CB114400G海水養(yǎng)殖動(dòng)物主要病毒性疫病爆發(fā)機(jī)理與免疫防治的基礎(chǔ)研究【973計(jì)劃擬立項(xiàng)項(xiàng)目】

1、項(xiàng)目名稱：海水養(yǎng)殖動(dòng)物主要病毒性疫病爆發(fā)機(jī)理與免疫防治的基礎(chǔ)研究首席科學(xué)家：宋林生 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所起止年限：2012.1-2016.8依托部門：山東省科技廳 中國(guó)科學(xué)院一、關(guān)鍵科學(xué)問題及研究?jī)?nèi)容選擇海水養(yǎng)殖業(yè)中經(jīng)濟(jì)和學(xué)術(shù)價(jià)值并重的對(duì)蝦和魚類，針對(duì)研究最為深入、致病性最高、危害最為嚴(yán)重的對(duì)蝦白斑綜合征和魚類虹彩病毒病，開展以下研究：1. 疫病爆發(fā)流行的分子病原學(xué)基礎(chǔ)l 病毒感染與疫病爆發(fā)的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)：確定病毒侵染、傳播的靶標(biāo)器官和致病的分子機(jī)制。研究病毒內(nèi)吞與胞內(nèi)移動(dòng)的分子過程，確定病毒感染的受體及作用網(wǎng)絡(luò)。開展與病毒感染及致病等相關(guān)功能基因研究，以期了解病毒感染與疫病爆發(fā)的分子基礎(chǔ)。

2、l 病毒對(duì)宿主細(xì)胞機(jī)能的操控機(jī)制：研究病毒、病毒編碼的基因及非編碼的病毒mirna對(duì)宿主基因、細(xì)胞信號(hào)通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用，揭示病毒對(duì)宿主細(xì)胞機(jī)能的操控機(jī)制和作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步闡明病毒致病的分子機(jī)理。l 病毒遺傳變異特征與分子流行病學(xué)：在野生和養(yǎng)殖對(duì)蝦、魚類及水體中查明病毒傳播的分子途徑。研究病毒不同種株之間的遺傳變異和演化特征，闡明其遺傳變異與感染宿主范圍及疾病流行的關(guān)系。2. 宿主應(yīng)對(duì)病原侵染的應(yīng)答規(guī)律與疫病爆發(fā)機(jī)理l 研究宿主應(yīng)對(duì)病毒感染的天然免疫反應(yīng)的關(guān)鍵途徑，包括對(duì)病原的異己識(shí)別的分子基礎(chǔ)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和效應(yīng)分子作用機(jī)制。l 探索魚類適應(yīng)性免疫的激活、維持與調(diào)控機(jī)制，比較低等脊椎動(dòng)

3、物抗感染免疫反應(yīng)與哺乳動(dòng)物的異同。l 分析病原侵染與環(huán)境變化對(duì)免疫細(xì)胞功能、免疫相關(guān)基因表達(dá)與神經(jīng)內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的影響，揭示疫病發(fā)生與爆發(fā)機(jī)理。3. 疫病防治的免疫學(xué)原理和關(guān)鍵技術(shù)途徑l 利用病原與宿主相互作用的粘附蛋白和受體，研制對(duì)蝦wssv感染阻斷劑；闡明對(duì)蝦免疫因子和免疫增強(qiáng)劑作用機(jī)制，研發(fā)有效的免疫活性物質(zhì)及其導(dǎo)入途徑。l 針對(duì)危害嚴(yán)重的魚類虹彩病毒篩選、設(shè)計(jì)高效免疫原，構(gòu)建高保護(hù)性疫苗，探索疫苗的效應(yīng)機(jī)制；開展疫苗包埋劑和免疫佐劑研究，研發(fā)有效的疫苗導(dǎo)入途徑；創(chuàng)建高效疫苗保護(hù)效果的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)體系。l 研究對(duì)蝦和魚類免疫穩(wěn)態(tài)的環(huán)境與生態(tài)操控原理，研發(fā)防控對(duì)蝦白斑綜合癥和魚類虹彩病爆發(fā)

4、的環(huán)境調(diào)控技術(shù)途徑。二、預(yù)期目標(biāo)（一）總體目標(biāo)1. 在海水養(yǎng)殖對(duì)蝦和魚類病毒性疫病爆發(fā)和免疫防治理論方面取得突破，豐富和拓展海洋動(dòng)物病毒功能基因組學(xué)、分子流行病學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)、分子免疫學(xué)，開創(chuàng)我國(guó)魚類系統(tǒng)疫苗學(xué)，引領(lǐng)我國(guó)海水養(yǎng)殖動(dòng)物疫病發(fā)生和免疫防治學(xué)科的發(fā)展。2. 明確對(duì)蝦和魚類天然免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)病毒感染的免疫反應(yīng)關(guān)鍵途徑，揭示魚類適應(yīng)性免疫的激活、維持與調(diào)控機(jī)制，分析病原侵染與環(huán)境變化對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，探索疫病發(fā)生與爆發(fā)的分子機(jī)理。3. 開辟海水養(yǎng)殖動(dòng)物疫病的免疫學(xué)防治新途徑，全面提升疫病發(fā)生與控制方面的研究水平，取得一批具有國(guó)際重要影響的原創(chuàng)性成果，提升我國(guó)在國(guó)際海洋動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制領(lǐng)

5、域的前沿地位。4. 針對(duì)由虹彩病毒和wssv病毒引起的疫病，建立和發(fā)展有效的免疫防治技術(shù)和途徑，有效遏制疫病的爆發(fā)，促進(jìn)海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。5. 組建一支在海洋水產(chǎn)疫病發(fā)生和免疫防治研究中具有創(chuàng)新能力的團(tuán)隊(duì)，造就一批在國(guó)內(nèi)外有影響力的領(lǐng)軍人物和中青年學(xué)科帶頭人。（二）五年預(yù)期目標(biāo)1. 揭示wssv和虹彩病毒感染致病與疫病爆發(fā)的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)：明確wssv和虹彩病毒侵染的靶組織、侵染途徑和增殖方式；闡明4個(gè)以上wssv和虹彩病毒早期調(diào)控因子及毒力因子，確定6-8個(gè)wssv和虹彩病毒參與侵染和致病的關(guān)鍵基因以及4-6個(gè)與其相互作用的受體蛋白，揭示其對(duì)宿主細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制及其與疾病發(fā)生的關(guān)系；

6、構(gòu)建1-2種具有感染性的熒光標(biāo)記重組虹彩病毒；揭示宿主受病毒基因和mirna調(diào)控的信號(hào)分子6-8個(gè)，信號(hào)傳導(dǎo)通路3-4條，初步闡明wssv和虹彩病毒對(duì)宿主細(xì)胞機(jī)能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和操控機(jī)制，闡明不同致病株的遺傳與演化特征。2. 詮釋對(duì)蝦和魚類應(yīng)對(duì)病毒感染的免疫反應(yīng)關(guān)鍵途徑與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：鑒定對(duì)蝦抗病毒的關(guān)鍵基因/蛋白8個(gè)以上；獲得具有抗病毒活性的次生代謝產(chǎn)物2個(gè)以上，抗病毒保護(hù)率達(dá)到50%以上；闡明對(duì)蝦抗病毒的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，建立以對(duì)蝦為代表的甲殼類動(dòng)物天然免疫系統(tǒng)的基本框架結(jié)構(gòu)；闡釋魚類應(yīng)對(duì)病原感染的免疫反應(yīng)關(guān)鍵途徑、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答規(guī)律，揭示疫病爆發(fā)機(jī)制。3. 拓展病毒性疫病防治的免疫學(xué)途

7、徑和關(guān)鍵技術(shù)：獲得3-4種可有效阻斷wssv入侵的特異性抗體或2-3株活性單鏈抗體；構(gòu)建具有穩(wěn)定阻斷效果的rnai載體；明確不同類型免疫增強(qiáng)劑的免疫增強(qiáng)機(jī)理，篩選到4-6種高效、健康的免疫增強(qiáng)劑和2-3種可增強(qiáng)對(duì)蝦抗病力的養(yǎng)殖環(huán)境友好型外源生物；鑒定wssv感染相關(guān)對(duì)蝦主要免疫因子，實(shí)現(xiàn)3-5種抗病免疫因子基因在酵母或細(xì)菌中的高效表達(dá)；優(yōu)化對(duì)蝦抗病生物活性物質(zhì)導(dǎo)入途徑；建立魚類病毒疫苗的設(shè)計(jì)策略和疫苗的高效表達(dá)與導(dǎo)入技術(shù)；構(gòu)建5個(gè)高效候選疫苗，其相對(duì)保護(hù)率不低于70；發(fā)現(xiàn)3個(gè)高效免疫佐劑，確定其能提高免疫保護(hù)效率達(dá)15以上；建立一種疫苗效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)體系。4. 取得一批具國(guó)際影響的原創(chuàng)性成果

8、：在sci收錄的與水產(chǎn)病害和免疫相關(guān)的top期刊上發(fā)表論文150篇以上，申請(qǐng)國(guó)家或國(guó)際發(fā)明專利30項(xiàng)以上。5. 培養(yǎng)一批中青年學(xué)術(shù)人才：培養(yǎng)碩士，博士和博士后150名以上；建立以中青年為主體，在海水養(yǎng)殖魚蝦類免疫防治研究中具高度自主創(chuàng)新能力的團(tuán)隊(duì)，造就在國(guó)內(nèi)外頗有影響力的中青年學(xué)科帶頭人。三、研究方案（一）學(xué)術(shù)思路本項(xiàng)目面對(duì)我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)病害肆虐，形勢(shì)嚴(yán)峻的現(xiàn)狀，凝練出海水養(yǎng)殖動(dòng)物主要病毒性疫病爆發(fā)機(jī)理及其免疫防治的科學(xué)問題，聚焦目標(biāo)、突出重點(diǎn)，采用現(xiàn)代生命科學(xué)前沿技術(shù)、深入探索主要疫病爆發(fā)機(jī)理和免疫防治的科學(xué)基礎(chǔ)。一方面，從病原角度研究侵染、致病機(jī)理及疫病爆發(fā)流行機(jī)制。另一方面，從宿主角度探

9、討抗感染免疫的分子和細(xì)胞基礎(chǔ)，最終落足于為疫病防治提供免疫學(xué)基礎(chǔ)與技術(shù)途徑的目標(biāo)上。與“十五”和“十一五”973計(jì)劃支持的相關(guān)項(xiàng)目相比，本項(xiàng)目聚焦于危害重大的病毒性疫病，在繼續(xù)強(qiáng)調(diào)病原與宿主相互作用關(guān)系的同時(shí)，重點(diǎn)關(guān)注疫病的爆發(fā)機(jī)理和疫病防治的免疫學(xué)方法和途徑，把理論和實(shí)際、基礎(chǔ)研究和國(guó)家需求緊密結(jié)合，目標(biāo)更加明確。依據(jù)我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，充分考慮到脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物在免疫防御機(jī)制上的顯著差異，選取經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科學(xué)價(jià)值并重的對(duì)蝦和魚類為研究重點(diǎn)，鎖定造成廣泛危害且研究最為深入的對(duì)蝦白斑綜合征病毒和魚類虹彩病毒，集中研究病原感染和宿主免疫應(yīng)答以及疫病爆發(fā)與流行機(jī)制。在疫病控制策略上強(qiáng)調(diào)免疫學(xué)

10、防治方法與途徑，重點(diǎn)研究阻斷、激活和增強(qiáng)機(jī)體免疫防御能力的機(jī)理和有效途徑，開發(fā)研制高效疫苗和抗病物質(zhì)，并針對(duì)魚、蝦與陸生動(dòng)物顯著不同的生物學(xué)特點(diǎn)和水體環(huán)境，探索疫苗和免疫活性物質(zhì)導(dǎo)入魚、蝦的機(jī)理及途徑，為系統(tǒng)研制高效免疫制劑和疫苗提供理論和技術(shù)支撐。本項(xiàng)目將從病毒性疫病爆發(fā)和流行的分子病原學(xué)基礎(chǔ)、宿主應(yīng)對(duì)病原侵染的應(yīng)答規(guī)律與疫病爆發(fā)機(jī)理、以及疫病防治的免疫學(xué)原理和有效技術(shù)途徑三個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問題入手，開展海水養(yǎng)殖動(dòng)物主要疫病爆發(fā)機(jī)制和免疫防治的基礎(chǔ)研究。研究?jī)?nèi)容既各有側(cè)重，又相互關(guān)聯(lián)，彼此支撐，形成一個(gè)有機(jī)整體。疫病爆發(fā)和流行機(jī)制的研究不僅揭示了疫病發(fā)生的分子機(jī)理，同時(shí)也為免疫防治基礎(chǔ)研究提供了精

11、準(zhǔn)的分子靶標(biāo)；宿主抗感染免疫機(jī)理闡釋了病害發(fā)生過程中宿主的免疫反應(yīng)機(jī)制，為疫病免疫防治研究提供關(guān)鍵思路。（二）技術(shù)途徑1. 技術(shù)路線本項(xiàng)目將充分利用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、生物信息學(xué)、分子免疫學(xué)等多學(xué)科的先進(jìn)研究方法和技術(shù)，借鑒人類醫(yī)學(xué)和畜禽疫病防治的新概念、新觀點(diǎn)和新思路，從病原、宿主以及病原和宿主間的相互作用入手，開展多學(xué)科交叉研究，從分子水平探討海水養(yǎng)殖動(dòng)物疫病爆發(fā)的機(jī)制，發(fā)展疫病控制的免疫學(xué)技術(shù)，全面提升我國(guó)該領(lǐng)域基礎(chǔ)研究水平，實(shí)現(xiàn)質(zhì)的飛躍。技術(shù)路線如圖1所示。圖1 項(xiàng)目擬采取的技術(shù)路線2. 主要研究方法（1）疫病爆發(fā)流行的分子病原學(xué)基礎(chǔ)利用免疫熒光技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、pcr技術(shù)

12、、從個(gè)體、組織、細(xì)胞和分子水平研究病毒侵染宿主的途徑和靶標(biāo)，檢測(cè)病毒感染引起宿主機(jī)體損傷和死亡機(jī)制；利用co-ip技術(shù)、酵母雙雜交技術(shù)、pull-down技術(shù)、蛋白組學(xué)等技術(shù)，分析病毒早期調(diào)控因子與宿主分子間的相互作用、病毒蛋白和mirna對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制和作用網(wǎng)絡(luò)；利用基因組學(xué)、生物信息學(xué)技術(shù)和分子流行病學(xué)手段，結(jié)合病毒感染實(shí)驗(yàn)和免疫組化、電鏡技術(shù)等調(diào)查分析疫病爆發(fā)的傳染源，病毒遺傳變異特征及致病力、宿主范圍的差異，闡明疫病爆發(fā)的機(jī)制。（2）宿主應(yīng)對(duì)病原侵染的應(yīng)答規(guī)律與疫病爆發(fā)機(jī)理綜合運(yùn)用基因克隆、表達(dá)等分子生物學(xué)技術(shù)、生物信息學(xué)、dna芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫共沉淀、pull-dow

13、n技術(shù)、rna干擾、免疫組織化學(xué)、比較免疫學(xué)、分子生態(tài)學(xué)等方法研究宿主免疫體系及其對(duì)病毒性病原侵染和環(huán)境變化的應(yīng)答機(jī)理、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵途徑及其與疫病爆發(fā)的關(guān)系等。（3）疫病防治的免疫學(xué)原理和關(guān)鍵技術(shù)途徑在對(duì)蝦白斑綜合征防控方面，利用受體封閉、抗體中和、rnai等技術(shù)阻斷病毒感染和復(fù)制的途徑；借助免疫學(xué)和現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)研究免疫活性物質(zhì)的免疫增強(qiáng)機(jī)理；采用不同材料和包被攜帶方法對(duì)免疫活性物質(zhì)進(jìn)行加工處理，建立飼料添加、生物攜帶等新的導(dǎo)入途徑。在魚類疫苗研究方面，利用蛋白質(zhì)組學(xué)與生物信息學(xué)方法篩選免疫原，利用分子生物學(xué)和基因工程方法構(gòu)建疫苗表達(dá)載體，利用免疫組化等方法檢測(cè)疫苗的組織分布，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、

14、蛋白質(zhì)組學(xué)等方法檢測(cè)免疫基因表達(dá)。采用系統(tǒng)生物學(xué)的研究思路和技術(shù)方法，建立疫苗保護(hù)效應(yīng)的評(píng)價(jià)體系。（三）創(chuàng)新點(diǎn)與特色1. 學(xué)科理念創(chuàng)新提出海洋動(dòng)物病毒功能基因組學(xué)和蛋白組學(xué)、分子流行病學(xué)、系統(tǒng)疫苗學(xué)等新的學(xué)科理念。在這些新的理念指導(dǎo)下，從病原與宿主的相互作用入手，系統(tǒng)詮釋疫病爆發(fā)的機(jī)理，發(fā)展基于免疫學(xué)基礎(chǔ)的疫病控制策略，將海水養(yǎng)殖動(dòng)物疫病爆發(fā)和防治的基礎(chǔ)研究提升到新高度。 2. 研究手段創(chuàng)新本項(xiàng)目將組學(xué)手段引入到病原的結(jié)構(gòu)、感染和致病的過程，宿主免疫系統(tǒng)的組成和免疫應(yīng)答過程，疫病爆發(fā)和流行等不同研究環(huán)節(jié)，全面系統(tǒng)了解病原致病機(jī)制、宿主免疫應(yīng)答的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和疫病爆發(fā)規(guī)律，在基因結(jié)構(gòu)、基因的轉(zhuǎn)錄翻譯

15、和表達(dá)調(diào)控等層面將系統(tǒng)生物學(xué)的最新方法有機(jī)地應(yīng)用于本項(xiàng)目研究，使本項(xiàng)目總體研究水平向國(guó)際醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)前沿趨勢(shì)邁進(jìn)。3. 研究思路創(chuàng)新本項(xiàng)目重點(diǎn)抓住具有普遍意義的天然免疫防御系統(tǒng)并將其中的關(guān)鍵因子及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)進(jìn)行比較分析，研究對(duì)象則針對(duì)具有我國(guó)特色的重要海水養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)蝦和魚類，跨越了從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物的兩大門類，研究探索免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能及關(guān)鍵免疫分子和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的起源與進(jìn)化，有望在分子比較免疫學(xué)領(lǐng)域取得重要?jiǎng)?chuàng)新。4. 研究成果創(chuàng)新預(yù)期完成幾個(gè)國(guó)內(nèi)新近發(fā)現(xiàn)的病毒及其變異株基因組全序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)一系列新的致病基因和致病機(jī)制，建立完善虹彩病毒新分類體系；從對(duì)蝦和魚類中發(fā)現(xiàn)新的免疫抗病

16、基因及免疫應(yīng)答調(diào)控新途徑，這些成就將大幅提升我國(guó)在國(guó)際同類研究中的地位。5. 特色的組織管理方式在“十五”和“十一五”973項(xiàng)目的基礎(chǔ)上，由山東省科技廳和中國(guó)科學(xué)院具體組織中國(guó)科學(xué)院、教育部、農(nóng)業(yè)部和國(guó)家海洋局等下屬的全國(guó)海洋科學(xué)研究單位，進(jìn)一步吸收國(guó)內(nèi)優(yōu)勢(shì)單位的創(chuàng)新人才，組成一支研究隊(duì)伍，為項(xiàng)目整體協(xié)調(diào)和研究工作的全面推進(jìn)創(chuàng)造了條件。 （四）可行性分析1. 扎實(shí)的工作基礎(chǔ)本項(xiàng)目繼續(xù)瞄準(zhǔn)我國(guó)海水養(yǎng)殖動(dòng)物病害防治的重大需求，在“十五”973計(jì)劃“重要海水養(yǎng)殖生物病害發(fā)生和抗病力的研究”和“十一五”973計(jì)劃“重要海水養(yǎng)殖動(dòng)物病害發(fā)生和免疫防治的基礎(chǔ)研究”的基礎(chǔ)上，聚焦目標(biāo)，進(jìn)一步深入研究。研究工

17、作基礎(chǔ)好、起點(diǎn)高。2. 雄厚的技術(shù)力量主要優(yōu)勢(shì)單位擁有此研究領(lǐng)域較強(qiáng)的技術(shù)平臺(tái)，包括“有害生物控制與資源利用”和“微生物技術(shù)”國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及9個(gè)省部級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，如中科院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)和海洋生物資源可持續(xù)利用兩個(gè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家教育部遺傳學(xué)與育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和水產(chǎn)養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、教育部動(dòng)物疫病病原學(xué)與免疫控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、教育部瀕危動(dòng)植物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、教育部細(xì)胞生物學(xué)與腫瘤細(xì)胞工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖病害與生態(tài)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室、農(nóng)業(yè)部動(dòng)物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，以及國(guó)際對(duì)蝦白斑綜合征和傳染性皮下及造血組織壞死oie參考實(shí)驗(yàn)室。各研究平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)

18、并共享公用，所具備的儀器設(shè)備和研究手段基本滿足本項(xiàng)目的要求。3. 創(chuàng)新的研究隊(duì)伍通過“十五”和“十一五”973計(jì)劃項(xiàng)目的實(shí)施，已經(jīng)培養(yǎng)起一支在海水養(yǎng)殖動(dòng)物病害發(fā)生和防治領(lǐng)域得到國(guó)內(nèi)外認(rèn)可、有一定創(chuàng)新能力的研究隊(duì)伍。在此基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目根據(jù)研究?jī)?nèi)容的需要，更廣泛地吸收國(guó)內(nèi)相關(guān)單位的優(yōu)勢(shì)力量，組建成一支創(chuàng)新力強(qiáng)的研究團(tuán)隊(duì)。這支研究隊(duì)伍繼承和發(fā)揚(yáng)團(tuán)結(jié)協(xié)作、聯(lián)合攻關(guān)的優(yōu)良傳統(tǒng)，加上項(xiàng)目的組織部門有成熟先進(jìn)的管理經(jīng)驗(yàn)，能夠確保項(xiàng)目目標(biāo)的圓滿完成。4. 廣泛的國(guó)際合作本項(xiàng)目的主要學(xué)術(shù)骨干與美國(guó)、加拿大、法國(guó)、新加坡、德國(guó)、荷蘭、挪威，日本等同行專家建立了很好的合作關(guān)系，簽訂了多項(xiàng)合作協(xié)議，廣泛開展了合作研究

19、。通過國(guó)際合作和學(xué)術(shù)交流，及時(shí)掌握國(guó)際發(fā)展動(dòng)態(tài)，借鑒和吸收國(guó)際同行成功的經(jīng)驗(yàn)和研究成果，加強(qiáng)提高創(chuàng)新能力，保證本項(xiàng)目的研究工作在國(guó)際相同領(lǐng)域的前沿性，對(duì)提高成果水平將起到良好的促進(jìn)作用。5. 成功的項(xiàng)目管理項(xiàng)目的承擔(dān)單位和參加單位項(xiàng)目管理部門具有成熟的管理經(jīng)驗(yàn)，對(duì)課題實(shí)施提供保障和支持，能夠確保本項(xiàng)目的順利實(shí)施和圓滿完成。（五）課題設(shè)置課題一 對(duì)蝦白斑綜合征爆發(fā)的分子機(jī)制研究?jī)?nèi)容：1. wssv感染早期病原與宿主的相互作用分析確定wssv最先侵入蝦體靶組織的分子證據(jù)，追蹤病毒組分與細(xì)胞膜結(jié)合到進(jìn)入細(xì)胞核的分子過程，從組織、細(xì)胞和分子水平揭示wssv入侵機(jī)制；研究病毒早期調(diào)控因子與宿主細(xì)胞分子相

20、互作用網(wǎng)絡(luò)，闡明病毒調(diào)理并利用宿主生理機(jī)能進(jìn)行自我復(fù)制的機(jī)理，揭示wssv引發(fā)宿主病變的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)。2. wssv由潛伏感染轉(zhuǎn)為急性感染的誘因與機(jī)理研究養(yǎng)殖條件下wssv潛伏性感染維持機(jī)制，分析wssv潛伏感染轉(zhuǎn)化為急性感染過程的關(guān)鍵誘因，闡明關(guān)鍵誘因?qū)Σ《靖腥菊{(diào)控的分子過程；研究并揭示養(yǎng)殖環(huán)境誘導(dǎo)對(duì)蝦白斑綜合征疫病爆發(fā)的分子機(jī)制。3. wssv基因組變異與疫病爆發(fā)流行趨勢(shì)針對(duì)不同毒力的wssv毒株，分析wssv基因組變異的規(guī)律及其與毒力之間的關(guān)系，篩選鑒定可變異的毒力基因并分析其對(duì)致病性的貢獻(xiàn)；研究致病力差異對(duì)病原感染和傳播能力的影響，揭示wssv變異在疫病爆發(fā)流行中的作用。研究目標(biāo)：1

21、. 明確wssv最初侵染靶組織以及在組織間傳播的分子過程，揭示wssv進(jìn)入易感細(xì)胞的方式和機(jī)制。2. 闡明2個(gè)以上病毒早期調(diào)控因子對(duì)宿主細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制及其與疾病發(fā)生的關(guān)系。3. 闡明wssv潛伏性感染的機(jī)理，解析環(huán)境因子在wssv潛伏感染轉(zhuǎn)化為急性感染過程中的作用。4. 明確不同致病力的wssv毒株之間的基因組差異及其變化規(guī)律，鑒定2個(gè)以上wssv毒力因子，闡明毒力因子與疫病爆發(fā)和流行的關(guān)系。5. 發(fā)表sci收錄期刊論文20篇以上，其中影響因子大于5的3篇；申請(qǐng)發(fā)明專利4項(xiàng)；培養(yǎng)碩士20名，博士5名。課題負(fù)責(zé)人： 楊 豐承擔(dān)單位： 國(guó)家海洋局第三海洋研究所、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所、中

22、國(guó)海洋大學(xué)、中山大學(xué)經(jīng)費(fèi)比例： 15.5% 課題二 魚類虹彩病毒病爆發(fā)的細(xì)胞基礎(chǔ)與分子機(jī)制 研究?jī)?nèi)容： 1. 虹彩病毒感染與疫病爆發(fā)的細(xì)胞和分子基礎(chǔ) 在組織水平研究病毒侵染和傳播途徑，分析病毒作用的靶組織和細(xì)胞；在細(xì)胞水平研究病毒對(duì)宿主細(xì)胞的識(shí)別、細(xì)胞內(nèi)吞與胞內(nèi)遷移過程，闡明魚類虹彩病毒感染與疫病爆發(fā)的分子基礎(chǔ)。 2. 虹彩病毒對(duì)宿主細(xì)胞機(jī)能的操控機(jī)制 研究病毒、病毒編碼的基因?qū)λ拗骰?、?xì)胞信號(hào)通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的操控作用；分析病毒非編碼的mirna對(duì)病毒和宿主細(xì)胞的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制，揭示病毒對(duì)宿主細(xì)胞機(jī)能的操控機(jī)制。 3. 虹彩病毒遺傳變異特征與疫病爆發(fā)流行機(jī)制 研究不同地域和不同水體環(huán)境條

23、件下魚類虹彩病毒的感染性和宿主范圍，鑒定不同來源病毒的遺傳特征，分析養(yǎng)殖魚類虹彩病毒病傳染源，研究不同病毒種株的遺傳與演化特征，揭示感染和傳播途徑，闡明虹彩病毒致病株感染致病分子機(jī)理及疫病爆發(fā)流行的規(guī)律。研究目標(biāo)： 1. 構(gòu)建1-2種具有感染性的熒光標(biāo)記重組虹彩病毒，闡明魚類虹彩病毒侵染的靶組織、侵染途徑和增殖方式；確定6-8個(gè)病毒參與侵染和致病的關(guān)鍵基因，以及4-6個(gè)與其相互作用的模式識(shí)別受體；揭示魚類虹彩病毒感染與疾病暴發(fā)的分子基礎(chǔ)。 2. 揭示病毒對(duì)魚類宿主細(xì)胞機(jī)能具有操控作用的關(guān)鍵基因5-6個(gè)、mirna3-4個(gè)，以及與其相互作用的信號(hào)分子和信號(hào)通路，初步闡明虹彩病毒對(duì)魚類細(xì)胞機(jī)能的調(diào)

24、控網(wǎng)絡(luò)和操控機(jī)制。 3. 闡明3-4種魚類虹彩病毒致病株的遺傳與演化特征，揭示虹彩病毒感染致病的遺傳變異與疫病爆發(fā)流行規(guī)律。 4. 在國(guó)際期刊發(fā)表sci論文20-25篇，其中在top期刊發(fā)表論文8篇以上。 5. 建設(shè)一支具有國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力的研究團(tuán)隊(duì)，培養(yǎng)研究生20名以上。課題負(fù)責(zé)人： 秦啟偉承擔(dān)單位： 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所、國(guó)家海洋局第三海洋研究所、浙江大學(xué)、中山大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院海洋研究所經(jīng)費(fèi)比例： 15.5%課題三 對(duì)蝦免疫系統(tǒng)對(duì)wssv感染的響應(yīng)過程與特征研究?jī)?nèi)容：1. 對(duì)蝦抗wssv感染的關(guān)鍵基因及次生代謝產(chǎn)物利用組學(xué)技術(shù)研究對(duì)蝦相關(guān)基因在不同組織、病毒感染的不同時(shí)間轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化

25、，明確對(duì)蝦抗病毒感染的關(guān)鍵基因；采用gc-ms、lc-ms技術(shù)，比較對(duì)蝦在病毒感染前后產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，確定與病毒感染密切相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物及其免疫調(diào)節(jié)作用。2. 對(duì)蝦應(yīng)對(duì)wssv感染的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)重點(diǎn)研究對(duì)蝦對(duì)病毒的模式識(shí)別受體、信號(hào)傳導(dǎo)分子和效應(yīng)分子，確定nf-kb、jak/stat、mapk途徑和rna干擾途徑在對(duì)蝦抗病毒免疫中的功能及其交互作用；研究并闡明次生代謝產(chǎn)物在細(xì)胞吞噬和細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。3. 對(duì)蝦免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)及白斑綜合征爆發(fā)過程分析比較不同種類對(duì)蝦在慢性感染期和急性感染期的免疫反應(yīng)，揭示對(duì)蝦白斑綜合征疫病爆發(fā)的主要免疫學(xué)特征；研究關(guān)鍵環(huán)境因子（如溫度、溶解氧

26、等）驟變對(duì)對(duì)蝦免疫穩(wěn)態(tài)的影響，確定關(guān)鍵環(huán)境因子與對(duì)蝦白斑綜合征爆發(fā)的關(guān)系。研究目標(biāo)：1. 鑒定對(duì)蝦抗病毒的關(guān)鍵基因/蛋白8個(gè)以上。2. 獲得具有抗病毒活性的次生代謝產(chǎn)物2個(gè)以上，抗病毒保護(hù)率達(dá)到50%以上。3. 闡明對(duì)蝦抗病毒的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而建立以對(duì)蝦為代表的甲殼類動(dòng)物天然免疫系統(tǒng)的基本框架結(jié)構(gòu)。4. 申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利8-10項(xiàng)；發(fā)表sci收錄論文30-40篇，其中在病毒學(xué)領(lǐng)域、水產(chǎn)領(lǐng)域和相關(guān)領(lǐng)域國(guó)際權(quán)威期刊發(fā)表論文不少于20篇。5. 培養(yǎng)研究生10-15人，博士后2-3人。課題負(fù)責(zé)人： 相建海承擔(dān)單位： 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所、浙江大學(xué)、國(guó)家海洋局第三海洋研究所、廈門大學(xué)經(jīng)費(fèi)比例： 17%

27、 課題四 魚類應(yīng)對(duì)虹彩病毒感染的免疫反應(yīng)與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究?jī)?nèi)容：1. 魚類應(yīng)對(duì)病原感染的天然免疫反應(yīng)關(guān)鍵途徑與調(diào)控研究魚類模式識(shí)別受體的結(jié)構(gòu)功能、表達(dá)調(diào)控，揭示受體識(shí)別病毒的分子機(jī)制；研究干擾素免疫系統(tǒng)的組成與信號(hào)通路調(diào)控以及新型抗微生物多肽基因的表達(dá)調(diào)控與作用，闡明宿主清除病原的分子機(jī)理。2. 魚類應(yīng)對(duì)病原感染的適應(yīng)性免疫激活、維持與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究并揭示魚類參與抗病原感染的t細(xì)胞和b細(xì)胞亞群的免疫遺傳表型和分化發(fā)育規(guī)律；研究抗原遞呈細(xì)胞活化初始t細(xì)胞的途徑，分析細(xì)胞免疫和體液免疫以及treg免疫抑制的形成機(jī)制，闡明其在抗病毒侵染中的作用；研究并查明抗病毒適應(yīng)性免疫的形成和維持的細(xì)胞與分子基礎(chǔ)及關(guān)鍵

28、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3. 魚類抗病毒感染的環(huán)境因素及其免疫調(diào)控分析魚類病毒病發(fā)生的環(huán)境誘因，明確環(huán)境因素與魚類抗病力的耦合關(guān)系；研究不同環(huán)境因素對(duì)魚類抗病毒免疫力的影響，揭示魚類應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的免疫信號(hào)通路及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；研究并闡明環(huán)境因素對(duì)免疫力親子傳遞與維持的影響。研究目標(biāo)：1. 確立魚類識(shí)別病毒的關(guān)鍵基因和蛋白15個(gè)、防御病毒的關(guān)鍵基因和蛋白15個(gè)，闡明宿主識(shí)別與清除病原的分子機(jī)理。2. 明確魚類應(yīng)對(duì)病原感染的免疫反應(yīng)關(guān)鍵途徑2-3條、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)2-3個(gè)，確立環(huán)境脅迫影響魚類抗病力的機(jī)制，為疫病防治奠定理論基礎(chǔ)。3. 為魚類疫苗、免疫佐劑和抗病毒制劑的開發(fā)和應(yīng)用，提供符合魚類免疫機(jī)理和特點(diǎn)的、有針對(duì)性的

29、理論指導(dǎo)。4. 在國(guó)際相關(guān)刊物發(fā)表sci論文25-30篇；申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利3-5項(xiàng)。5. 培養(yǎng)博士生20名，碩士研究生20名，博士后2名。課題負(fù)責(zé)人： 張士璀承擔(dān)單位： 中國(guó)海洋大學(xué)、浙江大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所、中國(guó)科學(xué)院海洋研究所經(jīng)費(fèi)比例： 15.5%課題五 對(duì)蝦白斑綜合征防治的免疫學(xué)途徑和關(guān)鍵技術(shù)原理研究?jī)?nèi)容：1. 阻斷或抑制wssv侵染與復(fù)制的原理和途徑優(yōu)選調(diào)控wssv侵染與復(fù)制的關(guān)鍵靶標(biāo)，研究針對(duì)病毒入侵、復(fù)制、組裝和傳播等關(guān)鍵過程的阻斷、抑制和干擾技術(shù)原理；應(yīng)用受體封閉、競(jìng)爭(zhēng)抑制和rnai等方法與途徑，實(shí)現(xiàn)對(duì)wssv侵染的有效阻斷。2. 對(duì)蝦免疫系統(tǒng)激活與調(diào)節(jié)的技術(shù)原理研究對(duì)

30、蝦抗感染的關(guān)鍵免疫因子的激活途徑和利用原理；優(yōu)選可調(diào)控關(guān)鍵免疫因子的免疫激活與調(diào)節(jié)制劑；發(fā)展維持對(duì)蝦免疫穩(wěn)態(tài)的環(huán)境與生態(tài)操控技術(shù)，找出提高對(duì)蝦抗wssv感染免疫力的有效方法與技術(shù)途徑。3. 免疫活性物質(zhì)導(dǎo)入途徑與技術(shù)研究免疫活性物質(zhì)的不同包被處理方法和導(dǎo)入方式，分析比較攝取、吸收和免疫增強(qiáng)效果，確定高效導(dǎo)入途徑；研究使用共生菌載體直接導(dǎo)入免疫效應(yīng)分子的技術(shù)原理。研究目標(biāo)：1. 定位wssv侵染過程中病毒與宿主關(guān)鍵蛋白或基因；獲得3-4種可有效阻斷wssv入侵的特異性抗體；構(gòu)建具有穩(wěn)定阻斷效果的rnai載體，為對(duì)蝦白斑病等病害的防治開辟新途徑。2. 明確不同類型免疫增強(qiáng)劑的免疫增強(qiáng)機(jī)理，篩選到4

31、-6種高效、健康的免疫增強(qiáng)劑；明確不同類型免疫增強(qiáng)劑的免疫機(jī)理；鑒定wssv感染相關(guān)對(duì)蝦主要免疫因子，闡明其功能。3. 獲得2-3株能有效阻斷wssv入侵的特異性抗體的活性單鏈抗體；實(shí)現(xiàn)3-5種抗病免疫因子基因在酵母或細(xì)菌中的高效表達(dá)，獲得具有相應(yīng)生物學(xué)活性的重組蛋白；優(yōu)化對(duì)蝦抗病生物活性物質(zhì)導(dǎo)入途徑。4. 篩選到2-3種可增強(qiáng)對(duì)蝦抗病力的養(yǎng)殖環(huán)境友好型外源生物。5. 發(fā)表學(xué)術(shù)論文20-25篇；申請(qǐng)發(fā)明專利 3-5項(xiàng)，培養(yǎng)研究生30-40名。課題負(fù)責(zé)人： 宋林生承擔(dān)單位： 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所、中國(guó)海洋大學(xué)、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所、山東大學(xué)、天津師范大學(xué)經(jīng)費(fèi)比例： 21%課題六 魚類

32、疫病免疫防治的系統(tǒng)疫苗學(xué)原理與技術(shù)途徑研究?jī)?nèi)容：1. 疫苗的設(shè)計(jì)與傳遞策略針對(duì)危害嚴(yán)重的魚類虹彩病毒等主要疫病病原，基于免疫學(xué)、生物信息學(xué)和組學(xué)技術(shù)，篩選免疫原，確定保護(hù)原，開發(fā)新型疫苗、免疫佐劑和疫苗遞呈載體，建立高效疫苗的設(shè)計(jì)與導(dǎo)入技術(shù)。2. 疫苗的效應(yīng)機(jī)制研究不同接種途徑疫苗被宿主細(xì)胞的攝取效率，分析疫苗在宿主組織中的分布及穩(wěn)定性；研究抗原的激活與信號(hào)傳遞，分析疫苗誘發(fā)的免疫應(yīng)答特征并確定其與疫苗保護(hù)效應(yīng)的關(guān)系。3. 疫苗的免疫效應(yīng)指示和評(píng)價(jià)體系基于疫苗效應(yīng)機(jī)制研究，優(yōu)選關(guān)鍵免疫分子，對(duì)比疫苗接種的實(shí)際免疫保護(hù)效果，針對(duì)不同類型疫苗和代表性重要經(jīng)濟(jì)魚類，確定疫苗效應(yīng)的分子指示，建立疫苗效

33、應(yīng)的評(píng)價(jià)體系。研究目標(biāo)：1. 建立魚類病毒疫苗的設(shè)計(jì)策略和疫苗的高效表達(dá)與導(dǎo)入技術(shù)。2. 構(gòu)建5個(gè)高效候選疫苗，其相對(duì)保護(hù)率不低于70；篩選出3個(gè)高效免疫佐劑，其能夠提高免疫保護(hù)效率15以上。3. 初步闡明一種疫苗的免疫效應(yīng)機(jī)制和一種疫苗佐劑的作用機(jī)制。4. 建立一種疫苗效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)體系。5. 發(fā)表sci收錄論文30篇，其中10篇發(fā)表于相關(guān)研究領(lǐng)域top學(xué)術(shù)刊物；申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利10項(xiàng)。6. 培養(yǎng)碩士和博士研究生15-20名。課題負(fù)責(zé)人： 孫 黎承擔(dān)單位： 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所、中山大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所、中國(guó)海洋大學(xué)經(jīng)費(fèi)比例： 15.5%（六）課題間關(guān)系從病原角度，設(shè)置2個(gè)課題，

34、分別對(duì)對(duì)蝦和海水魚類的主要病原（wssv和魚類虹彩病毒）開展致病因子及其與宿主相互作用機(jī)制和分子流行病學(xué)研究，以查明病原的致病機(jī)理及疫病爆發(fā)流行的機(jī)制，為免疫防治提供關(guān)鍵分子靶位。在宿主免疫系統(tǒng)方面，設(shè)置2個(gè)課題，分別研究對(duì)蝦、魚類抗病毒侵染的關(guān)鍵分子過程、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其與環(huán)境關(guān)系，其研究結(jié)果將有助于揭示宿主抗感染機(jī)制，也為免疫防治提供重要理論依據(jù)。宿主和病原之間存在相互作用，這兩個(gè)課題承上啟下，貫穿整個(gè)項(xiàng)目。以前4個(gè)課題為基礎(chǔ)，設(shè)置課題5和課題6，研究阻斷病原感染或提高宿主免疫力的原理與應(yīng)用途徑。以上課題設(shè)置及其相互關(guān)系見圖2所示。圖2. 六個(gè)課題的設(shè)置及其相互關(guān)系四、年度計(jì)劃（一）第一年度計(jì)

35、劃內(nèi)容和目標(biāo)1. 研究?jī)?nèi)容（1）wssv和虹彩病毒的侵染與致?。褐苽涓呒兌鹊膚ssv經(jīng)口服或鰓涂布攻毒后，用定量pcr和電鏡技術(shù)分析wssv的入侵途徑、最初感染的組織及在組織間傳播的方式；wssv潛伏感染對(duì)蝦模型的建立，研究誘導(dǎo)wssv潛伏感染轉(zhuǎn)為急性感染的理化因子；對(duì)wssv極早期基因啟動(dòng)子進(jìn)行缺失突變，尋找最小功能元件；分析不同wssv分離株的毒力，研究近年wssv流行株基因型特征及演化規(guī)律；，測(cè)定3-5株致病力差異大的毒株全基因組，通過序列比對(duì)，找出差異基因作為候選毒力基因。構(gòu)建、篩選純化有感染性的熒光標(biāo)記重組魚類虹彩病毒；鑒定病毒基因功能，研究其與病毒感染力及侵染的關(guān)系；預(yù)測(cè)虹彩病毒m

36、irna潛在的病毒或宿主基因靶標(biāo)；調(diào)查不同生境中的魚類虹彩病毒。（2）對(duì)蝦和魚類的免疫防御機(jī)制： 利用組學(xué)技術(shù)研究對(duì)蝦和魚類相關(guān)基因在不同組織、病毒感染的不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化，篩查抗病毒感染的關(guān)鍵基因；深入研究比較免疫識(shí)別蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和效應(yīng)分子的結(jié)構(gòu)特征、組織分布和表達(dá)調(diào)控規(guī)律；研究魚類干擾素免疫系統(tǒng)相關(guān)基因，研究其表達(dá)與組織分布；分離鑒定新型抗微生物多肽，克隆新型抗微生物多肽基因；分離魚類參與抗病原感染的魚類t、b細(xì)胞等關(guān)鍵免疫細(xì)胞，研究其免疫遺傳表型。（3）免疫防治的原理和技術(shù)：篩選和鑒定wssv侵染的黏附蛋白和對(duì)蝦抵抗wssv侵染的關(guān)鍵免疫因子；rnai技術(shù)體系的構(gòu)建；篩選

37、免疫增強(qiáng)劑和養(yǎng)殖環(huán)境友好型外源微生物。運(yùn)用免疫學(xué)、生物信息學(xué)和組學(xué)等技術(shù)，系統(tǒng)篩選虹彩病毒免疫原，檢測(cè)其保護(hù)效應(yīng)；確定免疫保護(hù)抗原，構(gòu)建抗原表達(dá)載體，檢測(cè)載體的穩(wěn)定性。2. 預(yù)期目標(biāo)（1）wssv和虹彩病毒的侵染與致病：初步確定wssv在個(gè)體水平的入侵途徑、最初感染的組織及在組織間傳播的方式；獲得wssv極早期基因啟動(dòng)子的最小功能元件；建立wssv潛伏感染凡納濱對(duì)蝦模型；獲得3-5株毒力差異株的全序列，獲得候選毒力基因。成功獲得1-2株有感染性的熒光標(biāo)記重組魚類虹彩病毒；確定2-3個(gè)病毒參與侵染和致病的關(guān)鍵基因；篩選得到虹彩病毒mirna的病毒或宿主靶基因；初步確定虹彩病毒疫病爆發(fā)流行情況。（

38、2）對(duì)蝦和魚類的免疫防御機(jī)制：篩選獲得對(duì)蝦在wssv感染后差異表達(dá)的重要基因或蛋白20個(gè)以上；克隆獲得參與魚蝦抗病毒體液免疫的重要基因10-15個(gè)，分析其基因結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)特征；得到參與抗病毒細(xì)胞免疫的重要基因序列2-3個(gè)；分離鑒定魚類t、b等免疫細(xì)胞亞群。（3）免疫防治的原理和技術(shù)：鑒定出wssv侵染的關(guān)鍵蛋白和對(duì)蝦抵抗wssv侵染的主要免疫因子；初步建立起對(duì)蝦rnai的技術(shù)體系；克隆到1-2個(gè)免疫因子基因，并闡明其可能的抗病毒機(jī)理；篩選2-3種免疫增強(qiáng)劑，確定免疫增強(qiáng)效果；獲得候選的養(yǎng)殖環(huán)境友好型外源生物；獲得4種免疫保護(hù)原，建立保護(hù)原的表達(dá)技術(shù)。（4）論文發(fā)表、專利申請(qǐng)和研究生培養(yǎng)：發(fā)表

39、sci源刊物論文20-25篇，申請(qǐng)專利4-6項(xiàng)，培養(yǎng)研究生20名。（二）第二年度計(jì)劃內(nèi)容和目標(biāo)1. 研究?jī)?nèi)容（1）wssv和虹彩病毒的侵染與致?。河秒婄R技術(shù)或熒光標(biāo)記技術(shù)研究wssv進(jìn)入細(xì)胞的過程，判斷病毒是通過直接膜融合還是內(nèi)吞的方式進(jìn)入細(xì)胞；篩選能結(jié)合wssv極早期基因啟動(dòng)子的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子；利用免疫共沉淀和凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)篩選wssv早期調(diào)控因子作用靶分子；確定誘發(fā)wssv潛伏轉(zhuǎn)為急性感染的關(guān)鍵理化因子及其濃度；對(duì)候選毒力基因進(jìn)行初步的功能預(yù)測(cè)和克隆，在昆蟲細(xì)胞或原代蝦細(xì)胞中過量表達(dá)，分析對(duì)細(xì)胞是否產(chǎn)生直接影響或傷害，確定主要的毒力基因。觀察重組虹彩病毒感染后不同階段細(xì)胞內(nèi)感染軌跡和病毒入

40、侵途徑；克隆、鑒定與病毒感染相關(guān)的模式識(shí)別受體基因，研究其在病毒黏附和入侵過程中的作用；開展魚類虹彩病毒及病毒基因?qū)λ拗髅庖咝盘?hào)分子的調(diào)節(jié)作用；研究虹彩病毒mirna對(duì)病毒或宿主靶標(biāo)基因的調(diào)節(jié)作用；繼續(xù)調(diào)查和比較不同種類虹彩病毒的宿主范圍。（2）對(duì)蝦和魚類的免疫防御機(jī)制：研究魚蝦對(duì)病毒的識(shí)別分子、信號(hào)傳導(dǎo)分子和效應(yīng)分子的功能和表達(dá)調(diào)控，揭示受體識(shí)別病毒的分子機(jī)制；研究在對(duì)蝦細(xì)胞吞噬免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的基因及其表達(dá)調(diào)控；采用gc-ms、lc-ms技術(shù)，比較對(duì)蝦在病毒感染前后產(chǎn)生的免疫效應(yīng)產(chǎn)物；研究在養(yǎng)殖溫度、溶解氧等環(huán)境因子驟變條件下白斑綜合征病毒在對(duì)蝦體內(nèi)的復(fù)制變化特征；研究干擾素免疫系統(tǒng)信

41、號(hào)通路的調(diào)控作用；研究抗微生物多肽基因的表達(dá)、調(diào)控與功能；研究魚類參與抗病原感染的t、b等免疫細(xì)胞亞群的分化發(fā)育規(guī)律。（3）免疫防治的原理和技術(shù)：利用中和抗體和受體抗體阻斷wssv侵染技術(shù)的建立；篩選和鑒定wssv大規(guī)模復(fù)制的關(guān)鍵蛋白；構(gòu)建具有高效、穩(wěn)定阻斷作用的rnai載體；繼續(xù)免疫因子鑒定和基因克隆，進(jìn)行主要免疫因子基因的重組表達(dá)；開展免疫增強(qiáng)劑作用機(jī)理研究；分析養(yǎng)殖環(huán)境友好型外源微生物的生態(tài)功能。在魚類方面著重開展疫苗免疫佐劑篩選研究，利用免疫保護(hù)原及其表達(dá)載體，設(shè)計(jì)、構(gòu)建高效病毒疫苗，檢測(cè)疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)；研究疫苗的口服/浸泡、注射等傳遞技術(shù)，比較其效應(yīng)，確定有效的免疫途徑。2. 預(yù)

42、期目標(biāo)（1）wssv和虹彩病毒的侵染與致?。好鞔_wssv病毒是通過膜融合還是內(nèi)吞的方式進(jìn)入對(duì)蝦細(xì)胞；獲得2個(gè)以上可能與極早期基因啟動(dòng)子結(jié)合的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子；獲得2個(gè)以上wssv早期調(diào)控因子的潛在靶分子；確定2個(gè)以上誘發(fā)wssv潛伏感染轉(zhuǎn)為急性的關(guān)鍵環(huán)境因子；確定主要的毒力基因2個(gè)以上。闡明魚類虹彩病毒侵染的運(yùn)動(dòng)軌跡及復(fù)制方式；確定2-3個(gè)與病毒黏附或入侵相關(guān)的模式識(shí)別受體；確定1-2個(gè)對(duì)宿主細(xì)胞機(jī)能具有調(diào)控作用的病毒基因；確定1-2個(gè)對(duì)病毒復(fù)制或宿主免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用的虹彩病毒mirna；確定虹彩病毒的宿主范圍，揭示其流行特征。（2）對(duì)蝦和魚類的免疫防御機(jī)制：獲得對(duì)蝦抗wssv感染的關(guān)鍵候

43、選分子3個(gè)以上，明確其在組織、細(xì)胞中的定位；闡明細(xì)胞吞噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其抗wssv作用；初步查明在不同環(huán)境因子條件下蝦體內(nèi)wssv數(shù)量的消長(zhǎng)變化規(guī)律。獲取魚類模式識(shí)別/效應(yīng)分子關(guān)鍵基因10-15個(gè)，明確其表達(dá)和功能；闡明魚類t、b等免疫細(xì)胞亞群分化規(guī)律。（3）免疫防治的原理和技術(shù)：初步建立單克隆抗體阻斷wssv侵染的技術(shù)；鑒定出負(fù)責(zé)wssv復(fù)制的關(guān)鍵蛋白；構(gòu)建出導(dǎo)入效果較佳的rnai載體；獲得有具有生物學(xué)活性的重組免疫因子3-5個(gè)；篩選免疫增強(qiáng)劑2-3種，明確其作用機(jī)理；明確微生物在對(duì)蝦養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中的營(yíng)養(yǎng)及生態(tài)防病功能；構(gòu)建出1個(gè)高效候選疫苗，其相對(duì)保護(hù)率不低于70；獲得1個(gè)高效免疫佐劑，

44、其能夠提高免疫保護(hù)效率15；建立1種疫苗的高效導(dǎo)入技術(shù)。（4）論文發(fā)表、專利申請(qǐng)和研究生培養(yǎng)：發(fā)表sci論文30篇，申請(qǐng)專利6項(xiàng)，培養(yǎng)博士后和研究生共30名。（三）第三年度計(jì)劃內(nèi)容和目標(biāo)1. 研究?jī)?nèi)容（1）wssv和虹彩病毒的侵染與致病：應(yīng)用針對(duì)性的阻斷劑對(duì)wssv穿透過程（penetration）進(jìn)行阻斷，確認(rèn)病毒借助了哪條途徑進(jìn)入細(xì)胞；應(yīng)用亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的標(biāo)志物并結(jié)合通路阻斷劑，分析wssv如何在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸并將遺傳物質(zhì)傳遞入核；驗(yàn)證細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子與wssv極早期基因啟動(dòng)子的相互作用，進(jìn)一步確認(rèn)極早期蛋白與靶分子的結(jié)合；研究關(guān)鍵環(huán)境因子對(duì)對(duì)蝦免疫相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其系列基因的影響，確定環(huán)境影響的關(guān)

45、鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和基因；通過rna干擾的方法，對(duì)候選毒力基因進(jìn)行沉默，比對(duì)分析宿主機(jī)體損傷的程度，并對(duì)感染蝦的死亡率進(jìn)行比較，評(píng)估毒力基因與致病力的關(guān)系。研究分析重組虹彩病毒感染后不同階段組織內(nèi)感染軌跡、病毒入侵途徑；繼續(xù)開展虹彩病毒關(guān)鍵致病基因的功能研究；繼續(xù)克隆鑒定病毒感染相關(guān)的模式識(shí)別受體，深入研究其在病毒黏附和入侵過程中的作用；繼續(xù)開展魚類虹彩病毒基因?qū)λ拗餍盘?hào)通路的調(diào)節(jié)作用；開展魚類虹彩病毒的遺傳變異規(guī)律研究。（2）對(duì)蝦和魚類的免疫防御機(jī)制：研究體液免疫信號(hào)通路（toll, mapk等）在對(duì)蝦抗病毒免疫中的作用；研究非編碼小rna在細(xì)胞凋亡中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其在對(duì)蝦抗病毒中的作用；篩選

46、抗病毒感染的免疫效應(yīng)產(chǎn)物；研究環(huán)境脅迫對(duì)蝦類免疫穩(wěn)態(tài)的影響。分離鑒定構(gòu)成魚類重要免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（包括干擾素調(diào)節(jié)途徑）的關(guān)鍵元件；研究不同環(huán)境因素對(duì)魚類免疫信號(hào)通路及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響；研究新型抗微生物多肽基因的作用機(jī)制；研究抗原遞呈細(xì)胞活化初始t細(xì)胞的機(jī)制，分析細(xì)胞免疫和體液免疫以及treg免疫抑制的形成機(jī)制，闡明其在抗病毒侵染中的作用。（3）免疫防治的原理和技術(shù)：篩選能阻斷wssv侵染的單克隆抗體；分析rnai對(duì)wssv復(fù)制的抑制效果；鑒定重組免疫因子抗病毒的活性；優(yōu)選免疫增強(qiáng)劑；確定不同免疫增強(qiáng)劑間相互促進(jìn)/協(xié)同或頡抗關(guān)系；分析養(yǎng)殖環(huán)境友好型外源生物作用于對(duì)蝦的機(jī)制。設(shè)計(jì)、構(gòu)建不同類型疫苗

47、，篩選疫苗免疫佐劑，分析佐劑的免疫效應(yīng)；研究不同接種途徑疫苗被宿主細(xì)胞的攝取效率，分析疫苗在宿主組織中的分布及穩(wěn)定性。2. 預(yù)期目標(biāo)（1）wssv和虹彩病毒的侵染與致?。捍_認(rèn)wssv進(jìn)入細(xì)胞并將遺傳物質(zhì)傳遞入核的途徑；明確極早期基因及其產(chǎn)物與宿主分子的相互作用；揭示環(huán)境因子影響的主要對(duì)蝦信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和基因；了解主要wssv毒力基因與致病力的關(guān)系。闡明魚類虹彩病毒侵染的靶組織和侵染途徑；確定2-3個(gè)病毒參與侵染和致病的關(guān)鍵基因；鑒定2-3個(gè)與病毒黏附或入侵相關(guān)的模式識(shí)別受體；確定能夠調(diào)節(jié)宿主免疫信號(hào)通路的2-3個(gè)病毒基因；初步揭示魚類虹彩病毒的遺傳變異特征。（2）對(duì)蝦和魚類的免疫防御機(jī)制：確定對(duì)

48、蝦體液免疫中的關(guān)鍵分子在抗wssv感染過程中的作用；闡明細(xì)胞凋亡的mirna調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其抗病毒作用；揭示對(duì)蝦在wssv慢性感染和急性感染中免疫響應(yīng)特征的異同。累計(jì)獲取魚類模式識(shí)別/效應(yīng)分子關(guān)鍵基因不少于30個(gè)，明確其表達(dá)和部分基因功能；闡明抗原遞呈細(xì)胞活化初始t細(xì)胞的機(jī)制。（3）免疫防治的原理和技術(shù)：篩選出具有阻斷效果的單克隆抗體和能阻斷wssv復(fù)制的干擾基因片段；鑒定出具有抗病毒活性的重組免疫因子；優(yōu)化出3-5種效果明顯的免疫增強(qiáng)劑，確定它們間的協(xié)同機(jī)制；明確養(yǎng)殖環(huán)境友好型外源生物的作用機(jī)制。構(gòu)建2個(gè)高效候選疫苗，其相對(duì)保護(hù)率不低于70；獲得2個(gè)高效免疫佐劑，其能夠提高免疫保護(hù)效率1

49、5；初步闡明1種佐劑的作用機(jī)制。（4）論文發(fā)表、專利申請(qǐng)和研究生培養(yǎng)：發(fā)表sci論文30-40篇，申請(qǐng)專利8項(xiàng)以上，培養(yǎng)博士后和研究生30名以上。（四）第四年度計(jì)劃內(nèi)容和目標(biāo)1. 研究?jī)?nèi)容（1） wssv和虹彩病毒的侵染與致病：研究參與wssv病毒穿透過程（penetration）的宿主蛋白，以及細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白在wssv遺傳物質(zhì)入核過程中的作用；利用報(bào)告基因技術(shù)研究wssv極早期基因啟動(dòng)子受細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制；通過在細(xì)胞中過表達(dá)早期調(diào)控因子來研究它們對(duì)宿主細(xì)胞生理狀態(tài)的影響；研究對(duì)蝦免疫相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及基因?qū)ssv潛伏感染維持影響；利用免疫共沉淀或酵母雙雜交等技術(shù)篩選主要毒力因子的靶

50、蛋白。繼續(xù)進(jìn)行虹彩病毒關(guān)鍵基因的功能分析和鑒定；深入解析病毒蛋白和宿主免疫基因的相互作用及調(diào)控機(jī)制；繼續(xù)研究虹彩病毒mirna對(duì)宿主細(xì)胞機(jī)能和免疫信號(hào)通路的操控作用；繼續(xù)開展魚類虹彩病毒的遺傳變異規(guī)律研究。（2）對(duì)蝦和魚類的免疫防御機(jī)制：研究不同免疫信號(hào)通路之間的交互作用和免疫效應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞吞噬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用；研究維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要因子在環(huán)境變化下的表達(dá)變化特征，分析潛伏感染與病毒病爆發(fā)的關(guān)系。研究魚類抗病毒適應(yīng)性免疫激活和維持的關(guān)鍵細(xì)胞與關(guān)鍵分子；研究環(huán)境因素對(duì)魚類體液免疫的影響以及對(duì)魚類抗病毒感染的免疫調(diào)控；研究重組表達(dá)或化學(xué)合成抗微生物多肽的體外抗病毒等病原的作用；研究環(huán)境因素對(duì)免疫力

51、親子傳遞與維持的影響。（3）免疫防治的原理和技術(shù)：研制能有效阻斷wssv侵染的特異性抗體的活性單鏈抗體；構(gòu)建rnai阻斷wssv復(fù)制的技術(shù)；進(jìn)一步驗(yàn)證重組免疫因子抗病毒活性及安全性；研究免疫活性物質(zhì)的包裝、加工和導(dǎo)入技術(shù)及其配伍；篩選可攜帶免疫活性物質(zhì)的養(yǎng)殖環(huán)境友好型外源生物。繼續(xù)進(jìn)行高效疫苗的構(gòu)建，開展疫苗在鲆鰈/石斑魚等重要經(jīng)濟(jì)魚類中的安全和綜合免疫評(píng)價(jià)研究，研究高效疫苗免疫后疫苗抗原在宿主內(nèi)的傳遞，分析疫苗誘發(fā)的免疫應(yīng)答特征，確定其與疫苗保護(hù)效應(yīng)的關(guān)系。2. 預(yù)期目標(biāo)（1）wssv和虹彩病毒的侵染與致?。捍_定參與wssv入侵細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白；了解wssv極早期基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制；明確主要的早期調(diào)控因子對(duì)宿主細(xì)胞的影響；揭示對(duì)蝦免疫相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其基因在wssv潛伏感染中的作用；獲得主要毒力因子的靶分子2個(gè)以上。鑒定出2-3個(gè)參與魚類虹彩病毒感染和免疫逃逸的關(guān)鍵基因；闡明虹彩病毒基因?qū)λ拗髅庖呋虻恼{(diào)節(jié)機(jī)制；確定2-3個(gè)參與宿主免疫調(diào)控機(jī)制的虹彩病毒mirna；揭示魚類虹彩病毒遺傳變異與不同