劑或中性樹膠