胚胎植入前遺傳學(xué)診斷

1、胚胎植入前遺傳學(xué)診斷 (Preimplantation Genetic Diagnosis ,PGD) 一、定義 胚胎種植前遺傳學(xué)診斷(PGD)是指在體外受精過程中，對具有遺傳風(fēng)險(xiǎn)患者的胚胎進(jìn)行 種植前活檢和遺傳學(xué)分析， 以選擇無遺傳學(xué)疾病的胚胎植入宮腔， 從而獲得正常胎兒的診斷 方法，可有效地防止有遺傳疾病患兒的出生。 植入前遺傳學(xué)診斷是隨著人類輔助生殖技術(shù)， 即“試管嬰兒” 技術(shù)發(fā)展而開展起來的一 種新技術(shù)，它是產(chǎn)前診斷的延伸，遺傳學(xué)診斷的又一更有希望的新技術(shù)。 二、意義 (一) 對高齡孕婦和高危婦女進(jìn)行 PGD 可以有效地避免遺傳病患兒的出生。 (二) 可以有效地避免傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷技術(shù)，

2、對異常胚胎進(jìn)行治療性流產(chǎn)，避免中期 妊娠遺傳診斷及終止妊娠所致的危險(xiǎn)及痛苦。 (三) PGD技術(shù)的產(chǎn)生與完善可以排除遺傳病攜帶者胚胎，阻斷致病基因的縱向傳 遞，從而降低人類遺傳負(fù)荷。 三、適應(yīng)征 理論上只要有足夠的序列信息，PGD能針對任何遺傳條件進(jìn)行診斷，即凡是能夠被診 斷的遺傳病都可以通過PGD來防止其患兒出生。 進(jìn)行 PGD 的主要對象是可能有遺傳異?；蚋呶＿z傳因素，需要產(chǎn)前診斷的病例，尤其 是可能同時(shí)具有兩種以上不同的遺傳異常情況。 PGD現(xiàn)已用于一些單基因缺陷的特殊診斷，包括Duche nne型肌營養(yǎng)不良、脆性X綜 合征、黑朦性白癡(Tay Sachsdiseade)囊性纖維病(cy

3、sticfibrosis)、Rh血型、甲型血友病、 鐮型細(xì)胞貧血和地中海貧血、進(jìn)行性營養(yǎng)不良、新生兒溶血、21 抗蛋白缺乏癥， 、粘多糖貯 積癥(MPS )、韋霍二氏脊髓性肌萎縮(Werding Hoffman disease)，還有染色體異常如 Down 綜合征、 18 三體，羅氏易位等。 四、植入前遺傳學(xué)診斷的取材 可從胚胎著床前各個(gè)階段活檢取樣， 獲取其遺傳物質(zhì)信息進(jìn)行診斷。 目前多采用激光打 孔、機(jī)械切割或 Tyrode 酸化打孔后吸出細(xì)胞的方法取材。 一）極體 極體細(xì)胞可以使用第一極體或第二極體， 它們在胚胎發(fā)育和合子形成中是非必須的， 而不影響卵子受精和正常發(fā)育， 且不會(huì)引起倫理學(xué)

4、上的爭議。 極體活檢比胚胎活檢對胚胎的 創(chuàng)傷性小，且不為染色體的嵌合性所影響，可以間接地反映母源性遺傳缺陷。 但極體活檢細(xì)胞不能檢測父源性非整倍體核型或發(fā)生于受精期間及受精后的其它異常， 例如多倍體、單倍體及嵌合性，而且只能取到一個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行分析，結(jié)果的可靠性有限。 （二） 卵裂球細(xì)胞 目前PGD多選在卵裂期， 即體外受精3天后610細(xì)胞期進(jìn)行。取出1-2卵裂細(xì)胞進(jìn) 行診斷，其它細(xì)胞留待診斷后決定取舍。實(shí)驗(yàn)證明，從胚胎中活檢出25% 的細(xì)胞，并不會(huì) 影響其正常發(fā)育 ;活檢成功率可達(dá) 97%。 胚胎活檢可以用于檢測母體的非整倍體核型以及父源的非整倍體核型、多倍體、 單倍體 和廣泛的嵌合性，診斷的

5、準(zhǔn)確性較高。 （三）囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞 有了囊胚培養(yǎng)后： 1）可為植入前診斷提供充足的時(shí)間 ;2）可活檢滋養(yǎng)層細(xì)胞用于診 斷，不影響胚體的發(fā)育，且所能獲取的細(xì)胞數(shù)目相對多些（1030個(gè)），減少嵌合現(xiàn)象干擾。 而且此階段的胚胎基因表達(dá)更為完全，增加了診斷的可靠性，是較為理想的 PGD 材料。 然而受精卵在體外培養(yǎng)，目前只能有50%能達(dá)到囊胚。使該時(shí)期的 PGD 受到了限制。 盡管引入了激光活檢并改善了囊胚培養(yǎng)方法， 許多研究中心仍然選擇在胚胎發(fā)育的第 3天進(jìn) 行檢查。目前囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢進(jìn)行 PGD 還罕見報(bào)道。 五、主要檢測技術(shù) 單基因病的 PGD 基本上以 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)。染色體原位雜交

6、（FISH） 技術(shù)的引入，擴(kuò)大 了 PGD 的診斷范圍， 特別是間期核單細(xì)胞 FISH 技術(shù)的成功， 以及多種多樣 FISH 探針的開 發(fā)，把 PGD 擴(kuò)展到了染色體病的診斷。 （一）熒光原位雜交（ Fluorescence In Situ Hybridization ， FISH ） 將 DNA 探針用不同顏色熒光染料標(biāo)記，與固定在玻片上的卵裂球細(xì)胞不同染色體雜交 后，在熒光顯微鏡下被雜交的部分呈現(xiàn)不同顏色的熒光,從而對染色體異常進(jìn)行篩查。通過 FISH 技術(shù)采用多種探針可診斷男、女性別和性連鎖疾病，也可診斷染色體疾病包括數(shù)目和 結(jié)構(gòu)的畸變。 1、FISH簡要流程。一般每個(gè)卵裂球細(xì)胞只能標(biāo)記

7、5條染色體，約需5個(gè)多小時(shí)。 1）固定卵裂球細(xì)胞于玻片上 ; 2）細(xì)胞裂解 ; 3）脫水; 4）熒光標(biāo)記探針，并使之與卵裂球染色體雜交; 5）漂洗除去背景染料 ; 6）加入二氨基苯基吲哚 （DAPI） 負(fù)染 （counterstain） ，在熒光顯微鏡下觀察。 2、FISH 技術(shù)在 PGD 中的應(yīng)用 1） 胚胎性別的鑒定，排除性連鎖疾病的發(fā)生。對于X連鎖隱性遺傳病，通過FISH技術(shù) 鑒定性別 ,防止后代相應(yīng)遺傳病的發(fā)生。 2）染色體疾病包括數(shù)目和結(jié)構(gòu)的畸變。 3、FISH技術(shù)在PGD的應(yīng)用中還存在一些亟待解決的問題 1）受DNA探針熒光素染料的限制，每個(gè)卵裂球只能用25個(gè)探針分析染色體，限制了

8、 染色體數(shù)目的分析。 2）FISH技術(shù)進(jìn)行PGD時(shí)受時(shí)間和卵裂球數(shù)目的限制,用單卵裂球進(jìn)行F ISH 時(shí)，3%的卵裂球會(huì)沒有信號及出現(xiàn)5%的錯(cuò)誤結(jié)果。 3）FISH技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件要求較高，操作過程中的任何一個(gè)小的失誤均可導(dǎo)致嚴(yán)重 的臨床后果。 采用單細(xì)胞快速制備中期染色體的方法， 結(jié)合多種 FISH 技術(shù)，如多重雜交 FISH 技術(shù)、 光譜核型分析、比較基因組雜交等，大大地提高了 PGD 檢測的準(zhǔn)確性和有效性。 比較基因組雜交 （comparative genomic hybridigation，CGH） 是一種與 FISH 相關(guān)的技術(shù)。 將 來自待測標(biāo)本的 DNA 用綠色熒光標(biāo)記， 來自原來

9、已測的正常核型的 DNA 用紅色熒光標(biāo)記。 這兩組 DNA 同時(shí)與一個(gè)玻片上的正常中期染色體雜交。若樣本中無染色體不平衡（如綠色 DNA 與紅色 DNA 核型相同） ，兩種顏色的 DNA 片段平等地競爭染色體上的雜交位點(diǎn)。紅 色、綠色 DNA 等量雜交產(chǎn)生黃色，但若測試樣本中含有多余的染色體，如21 三體，這條 染色體的綠色 DNA 片段多于紅色，這種效果可產(chǎn)生微綠的顏色，相反，若測試樣本中染色 體缺失，這條染色體的紅色 DNA 片段多于綠色，就產(chǎn)生微紅的顏色。復(fù)雜的計(jì)算機(jī)分析軟 件可計(jì)算每條染色體全長紅：綠的精確比率。 CGH 還可測出易位攜帶者。 CGH 應(yīng)用于 PGD 的主要障礙是 DN

10、A 的量。多數(shù)方法要求 100ng-1ugDNA ，這是超過 10000 個(gè)細(xì)胞的 DNA 量。 PGD 只有 1-2 個(gè)細(xì)胞，用于 CGH 前需要整個(gè)基因組擴(kuò)增。 CGH 最近成功地應(yīng)用在卵裂球檢測。 (二 ) 聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) PCR技術(shù)主要應(yīng)用于性別和單基因遺傳病的診斷。1990年,Handyside等采用PCR技 術(shù)擴(kuò)增Y染色體特異重復(fù)序列(DYZ I ),對胚胎進(jìn)行性別診斷，植入女性胚胎,避免了有高?？?能X染色體連鎖疾病的發(fā)生，開創(chuàng)PGD應(yīng)用于人類的先河，并采用此技術(shù)，促使了幾個(gè)健康 女嬰的出生。 從原理上講， 只要已知某種致病基因， 通過合適的引物可將其由單拷貝放大而 檢

11、測出來。 1 、 PCR 過程 擴(kuò)增Y染色體特異性序列，根據(jù)片段的存在與否判斷胚胎性別； (2)擴(kuò)增目的基因后，結(jié)合RFLP、SSCP、DGGE、分子雜交及DNA測序等方 法分析擴(kuò)增產(chǎn)物 ； 采用等位基因特異性PCR(allele specific PCR，ASPCR )，即將突變的堿基設(shè)計(jì)在 3端的引物和正常序列引物分別在兩個(gè)擴(kuò)增體系里進(jìn)行擴(kuò)增，也可以將引物標(biāo)記 ，混合在一起 然后再在同一擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，只有引物與模板互補(bǔ) ，才能出現(xiàn)明顯擴(kuò)增帶 ，此法已用于囊 性纖維增生癥 F 508突變的PGD診斷； (4)對基因缺失型遺傳病 ，在缺失的基因序列內(nèi)設(shè)計(jì)適宜的引物 ，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物存在與否

12、判斷該基因是否缺失 ； 對長片段基因缺失的遺傳病，如a地中海貧血，在缺失的DNA片段前后設(shè)計(jì)一引物 ， 由于PCR擴(kuò)增片段長度有限，若擴(kuò)增后出現(xiàn)擴(kuò)增帶，則診斷為基因缺失。 2、存在問題及解決方法 (1) ADO現(xiàn)象1991年Navidi和Arnheim等首先報(bào)道了ADO現(xiàn)象， 即突變的等位基因可能未擴(kuò)增出來或含有 2 種不同基因突變的隱性遺傳病 ，只有一種突變擴(kuò) 增出來，從而造成誤診。針對ADO現(xiàn)象，許多學(xué)者提出了不少方法：胚胎活檢時(shí)取 2個(gè)細(xì)胞, 提高PCR變性溫度，使模板盡量完全裂解，還有上述采用的熒光PCR或多重PCR等，將 連鎖多態(tài)標(biāo)記同時(shí)應(yīng)用于基因突變分析，表明單細(xì)胞多重PCR進(jìn)行P

13、GD診斷可靠性為 98%。 (2) 嵌合型現(xiàn)象及多核細(xì)胞現(xiàn)象45, X和47,XXY是女性及男性最常見的染色體畸 變之一，因?yàn)榍逗象w的存在，單純進(jìn)行PCR擴(kuò)增Y染色體片段可能致假陰性Ealaki er等報(bào)道,15%質(zhì)量好的胚胎有1個(gè)以上多核細(xì)胞,2細(xì)胞期多核細(xì)胞為 67.0%,4細(xì)胞期為 25.0%。若活檢的細(xì)胞正好是異常的 ，則可能造成誤診。因此由于受診斷取材的限制，PCR 對單個(gè)細(xì)胞診斷性別或染色體病時(shí),應(yīng)考慮嵌合型現(xiàn)象及多核細(xì)胞現(xiàn)象所造成的誤診。 （3）污染問題 由于PCR敏感性高，模板量少（通常為單細(xì)胞）的擴(kuò)增體系極易污染。 試劑和外界環(huán)境物質(zhì)所致的污染可通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑囼?yàn)操作得以避免。對

14、可能包含精子、 顆粒細(xì) 胞等可經(jīng)反復(fù)清洗活檢前胚胎和多次更換吸管得到避免，而且目前采用ICSI的方法 ，此種 污染較少發(fā)生。母體來源的細(xì)胞可用多重PCR或同時(shí)檢測胎兒及其父母的DNA指紋加以 鑒別。 六、應(yīng)用現(xiàn)狀 1990年，Handyside首次報(bào)道用 PCR技術(shù)使一對有高風(fēng)險(xiǎn)生育X性連鎖疾病進(jìn)行性肌 營養(yǎng)不良 （DMD） 患者的夫婦分娩一名健康女嬰。隨后，他們又引入巢式 PCR 技術(shù)用于單基 因病PGD。1992年，成功地對囊性纖維化病變（CF）進(jìn)行了植入前診斷，并分娩了正常嬰兒。 此后， PGD 在世界范圍內(nèi)蓬勃發(fā)展。 PGD 嬰兒與 ICSI 的嬰兒相比，新生兒問題或畸形發(fā)生率都不高。

15、與常規(guī) ICSI 分娩的 1987個(gè)嬰兒的情況非常相似， PGD 分娩的 162個(gè)嬰兒中單胎占 54%、雙胎 41%、三胎 5%。 其他指標(biāo)，如出生體重、身長、頭圍兩組也很相似，主要的異常發(fā)生率（2.3%）亦與 ICSI 組 2.9%非常接近。 七、存在的問題 （一）單細(xì)胞遺傳學(xué)分析診斷的準(zhǔn)確性和可靠性。 （二）PGD的費(fèi)用較高。 （三）倫理、法律和社會(huì)學(xué)問題。 八、展望 人類基因組計(jì)劃研究的進(jìn)展、 DNA 診斷分析技術(shù)以及其他技術(shù)的不斷發(fā)展促進(jìn)了 PGD 技術(shù)迅猛發(fā)展。 迄今有 1000 多種遺傳病的基因被定位， 隨著人類基因組計(jì)劃 （human genome program, HGP）工作的進(jìn)展，人類所攜帶的10萬對基因密碼將被破譯