生物技術(shù)制藥實驗指導(dǎo)

1、生物技術(shù)制藥實 驗 指 導(dǎo)主編王金華 蘇華偉西南林學(xué)院資源學(xué)院生物技術(shù)教研室二oo三年十二 月目 錄序 言ii一、生物藥物原料的選擇、處理與保存1二、包埋法制備固定化細(xì)胞3三、吸附層析提取鳥巢菌素5四、液相層析分離、純化蛋白質(zhì)類藥物7五、半成品藥物質(zhì)量檢測蛋白質(zhì)含量測定10六、蛋白質(zhì)藥物相對分子量測定sds-page13七、蛋白質(zhì)藥物純度檢測sds-page18八、抗體診斷玻片直接凝集法檢測血型20九、單克隆抗體的制備22十、植物藥物制備技術(shù)實驗25十一、大蒜細(xì)胞sod的提取與分離30十二、動物藥物制備實驗卵磷脂制備34十三、設(shè)計實驗分泌抗生素的微生物菌種的選育附 錄37 序 言 生物技術(shù)是一

2、門具有悠久歷史、又與現(xiàn)代科學(xué)和技術(shù)密切結(jié)合的學(xué)科。20世紀(jì)70年代以來，dna重組技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，賦予了生物技術(shù)嶄新的內(nèi)容，使之成為真正的高技術(shù)領(lǐng)域現(xiàn)代生物技術(shù)。它促使工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)發(fā)生了革命性的變化，特別是用于醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的醫(yī)藥生物技術(shù)的發(fā)展，使疾病的治療和診斷、藥物的研究和生產(chǎn)以及其他衛(wèi)生保健事業(yè)出現(xiàn)了嶄新的局面。其中最成功的是生物技術(shù)用于新型藥物的研制，已有近30種基因工程藥物投放市場，產(chǎn)生了巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益，對新藥的研制、開發(fā)以及未來醫(yī)藥工業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整產(chǎn)生重大影響。21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，21世紀(jì)是新材料和先進(jìn)制造技術(shù)迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的時代，21世紀(jì)

3、是高效、潔凈和安全利用新原料的時代，21世紀(jì)是人類向空間、海洋、地球內(nèi)部不斷拓展的世紀(jì)，21世紀(jì)是自然科學(xué)發(fā)生重大變革、取得突破性進(jìn)展的時代。醫(yī)藥工業(yè)則被譽(yù)為21世紀(jì)的“朝陽產(chǎn)業(yè)”，特別是現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，更促進(jìn)了當(dāng)今世界制藥工業(yè)的迅猛發(fā)展?？茖W(xué)技術(shù)的發(fā)展、新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)對我國這樣的發(fā)展中國家來說，既是挑戰(zhàn)，也是機(jī)遇，而能否抓住發(fā)展機(jī)遇關(guān)鍵在于提高全民族的科學(xué)文化水平，造就一支具有科學(xué)精神、懂得科學(xué)方法、具有知識創(chuàng)新和技術(shù)創(chuàng)新能力的高素質(zhì)勞動者隊伍。所以，發(fā)展和普及科學(xué)知識、弘揚(yáng)科學(xué)精神、提倡科學(xué)方法是我們應(yīng)對世紀(jì)挑戰(zhàn)的首要策略。為此，1999年8月，江總書記在視察中國科學(xué)院大連化學(xué)物

4、理研究所時進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了科普工作者的重要性：“在加強(qiáng)科技進(jìn)步和創(chuàng)新的同時，我們應(yīng)該大力加強(qiáng)全社會的科學(xué)普及工作，努力提高全民族的科學(xué)文化素質(zhì)。這項工作做好了，就可以為科技進(jìn)步和創(chuàng)新提供廣泛的群眾基礎(chǔ)。”所以我們應(yīng)加速現(xiàn)代生物技術(shù)制藥的人才培養(yǎng)，以迎接21世紀(jì)的挑戰(zhàn)。生物藥物包括從動物、植物、微生物、人和各種海洋生物中制取的以及運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)生的各種天然生物活性物質(zhì)及其人工合成或半合成的天然物質(zhì)類似物。它在醫(yī)療上具有藥理活性高、針對性強(qiáng)、毒性低、副作用小療效可靠及營養(yǎng)價值高等鮮明、顯著的特點，已越來越受到人們的青睞和重視。而近半個世紀(jì)生命科學(xué)的飛速發(fā)展給生物藥物的開發(fā)和利用賦予新的生命，使生物

5、藥物成為當(dāng)今發(fā)展最快、影響最大的藥物之一。本書著重介紹生物技術(shù)制藥過程中涉及的重要方法和技術(shù)，可根據(jù)時間和要求情況，選用部分實驗。每個實驗后面都附有相關(guān)的思考題，書后編有附錄，可供讀者查閱。王金華 主編 2003年12月于昆明實驗一 生物藥物原料的選擇、處理與保存一、目的要求了解各種不同生物藥物原料的來源，學(xué)習(xí)并掌握各種原料的選擇原則、處理及保存方法。二、基本原理生物藥物原料以天然的生物材料為主，包括人體、動物、植物、微生物和各種海洋生物等。生物藥物的提取與分離方法因為原材料、藥物的種類和性質(zhì)的不同而有很大差異。因此在選擇時應(yīng)注意選擇有效成分含量高、原料新鮮、來源豐富、雜質(zhì)含量少的原料，還要選

6、擇最佳采集時間。原料的處理依原料種類的不同而不同。動物原料采集后要立即處理，去處結(jié)締組織、脂肪組織等，并迅速冷凍貯存；植物原料確定后，要擇時采集并就地去除不用的部分，將有用部分干燥、保鮮處理；微生物原料收集時，要及時將菌細(xì)胞與培養(yǎng)液分開，進(jìn)行保鮮處理。原料的保存方法主要有三種：冷凍法、有機(jī)溶劑脫水法和防腐劑保鮮法。本實驗著重介紹有機(jī)溶劑脫水法。有機(jī)溶劑脫水法：植物、動物組織中常含有較多的脂肪和微生物，該類物質(zhì) 不僅容易氧化酸敗，導(dǎo)致原料變質(zhì)，而且還會影響純化操作和制品收率。因此將動、植物原料置于脂溶性有機(jī)溶劑（如丙酮、乙醚）中進(jìn)行脫脂、脫水，制成丙酮干粉，長期保存。三、器材剪刀，研缽，離心機(jī)，

7、表面皿，冰箱冷丙酮四、操作步驟1、取植物組織（芹菜葉片）適量（10-20g），用水洗凈，甩干；2、用剪刀將之剪碎，放入研缽，加入5v的冷丙酮，研磨成漿糊狀；3、將漿糊狀研磨物倒入50ml離心管，-20，靜置30min；4、取出，于4，4000rpm，離心20min；5、倒去上清液，將沉淀撥至表面皿中，室溫自然風(fēng)干，制成丙酮干粉，4可長期保存。五、實驗報告思考題：1、各種不同生物藥物原料的選擇原則是什么？2、不同生物藥物原料的處理及保存方法有哪幾種？實驗二 包埋法制備固定化細(xì)胞一、目的要求了解細(xì)胞、酶固定化的方法，掌握固定化細(xì)胞、固定化酶的定義和固定化后細(xì)胞和酶的性質(zhì)變化，以及包埋法固定化細(xì)胞的

8、方法。二、基本原理固定化細(xì)胞主要是利用細(xì)胞中的酶類催化小分子的底物進(jìn)行酶反應(yīng)。酶反應(yīng)幾乎都是在水溶液中進(jìn)行的，屬于均相反應(yīng)。均相酶反應(yīng)系統(tǒng)自然簡便，但是也有許多缺點，如溶液中的游離酶只能一次性利用，不僅造成酶的浪費(fèi)，而且會增加產(chǎn)品分離的難度和費(fèi)用，影響產(chǎn)品的質(zhì)量；另外溶液酶很不穩(wěn)定，溶液變性和失活。如能將酶制劑制成既能保持其原有的催化活性、性能穩(wěn)定、又不溶于水的固行物，即固定化酶（或固定化細(xì)胞），則可像一般固定催化劑那樣使用和處理，就可以大大提高酶的利用率。與固定化酶類似，細(xì)胞也能固定化。生物細(xì)胞雖然屬于固相催化劑，但是因為其顆粒微小難于截留或固定，也需要固定化。固定化細(xì)胞既有細(xì)胞特性和生物催

9、化劑的功能，也具有固相催化劑的特點。被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞，固定化細(xì)胞的制備方法有載體結(jié)合法、包埋法、交聯(lián)法和無載體法等。包埋法是將細(xì)胞定位于凝膠網(wǎng)格內(nèi)的技術(shù)，常用的載體有卡拉膠、聚乙烯醇、瓊脂、明膠和海藻膠。從海藻中提獲得的藻酸鹽（常為鈉鹽），是d-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的線性共聚物，多價陽離子（如ca2+、al3+）可誘導(dǎo)其形成海藻凝膠。將微生物細(xì)胞或酶與藻酸鈉溶液混合后，通過注射器針頭將上述混合液滴入cacl2溶液中，ca2+從外部擴(kuò)散進(jìn)入藻酸鈉-細(xì)胞混合液珠內(nèi)，使藻酸鈉轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿脑逅徕}凝膠，由此將細(xì)胞或酶包埋其中。三、器材10ml注射器，5#針頭，燒杯，三角瓶

10、，離心機(jī)，磁力攪拌器，玻棒光合細(xì)菌，4%海藻酸鈉溶液，2.5% cacl2四、操作步驟1、將光合細(xì)菌培養(yǎng)液在4000rpm離心20min后，收集菌體于燒杯中，備用；2、向燒杯中的菌體加入等體積的ddh2o，制成稀的懸浮菌液；3、按照1：5的比例將懸浮菌液緩慢倒入4%藻酸鈉溶液中，并用玻棒不斷攪拌，使之充分混勻；4、用注射器吸取10ml上述菌體-藻酸鈉混合液，加上針頭，滴入正在進(jìn)行磁力攪拌的2.5% cacl2溶液中；5、傾去cacl2溶液，用ddh2o沖洗藻酸鈣凝膠珠3次，濾干，4備用。五、實驗報告思考題：1、藻酸鈣凝膠珠為什么呈現(xiàn)均勻的紅色？2、固定化細(xì)胞、固定化酶的優(yōu)點有哪些？3、與固定化

11、之前的細(xì)胞、酶相比較，固定化細(xì)胞、固定化酶的性質(zhì)有了什么變化？實驗三 吸附層析提取鳥巢菌素一、目的要求學(xué)習(xí)吸附層析的基本原理和方法，掌握硅膠正相吸附層析的基本工藝流程。二、基本原理吸附現(xiàn)象是表面的一個重要性質(zhì)之一，是指固體表面對氣體分子或液體分子的吸著現(xiàn)象，其作用力可以是物理吸附作用，也可以是化學(xué)吸附作用，如范德華力、靜電力、共價結(jié)合力以及氫鍵作用等。吸附色譜就是利用固定相對混合物中不同物質(zhì)的吸附力不同而使其中的不同組分相互分離的方法。硅膠（silica gel）是常用無機(jī)基質(zhì)層析劑，它的化學(xué)成分是二氧化硅，它其實是分子量巨大的無機(jī)高分子。用作吸附層析分離介質(zhì)的硅膠是人工合成的多孔二氧化硅，其

12、特點是表面含有很多硅羥基團(tuán)（或稱硅醇基團(tuán)），參與各種化學(xué)鍵合和疏水吸附，用于層析。一般認(rèn)為，硅膠表面的硅羥基團(tuán)可以有3種不同的類型（圖3-1），其中以自由（或孤立）硅羥基對各種鍵合反應(yīng)最為重要。圖3-1 硅羥基的類型三、器材硅膠（柱層析用），層析柱系統(tǒng)裝置，燒杯，玻棒鳥巢菌發(fā)酵液，甲醇，氯仿，ddh2o四、操作步驟1、將硅膠用等體積的甲醇溶脹；2、裝柱；3、用23v體積的甲醇平衡層析柱，流速2ml/min；4、將濃縮的鳥巢菌發(fā)酵液樣品上樣；5、甲醇-氯仿梯度洗脫，觀察洗脫現(xiàn)象；6、收集洗脫樣品，2ml/tube；7、將各組分樣品于4保存，待檢測。五、實驗報告1、分析所收集到的各段產(chǎn)物的疏水性強(qiáng)

13、弱。2、了解其他層析介質(zhì)的性質(zhì)和分離純化依據(jù)。實驗四 液相層析分離、純化蛋白質(zhì)類藥物一、目的要求學(xué)習(xí)凝膠過濾層析分離、純化物質(zhì)的基本原理和方法，掌握凝膠過濾層析的基本工藝流程。二、基本原理凝膠過濾層析，也稱為分子大小排阻層析，是一種根據(jù)蛋白質(zhì)類物質(zhì)分子的大小和形狀來進(jìn)行分離的方法。與其他類型的層析技術(shù)不同，在理想的理論情況下，凝膠過濾不涉及蛋白質(zhì)與填料（凝膠）之間的吸附或排斥作用。凝膠過濾柱是由均勻裝填的多孔凝膠微粒組成，蛋白質(zhì)是基于不同蛋白質(zhì)通過這些微孔的遷移能力的不同而被分離的。如果一蛋白質(zhì)的大小與微孔的大小相比很大，它永遠(yuǎn)也不會進(jìn)入這些微孔，在通過層析柱時它就會在凝膠顆粒外面繞行而不是從

14、顆粒內(nèi)穿行。如果一蛋白質(zhì)或小分子（如緩沖液的成分）與凝膠過濾填料上的微孔相比很小，這些小分子就會不受阻礙地在凝膠顆粒內(nèi)穿行，實際上，顆粒對于小分子來說已成了無形之物。因此，大的蛋白質(zhì)將比小分子更迅速地遷移通過凝郊過濾柱。三、器材sephacryl s-300hr凝膠，吸管，柱色譜分離裝置，eppendorf管淀粉酶工程菌株，ddh2o，0.05m naac溶液四、操作步驟1、將sephacryl s-300hr凝膠用0.05m naac-hac緩沖液平衡后，裝柱；2、用0.05m naac緩沖液過柱1h，充分平衡層析柱，流速2ml/min；圖4-1 柱色譜分離裝置圖4-2 凝膠色譜分離原理示意

15、圖3、將濃縮的淀粉酶工程菌發(fā)酵上清液樣品上樣；4、用0.05m naac緩沖液洗脫；5、收集各洗脫峰樣品，收集速率為10sec/tube；6、將各組樣品于4保存，待檢測。7、層析柱再平衡。五、實驗報告1、繪制凝膠色譜分離、純化不同分子量蛋白質(zhì)類物質(zhì)的原理過程圖。2、比較凝膠色譜和其他類型色譜的差異。3、凝膠色譜分離出的物質(zhì)其流出的先后順序和其分子量大小之間有關(guān)系嗎？如果有，那么二者關(guān)系如何？實驗五 半成品藥物質(zhì)量檢測蛋白質(zhì)含量測定一、目的要求學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)含量測定的方法lowry法的基本原理，并掌握該法的操作。二、基本原理用于蛋白質(zhì)測定的lowry反應(yīng)是雙縮脲方法的發(fā)展，首先是在堿性溶液中形成銅-

16、蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后這一復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（folin試劑），產(chǎn)生鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物的深藍(lán)色，這種深藍(lán)色的復(fù)合物在500nm處有最大的吸收峰，顏色深淺（吸收值）與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)500nm的光吸值大小計算蛋白質(zhì)的含量。這個測定方法靈敏，但費(fèi)時。進(jìn)行測定時，加folin-酚試劑要特別小心，因為folin-酚試劑僅在酸性ph條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只是在ph10的情況下發(fā)生，故當(dāng)folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻，以便磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。三、器材分光光度計，比色杯，試管，試管架，加樣槍，槍頭

17、，震蕩器，一次性手套，量筒，濾紙，洗瓶0.25mg/ml bsa，4% na2co3，0.8% naoh，1%cuso4，2% 酒石酸鈉，folin-酚試劑spss 數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)四、操作步驟1、將4% na2co3：0.8% naoh=1：1，制備a液；2、將1%cuso4：2% 酒石酸鈉=1：1，制備b液；3、將a：b=50：1，制備c液；4、取0.25mg/ml bsa0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分別加入5支試管中，用ddh2o補(bǔ)充至1.0ml；5、取樣品1.0ml于另一支試管中；6、向每支試管中加入c液5ml，震蕩器混勻，靜置10min；7、再向每支試管中加入foli

18、n-酚試劑0.5ml，混勻，靜置30min；8、測定od500，ddh2o做對照。9、已光吸值為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度（或者含量g）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量的依據(jù)。五、實驗報告1、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用spss軟件處理所得數(shù)據(jù)，并求出回歸方程。圖5-1 lowry檢測法標(biāo)準(zhǔn)曲線2、由標(biāo)準(zhǔn)曲線中的回歸方程求得樣品中蛋白質(zhì)濃度，并將濃度單位換算成mg/ml。實驗六 蛋白質(zhì)藥物相對分子量測定sds-page一、目的要求了解sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page）的基本原理，學(xué)習(xí)并掌握電泳測定蛋白質(zhì)分子量的方法。二、基本原理sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page）是對蛋白質(zhì)進(jìn)行量化，比較及特性

19、鑒定的一種經(jīng)濟(jì)、快速，而且可重復(fù)的方法。該法主要依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量對其進(jìn)行分離。sds與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，并使其穩(wěn)定地存在于一個廣泛均一的溶液中。sds蛋白質(zhì)復(fù)合物的長度與其分子量成正比。由于在樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。sds-page因易于操作和廣泛的用途，使它成為許多研究領(lǐng)域中一種重要的分析技術(shù)。圖6-1 凝膠電泳原理示意圖a電泳開始前 b電泳結(jié)束時三、器材垂直凝膠電泳裝置，微量加樣槍，電泳儀，沸水浴，eppendorf管，搖床丙烯酰胺，n,n-甲叉雙丙烯酰胺，tris

20、-base，sds，temed，10%過硫酸銨，-巰基乙醇，甘油，溴酚藍(lán)，甘氨酸，鹽酸，dtt，考馬斯亮藍(lán)r-250，甲醇，冰乙酸四、操作步驟1、組裝凝膠模具，如圖6-2所示；圖6-2 凝膠模具組裝示意圖溶液用量(10 ml)a液 2.7mlb液2.5ml蒸餾水4.8ml10%過硫酸銨50ltemed5l 圖6-3 用滴管將灌制分離膠 2、灌制分離膠；舉例：兩塊8%的分離膠（6cm8cm0.75cm）小心地將上述凝膠溶液加入模具內(nèi)，如圖6-3所示，等待60min，使凝膠聚合； 溶液用量(4ml)a液0.67mlc液1.0ml蒸餾水2.3ml10%過硫酸銨30ltemed5l3、灌制濃縮膠舉例：

21、兩塊5%的分離膠（6cm8cm 0.75cm）小心地將上述凝膠溶液加入模具內(nèi)，插入梳子，如圖6-4、6-5所示。等待30min，使凝膠聚合后，小心拔出梳子，不要將加樣孔撕裂。將電泳緩沖液加入電泳槽；圖6-4 將濃縮膠溶液用吸管加入凝膠模具圖 6-5 將加樣孔梳子插入濃縮膠4、制備樣品和上樣：樣品加入等體積的樣品緩沖液，在沸水浴中加熱5min，取出，冷卻，用微量加樣槍加入上樣孔中，如圖6-6所示；圖6-6 將蛋白質(zhì)樣品加入樣品孔中5、電泳（200v，100ma，3h）；6、考馬斯亮藍(lán)染色（1）染色25min；97.4kd66.2kd 43.0kd 31.0kd 20.1kd 14.4kd1 2

22、3 4 5 6 7 8 9 10 （2）脫色30min。圖6-7 蛋白質(zhì)凝膠電泳結(jié)果圖2 某發(fā)酵原液，1,3-5,9 初純樣品6-8 純樣品，10 protein marker五、實驗報告1、以相對遷移率為橫坐標(biāo)，lgmw為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6-8 6種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)凝膠電泳測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線2、由該標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)遷移率rf，測定樣品蛋白質(zhì)的分子量。3、異常遷移的原因是什么，如何解決？實驗七 蛋白質(zhì)藥物純度檢測sds-page一、目的要求了解sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-page）的基本原理，學(xué)習(xí)并掌握電泳測定蛋白質(zhì)純度的方法。二、基本原理sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sds-pa

23、ge）是對蛋白質(zhì)進(jìn)行特性鑒定的一種經(jīng)濟(jì)、快速、可重復(fù)的方法。該法主要依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量對其進(jìn)行分離。sds與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，并使其穩(wěn)定地存在于一個廣泛均一的溶液中。sds-蛋白質(zhì)復(fù)合物的長度與其分子量成正比。由于在樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。因此可以利用sds-page分析蛋白質(zhì)混合物的純度。三、器材同實驗六四、操作步驟1、組裝凝膠模具；2、灌制分離膠；3、灌制濃縮膠4、制備樣品和上樣5、電泳（200v，100ma，3h）；6、考馬斯亮藍(lán)染色五、實驗報告1、根據(jù)染色的電泳膠

24、板，分析各泳道樣品的純度。2、如果應(yīng)該出現(xiàn)單一蛋白質(zhì)條帶的情況下出現(xiàn)了雙帶，有可能是哪些原因造成的？3、某一樣品出現(xiàn)兩條帶，是否一定代表該樣品不純？為什么？實驗八 抗體診斷玻片直接凝集法檢測血型一、目的要求學(xué)習(xí)并掌握抗原抗體凝集反應(yīng)的原理和方法，了解凝集現(xiàn)象；知道人類abo血型系統(tǒng)的分類。二、基本原理血液制劑是在輸血療法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。輸血的真正開始應(yīng)該是從維也納大學(xué)病理解剖學(xué)會的青年助理karllandsteiner (18681943)發(fā)現(xiàn)血型開始的，1900年他首次發(fā)表其研究結(jié)果。后來經(jīng)過其他科學(xué)家進(jìn)行完善，國際聯(lián)盟衛(wèi)員會制訂并公布了統(tǒng)一的國際命名法，即abo血型系統(tǒng)命名法。abo血

25、型系統(tǒng) 在人類的abo血型系統(tǒng)中，紅細(xì)胞膜上存在有不同的抗原物質(zhì)，即凝集原a和凝集原b；與此相對應(yīng)，血清中則含有特異性抗體，即（或稱抗a）凝集素（或稱抗b）凝集素。根據(jù)紅細(xì)胞上所含有凝集原種類的不同，可把人類abo血型系統(tǒng)分為四種不同的血型：凡含有凝集原a而血漿中不含有凝集素的血液為a型；凡含有凝集原b而血漿中不含有凝集素的血液為b型；凡無凝集素，而僅含有凝集原a、b的血液為ab型；凡無原a、b凝集原，而僅含有凝集素的血液為o型。當(dāng)一個人的紅細(xì)胞同另一個人的血清混合時，有時可看到紅細(xì)胞彼此凝集在一起，這種現(xiàn)象稱為紅細(xì)胞凝集反應(yīng)。這種現(xiàn)象正是紅細(xì)胞表面抗原與血清中相應(yīng)的抗體相遇時發(fā)生的凝集反應(yīng)。

26、三、器材一次性采血針，酒精棉球，鑷子，玻棒，雙凹玻片，記號筆標(biāo)準(zhǔn)血清a、b各一盒四、操作步驟1、取雙凹玻片一片，左上角寫“a”，右上角寫“b”，分別加入一滴標(biāo)準(zhǔn)血清a、b；2、采指端血；3、用玻棒兩端分別取血少許，分別放入a、b標(biāo)準(zhǔn)血清，混勻；4、靜置5min；5、觀察。五、實驗報告1、繪制人abo血型系統(tǒng)抗原抗體凝集反應(yīng)圖表。（+）陽性反應(yīng) （-）陰性反應(yīng)人紅細(xì)胞與血清的反應(yīng)人血清與紅細(xì)胞的反應(yīng)解釋抗a抗ba細(xì)胞b細(xì)胞o細(xì)胞abo血型2、根據(jù)凝集結(jié)果確定自己的血型。實驗九 單克隆抗體的制備一、目的要求了解單克隆抗體的特性和功能，掌握單克隆抗體的產(chǎn)生機(jī)制和制備過程。二、基本原理當(dāng)動物細(xì)胞受到抗

27、原的刺激作用之后，便會在動物體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，并形成相應(yīng)的抗體。這種抗原-抗體之間的應(yīng)答反應(yīng)是一種相當(dāng)復(fù)雜的過程。由于一種抗原往往具有多種不同的抗原決定簇，而每一種抗原決定簇又可以被許多種不同的抗體所識別，因此事實上每一種抗原都擁有大量的特異性的識別抗體。單克隆抗體是指由單一的b淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的，針對一個抗原決定簇的抗體。單克隆抗體的制備方法主要兩種：動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。三、試劑及器材1balbc小鼠(成年小鼠或經(jīng)產(chǎn)母鼠)。2降植烷(pristane，2，6，10，14四甲基五癸烷)或液體石蠟。3雜交瘤細(xì)胞：經(jīng)dmem0培養(yǎng)液離心洗滌1次后，用同樣培養(yǎng)液或生理鹽水將雜交瘤細(xì)胞濃度調(diào)為

28、106個ml。離心管(10ml)、吸管、注射器(2ml)、注射針頭(7號)、細(xì)胞計數(shù)板。甩干式轉(zhuǎn)頭離心機(jī)、顯微鏡、計數(shù)器四、操作方法在接種雜交瘤細(xì)胞前，先給小鼠(balbc小鼠)腹腔注射0.5ml降植烷(pristane)或液體石蠟。然后每只小鼠腹腔注射5105106個雜交瘤細(xì)胞。接種雜交瘤細(xì)胞約710日后，小鼠腹部明顯漲大，此時可用左手固定小鼠，用75乙醇消毒其腹部，再于小鼠下方放置一支試管，將滅菌的注射針頭(7號)刺入小鼠下腹部，讓腹水滴入管內(nèi)。 圖9-1單克隆抗體的制備過程示意圖當(dāng)腹水停滴時，可輕輕移動針頭或輕揉其腹部，使腹水繼續(xù)滴出。1次可獲58ml腹水，間隔23天，待腹水再積累后，同

29、法再取腹水，一般可取腹水23次。收集完腹水后，即以1500rmin離心10分鐘，吸取上清液，加入0.02疊氮鈉，分裝保存于-20。提取純化抗體（可以采用層析、電泳等方法），并進(jìn)行必要的特異性檢驗（酶聯(lián)免疫法檢測）1動物體內(nèi)誘生單克隆抗體法將雜交瘤細(xì)胞接種于同系小鼠或裸鼠腹腔內(nèi)，便可誘生腹腔腫瘤和產(chǎn)生含單克隆抗體的小鼠腹水，抗體濃度可達(dá)1-10mg/ml，此法尚可有效地保存雜交瘤細(xì)胞和分離被雜菌污染的雜交瘤細(xì)胞。2體外培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體法在實驗室條件下，可采用靜止培養(yǎng)法，以含10胎牛血清的dmem和2106個ml細(xì)胞濃度為最佳培養(yǎng)條件，一般可獲10-50gml的單克隆抗體。也可用裝有攪拌器或氣泡

30、攪拌的發(fā)酵罐進(jìn)行體外大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，生產(chǎn)大量單克隆抗體。五、實驗報告1、 圖示動物體內(nèi)抗體產(chǎn)生的過程。2、 如何制備單克隆抗體？實驗十 植物藥物制備技術(shù)實驗燈盞細(xì)辛（erigeron breviscapus）又稱燈盞花、雙葵花、東菊，為多年生草本菊科植物短葶飛蓬的全草， 主要分布于中國西南地區(qū)， 云南各地苗、彝、瑤、壯等少數(shù)民族均應(yīng)用燈盞花入藥， 是云南著名中草藥。經(jīng)臨床驗證， 燈盞細(xì)辛對腦血管意外后遺癥偏癱、肢體麻木、口眼歪斜、言語不利等具有良好療效?，F(xiàn)代研究證明， 燈盞細(xì)辛能抑制血小板聚集， 促進(jìn)纖溶活性， 降低血液粘稠度， 改善微循環(huán)，增加冠狀動脈血流量， 表現(xiàn)了較強(qiáng)的活血化瘀作用。

31、作為從民間挖掘出來的著名民族藥， 燈盞細(xì)辛的應(yīng)用從20世紀(jì)70年代以來有很大發(fā)展， 研制了燈盞細(xì)辛注射液、燈盞花膠囊、益脈康片、燈盞花素注射液、燈盞花素片等制劑品種供臨床使用。一、 目的要求熟悉植物藥物有效成分提取及其制劑制備的工業(yè)過程，掌握燈盞細(xì)辛的提取、精制方法。二、 實驗原理燈盞細(xì)辛含植物甾醇、糖甙型鞣質(zhì)、揮發(fā)油、黃酮類、氨基酸、維生素等。所含黃酮類的混合結(jié)晶稱為燈盞花素，主要成分為黃酮類化合物，易溶于水、易溶于一定濃度的乙醇，提取物中含糖類、糖甙型鞣質(zhì)（為縮合鞣質(zhì)，不溶于水）成分較多，所以本實驗利用各種成分在水中的溶解度的差異將之分離、去除；另外提取物干燥后吸濕性強(qiáng)，難以形成制劑，本實

32、驗采用共同研磨法，以降低吸濕性。三、 實驗器材燈盞細(xì)辛，120-微晶纖維素（附加劑），可溶性淀粉，羥丙基甲基纖維素（hmcp，崩解劑），65%乙醇uv-721紫外-可見分光光度計，鼓風(fēng)干燥箱，re-52a旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器， 剪刀，1#膠囊殼，研缽，大燒杯，膠囊填充模，一次性塑料手套四、實驗步驟1、稱取藥材全草20g， 剪碎，以65%乙醇100ml浸泡30min，后于90回流1h，將原料瓶過濾，收集濾液于大燒杯中，藥渣加入65%乙醇100ml再回流提取2次，每次1h，過濾合并三次所得濾液。2、將濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至干后，加水150ml溶解，充分?jǐn)嚢韬箪o置3min，過濾，除濾渣（多為鞣質(zhì)類物質(zhì)）。3

33、、將所得濾液加熱濃縮至稠浸膏，取少量暫存，供含量測定用；其余倒入研缽中（研缽底撒少許淀粉），邊傾倒邊加入少許淀粉，放入鼓風(fēng)干燥箱中烤干。4、將干燥浸膏塊按4:1的比例加入120-微晶纖維素，研磨成粉，加羥丙基甲基纖維素充分拌勻，得黃褐色干粉，檢測其流動性。5、填充膠囊，裝量控制在0.3510% g 左右。制備成燈盞細(xì)辛膠囊制劑。l 黃酮類化合物定性及定量檢測。（一）黃酮的定性檢測方法：1、檢查黃酮： 取本品稠浸膏2g，加乙醇約16ml，置60水浴上溫浸1小時，濾過；取濾液進(jìn)行下述試驗： 取濾液1ml于15ml試管中，加入濃鹽酸56滴及少量鎂粉，置水浴上加熱35min，溶液由黃色逐漸變?yōu)榧t棕色，

34、反應(yīng)（+）性，證明有黃酮類化合物存在。2、檢查燈盞花素：樣品制備：同上述項1。同時用燈盞花素乙醇液點樣。吸附劑：硅膠（廣州化學(xué)試劑廠）加1%cmc鋪板，在105活化1h。展開劑：丁酮-乙酸乙酯-甲酸-水（4:5:1:0.5）。展距10cm。顯色劑：1%三氯化鋁/乙醇溶液。噴霧顯深黃色后，105烘3min，在紫外光燈（254nm）下觀察，斑點顯綠色或亮黃色熒光，反應(yīng)（+）性，證明有黃酮類化合物存在。（二）黃酮的含量測定方法：1、對照液制備：精確稱取120減壓干燥至恒重的蘆丁對照品200mg，置100ml容量瓶中，加甲醇70ml，置水浴微熱溶解，放冷后加甲醇定容。精確吸取10ml于100ml容量瓶

35、中，定容即可。對照品濃度為0.2mg/ml。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：（1）分別取對照品0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，置25ml容量瓶中，各加水至6.0ml；（2）加5%亞硝酸鈉溶液1ml，混勻，放置6min；（3）加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，放置6min；（4）加4.3%naoh溶液10 ml，再加水定容混勻，放置15min；（5）分光光度計檢測500nm處吸光度，以濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 圖10-1 標(biāo)準(zhǔn)曲線3、樣品測定（1）取樣品粗粉1g，60干燥6h，精確稱定，置素氏提取器中；（2）加乙醚120 ml，回流至提取液無色，放冷，棄乙醚液；

36、（3）再加甲醇90 ml，回流至提取液無色，移至100 ml容量瓶中，定容；（4）精確量取3 ml，置25 ml容量瓶中，自“加水至6.0 ml”起依照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法，測定吸光度。（5）從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中黃酮含量（質(zhì)量，g），計算，即可得到百分含量（一般8%）l 另外已知黃酮素在354nm處的吸光系數(shù)： e1cm1% = 0.42五、實驗報告思考題1、提取過程中乙醇濃度是決定提取物有效成分濃度的關(guān)鍵因素，可以分別用不同的乙醇濃度進(jìn)行實驗，比較產(chǎn)物收率，確定乙醇最佳提取濃度。2、提取物干燥后吸濕性強(qiáng)，在實驗中采用共同研磨法，對浸膏粉吸濕性有一定影響。3、如何增強(qiáng)浸膏粉的流動性？4、

37、實驗報告說明最后所得物的性狀。l 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出所得樣品中黃酮含量。實驗十一 大蒜細(xì)胞sod的提取與分離一、目的要求了解酶類藥物的特性和功能，掌握超氧化物歧化酶（sod）的分離機(jī)制和提取過程。二、基本原理超氧化物歧化酶（sod）是一種具有抗氧化、抗衰老、抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可催化超氧負(fù)離子（o2-）進(jìn)行歧化反應(yīng)，生成氧和過氧化氫：2o2-h2o2h2o2。大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有較豐富的sod，通過組織或細(xì)胞破碎后，可用ph7.8的磷酸緩沖液提取。由于sod不溶于丙酮，可用丙酮將其沉淀析出。超氧化物歧化酶是一種重要的氧自由基清除劑，作為藥用酶在美國、德國、澳大利亞等國已有

38、產(chǎn)品。由于sod能專一性去除超氧陰離子自由基，故引起國內(nèi)外生化界和醫(yī)藥界的極大關(guān)注。目前臨床上應(yīng)用集中在自身免疫性疾病上如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，紅斑性狼瘡，皮肌炎等。三、試劑及器材 （1）新鮮蒜瓣，市售。 （2）大蒜細(xì)胞，通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)獲得。 （3）磷酸緩沖液：0.05 moll，ph7.8的磷酸緩沖溶液。 （4）氯仿-乙醇混合溶劑：氯仿：無水乙醇=3：5。 （5）丙酮：用前冷卻至410。 碳酸鹽緩沖液：0.05 moll，ph10.2。 edta溶液：0.lmoll。四、操作方法1組織或細(xì)胞破碎稱取5g大蒜蒜瓣或大蒜細(xì)胞，于研磨器中研磨，使組織或細(xì)胞破碎。2sod的提取將上述破碎的組織或細(xì)胞，加入

39、 23倍體積的0.05 moll ph7.8的磷酸緩沖液，繼續(xù)研磨攪拌20 min，使sod充分溶解到緩沖液中，然后用離心機(jī)在5000 rmin下，離心15min，棄沉淀，得提取液。3除雜蛋白提取液加入0.25倍體積的氯仿-乙醇混合溶劑攪拌15 min，5000 rmin離心15 min，去雜蛋白沉淀，得粗酶液。4sod的沉淀分離將上述粗酶液加入等體積的冷丙酮，攪拌15 min，5000 rmin離心15min，得 sod沉淀。將sod沉淀溶于0.05 moll ph7.8的磷酸緩沖液中，于5560熱處理15min，離心棄沉淀，得到sod酶液。將上述提取液、粗酶液和酶液分別取樣，測定各自的so

40、d活力。試劑及儀器1. ph 8.2 0.05 m tris - hcl 緩沖液(a) 儲存液(0.2m tris 溶液) , 24.228g 加純水至100ml 。(b) 應(yīng)用液: 250ml 0.2m加0.1n鹽酸225ml ,再加水至100ml 。2. 1mm鄰苯三酚溶液(a) 儲存液(0.1 m) 1.2611g ar級鄰苯三酚加純水至100ml 。(b) 應(yīng)用液: 1ml 儲存液加10ml hc1 至100ml 。3.儀器紫外分光光度計、酸度計、水浴鍋、離心機(jī)、秒表及常規(guī)分析儀器。檢測方法：1、取4.5ml ph 8.2 tris - hc1 緩沖液加4.1ml 純水, 于25 恒溫

41、水浴放置20分鐘, 加0.1ml 純水及1mm鄰苯三酚0.3ml , 混勻, 紫外分光光度325nm波長處迅速測其自氧化速率,5 分鐘內(nèi)有效,每隔30秒測一次,并記錄吸光度,得出鄰苯三酚自氧化速率a 值。2、4.5ml ph 8.2 tris - hc1 緩沖注液加4.1ml 純水, 于25 恒溫水浴放置20分鐘,加0.1ml sod 酶液及1mm鄰苯三酚0.3ml , 混勻,迅速測其吸光度,每隔30秒測一次, 5 分鐘內(nèi)測完,計算得,加sod 后鄰苯三酚的自氧化速率b 值。3、活力計算酶活力單位定義: 在一定條件下, 每分鐘抑制鄰苯三酚在325nm波長處, 自氧化速率達(dá)50 %所需酶量定義為

42、一個酶活力單位。五、實驗報告思考題1、 提取過程中影響提取物sod有效成分活性的關(guān)鍵因素有哪些？2、 酶類藥物制備過程中應(yīng)該注意什么？如何減輕酶類藥物制備過程中不良因素的影響？3、 討論sod提取過程中遇到的問題及解決方法。4、 計算出大蒜樣品中sod的活力。實驗十二 動物藥物制備實驗卵磷脂制備一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)脂類藥物的制備方法，掌握卵磷脂的提取工藝及制備的原理和工藝。二、實驗原理脂類是脂肪、類脂及其衍生物的總稱。其共同物理性質(zhì)是不溶或微溶于水，易溶于某些有機(jī)溶劑，在體內(nèi)以游離或結(jié)合的形式存在于組織細(xì)胞中，其中具有特定生理藥理效應(yīng)者稱為脂類藥物。脂類藥物分為復(fù)合脂類藥物及簡單脂類藥物兩大類，復(fù)

43、合脂類藥物包括與脂肪酸相結(jié)合的脂類藥物，如卵磷脂及腦磷脂等，簡單脂類藥物為不含脂肪酸的脂類，如甾體化合物，色素類及coq10等。脂類生化藥物種類較多，結(jié)構(gòu)多樣化，性質(zhì)差異很大，制備的方法有如下幾種：（一）直接抽提法（二）水解法（三）化學(xué)合成或半合成法（四）生物轉(zhuǎn)化法，通常用溶解度法及吸附分離法分離。經(jīng)分離后的脂類藥物中常有微量雜質(zhì)，需要適當(dāng)方法精制，常用的方法有結(jié)晶法，重結(jié)晶法和有機(jī)溶劑沉淀法。如用層析分離的pge2經(jīng)醋酸已烷結(jié)晶。磷脂類藥物在臨床上應(yīng)用的主要有卵磷脂及腦磷脂，二者都有增強(qiáng)神經(jīng)組織及調(diào)節(jié)高級神經(jīng)活動作用，又是血漿脂肪良好的乳化劑，有促進(jìn)膽固醇及脂肪運(yùn)輸作用，臨床上用于治療神經(jīng)衰

44、弱及防止動脈粥樣硬化。磷脂類藥物中除神經(jīng)磷脂等少數(shù)成分外，其結(jié)構(gòu)中大多含甘油基團(tuán)，如磷脂酸，磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等。1. 卵磷脂的結(jié)構(gòu)2. 卵磷脂性質(zhì)卵磷脂存在于動物各組織及器官中，腦，精液、腎上腺及紅血球含量最多，卵黃中含量高達(dá)810，故得名。其在植物中含量很少，唯大豆中含量甚高。為白色蠟狀物質(zhì)，無熔點，有旋光性，在空氣中因不飽和脂肪酸烴鏈氧化而變色。極易溶于乙醚及乙醇，不溶于水，為兩性電解質(zhì)。應(yīng)用：臨床上用于治療嬰兒濕疹、神經(jīng)衰弱、肝炎、肝硬化及動脈粥樣硬化。三、實驗器材動物腦干 丙酮 乙醚 乙醇 玻棒回流裝置 漏斗 量筒 濾紙 真空干燥箱四、卵磷脂制備（1）工藝路線如圖12-1所示。

45、（2）工藝過程1)提取與濃縮 取動物腦干加3倍體積丙酮循環(huán)浸提2024h，過濾得濾液分離膽固醇。濾餅蒸去丙酮，加23倍體積乙醇浸提45次，每次過濾的濾餅用于制備腦磷脂。合并濾液，真空濃縮，趁熱放出濃縮液。2）沉淀與干燥上述濃縮液冷卻至室溫，加入半倍體積乙醚，不斷攪拌，放置2h，令白色不溶物完全沉淀，過濾，取濾液于激烈攪拌下加入粗卵磷脂重量1.5倍體積的丙酮，析出沉淀，濾除溶劑，得膏狀物，以丙酮洗滌兩次，真空干燥后得卵磷脂成品。腦干丙酮提取濾液（制取膽固醇原料）濾餅乙醇提取濾餅（制取腦磷脂原料）濾液濃縮濃縮物乙醚溶解濾液丙酮沉淀真空干燥卵磷脂圖12-1 卵磷脂的制備工藝路線五、實驗報告思考題1、

46、試討論脂類藥物提取過程中的主要影響因素有哪些？應(yīng)如何減輕其影響？2、討論卵磷脂提取過程中遇到的問題，試提出相應(yīng)的解決方法。設(shè)計實驗十三、分泌抗生素的微生物菌種的選育 一、實驗?zāi)康模禾岣咄瑢W(xué)們對于工業(yè)微生物的理論理解及實際動手能力，并且鍛煉同學(xué)們文獻(xiàn)查閱、實驗設(shè)計及解決實際問題的綜合能力。實驗體系：從自然界中（土壤或海水中）篩選可以抗大腸桿菌、抗真菌或殺蟲的菌株（或提供一株生產(chǎn)菌株，如阿維鏈霉菌），同學(xué)們自己查閱文獻(xiàn)，設(shè)計實驗進(jìn)行誘變，發(fā)酵條件優(yōu)化，提取。二、需要同學(xué)解決的關(guān)鍵問題：1、 篩選標(biāo)記的選擇，如產(chǎn)抗大腸桿菌、抗金黃色葡萄球菌、抗真菌或殺蟲抗生素的篩選方法；對于特定抗生素來說，確定其高產(chǎn)菌株的遺傳標(biāo)記。2、 高效誘變方法的選擇。3、 發(fā)酵條件優(yōu)化的方法。如營養(yǎng)成份對于產(chǎn)物的影響及理論分析，應(yīng)用一些新型的統(tǒng)計學(xué)方法。4、 抗生素提取、純化工藝的選擇和優(yōu)化。舉例說明：從海水中篩選產(chǎn)抗真菌抗生素的微生物三、實驗具體步驟：1、 查找文獻(xiàn)確定從海水中分離新的產(chǎn)抗生素的菌株的優(yōu)勢：即海洋是一個特殊的環(huán)境，在海洋中生長的微生物必然具有特異的生理生化功能，而從陸地上篩選新