細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作基本流程

1、共享知識(shí)分享快樂 盛年不重來，一日難再晨。及時(shí)宜自勉，歲月不待人。 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作基本流程 （基于明確的細(xì)胞試驗(yàn)計(jì)劃） 1. 實(shí)驗(yàn)物品準(zhǔn)備 1.1實(shí)驗(yàn)耗材準(zhǔn)備 書面準(zhǔn)備：明確列出使用物品名稱、數(shù)量，報(bào)請(qǐng)老師批準(zhǔn)。 操作準(zhǔn)備：物品清洗、干燥、打包滅菌、合理放置。 1.2實(shí)驗(yàn)試劑準(zhǔn)備 書面準(zhǔn)備：明確列出使用物品名稱、數(shù)量，報(bào)請(qǐng)老師批準(zhǔn)。 操作準(zhǔn)備：選擇合適的物品存放地點(diǎn)；使用前集中放置；需要配制的試劑根 據(jù)有無滅菌需要提前配好；需要無菌配制的試劑在無菌操作要求下配制。 2. 實(shí)驗(yàn)預(yù)約 2.1操作預(yù)約：401室在預(yù)約本上登記；分析測(cè)試中心向屈老師交申請(qǐng)單后在預(yù) 約本上登記。 2.2細(xì)胞凍存復(fù)蘇預(yù)約：每

2、周定時(shí)開放液氮罐，由負(fù)責(zé)同學(xué)在群里通知。 2.3細(xì)胞檢測(cè)預(yù)約：填寫申請(qǐng)單，向主管老師申請(qǐng)。 3. 細(xì)胞房環(huán)境檢查 3.1清潔消毒：操作前后有無清潔臺(tái)面、地面，并行紫外線殺菌10-15分鐘。 3.2儀器設(shè)備：運(yùn)行是否正常，有無燈光閃爍報(bào)警或標(biāo)志警示，有無異常狀況。 3.3臺(tái)面：是否潔凈無污垢，有無多余物品放置，必要物品是否放置齊備。 4. 清潔準(zhǔn)備 4.1洗手：肥皂洗一一5%。新潔爾滅泡手10秒一一70%酒精噴手 4.2臺(tái)面物品放置：正中：酒精燈；左側(cè)：吸管及其他耗材盒子；右側(cè)：試管架、 大鑷子、酒精棉球瓶、打火機(jī)、移液器；左上方：試劑瓶；右上方：廢液缸 5. 實(shí)驗(yàn)操作 5.1基本操作：換液、傳

3、代、凍存、接板、復(fù)蘇、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞觀察 5.2垃圾處理：培養(yǎng)基、緩沖液等使用過的無害廢液用廢液缸裝；固體垃圾丟入 垃圾筐中 卑微如！蟻堅(jiān)強(qiáng)大象 共享知說分享快樂 6. 實(shí)驗(yàn)善后 6.1可回收實(shí)驗(yàn)耗材處理：吸管、試管、離心管等可反復(fù)使用的耗材按標(biāo)準(zhǔn)流程 清洗。 6.2不可回收實(shí)驗(yàn)廢物處理 621酸堿類廢液分類倒入廢液瓶存放，由學(xué)院通知處理 6.2.2無害廢液棄入水槽，大量流水沖洗 6.2.3固體垃圾放入垃圾袋，丟入垃圾桶 6.3種子細(xì)胞處理：實(shí)驗(yàn)過程中需要保種或?qū)嶒?yàn)完成后仍有未用完的種子細(xì)胞， 按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行細(xì)胞凍存，以待后續(xù)使用。 6.4實(shí)驗(yàn)試劑處理：未用完的試劑重新放回合適的存放地點(diǎn)； 如

4、試劑污染或變質(zhì), 按實(shí)驗(yàn)廢物處理。 6.5報(bào)備：耗材、試劑如需補(bǔ)充，需要向老師申請(qǐng)批準(zhǔn)購買；儀器設(shè)備如有損壞， 需要告知負(fù)責(zé)同學(xué)或老師進(jìn)行維修。 7. 清潔值周和安全檢查 7.1清潔值周：輪流進(jìn)行，以導(dǎo)師分組，每日例行清潔和周二、周五大掃除，需 要按要求進(jìn)行清潔并在值周表上登記及拍照。 7.2安全檢查：清潔值周的同時(shí)需要每天巡視細(xì)胞房、準(zhǔn)備間內(nèi)的電器設(shè)備，有 情況需要及時(shí)上報(bào)。 注意事項(xiàng)： 1、試驗(yàn)計(jì)劃三原則：要做什么、為什么這么做、準(zhǔn)備怎么做 2、實(shí)驗(yàn)操作三原則：多看、多問、多想 3、突發(fā)事件處理：及時(shí)向負(fù)責(zé)同學(xué)、老師匯報(bào)情況 細(xì)胞操作相關(guān)儀器設(shè)備使用 恒溫干燥箱使用注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng) 共享

5、知識(shí)分享快樂 （一）干燥箱恒溫干燥時(shí)恒溫室下方的散熱板上，不能放置物品，以免烤壞 物品或引起燃燒。 （二）放入箱內(nèi)的物品不應(yīng)過多、過擠。 （三）嚴(yán)禁把易燃、易爆、易揮發(fā)的物品放入箱內(nèi)，以免發(fā)生事故。 （四）如果發(fā)現(xiàn)干燥箱箱門下方紅燈報(bào)警必須盡快切斷電源。 （五）放置物品干燥時(shí)間不超過24小時(shí)。 二氧化碳培養(yǎng)箱使用 箱門應(yīng)輕開輕閉，避免粗暴開關(guān)。取出細(xì)胞時(shí)應(yīng)避免箱門長(zhǎng)時(shí)間敞開，以免培 養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境不穩(wěn)定，孵箱中的水盆應(yīng)定期（每 2周左右）更換無菌雙蒸水，并 擦洗水盆，紫外照射30分鐘。 二氧化碳?xì)馄扛鼡Q 先關(guān)閉總閥和分壓閥，更換后先開總閥，再慢慢調(diào)整分壓閥，指針總閥在5分 鐘左右，分壓閥指針在0.

6、15左右。 超凈臺(tái)使用 使用超凈臺(tái)工作15分鐘前開紫外燈進(jìn)行照射滅菌，在進(jìn)入操作之前應(yīng)關(guān)掉紫外 燈，10分鐘左右后進(jìn)入。超凈臺(tái)上力求簡(jiǎn)潔，以利于保持無菌狀態(tài)，每一步操 作均應(yīng)用酒精擦拭，不宜對(duì)著超凈臺(tái)說話。 倒置相差顯微鏡使用 分為3點(diǎn)： 1. 相差裝置的調(diào)換與安裝。卸下普通顯微鏡使用的聚光器，將環(huán)狀光闌裝在聚 光器支架上，把綠色濾光片放在上面，它可以吸收紅色和藍(lán)色光，使波長(zhǎng)范 圍小的單色光線進(jìn)行照明，并有吸熱作用，能使相差觀察獲得良好的效果。 再從轉(zhuǎn)換器上旋下普通物鏡，換上相差物鏡。 2. 調(diào)焦。打開光源，旋轉(zhuǎn)激光器裝盤將 “ o對(duì)準(zhǔn)標(biāo)示孔，使普通聚光器部分進(jìn)進(jìn) 光路。先使用低倍相差物鏡，按

7、普通顯微鏡操縱方法進(jìn)行對(duì)光和調(diào)焦。旋轉(zhuǎn) 環(huán)狀光闌，使光闌的直徑和孔寬與所使用的相差物鏡相適應(yīng)。 3. 合鈾調(diào)整。拔出目鏡，插進(jìn)合鈾看遠(yuǎn)鏡，一邊從看遠(yuǎn)鏡內(nèi)內(nèi)觀察，并用左手 固定其外筒；一邊用右手轉(zhuǎn)動(dòng)看遠(yuǎn)鏡內(nèi)筒使其下降，當(dāng)對(duì)準(zhǔn)焦點(diǎn)就能看到環(huán) 狀光闌的亮環(huán)和相板的黑環(huán)，此時(shí)可將看遠(yuǎn)鏡固定住。再升降集光器并調(diào)節(jié) 其下的螺旋使亮環(huán)的大小與黑環(huán)一致，然后左右前后調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌聚光器上 的調(diào)節(jié)鈕，使兩環(huán)完全重合，如亮環(huán)比黑環(huán)小而位于內(nèi)側(cè)時(shí)，應(yīng)降低集光器 使亮環(huán)放大；反之，則應(yīng)升咼聚光器，使亮環(huán)縮小。如若升到最咼限度仍不 能完全重合，則可能是載玻片過厚之故，應(yīng)更換。合抽調(diào)整完畢，抽出看遠(yuǎn) 鏡，換回目鏡，按常規(guī)要

8、領(lǐng)進(jìn)行觀察。在更換不同倍率的相差物鏡時(shí)，每一 次都要使用相匹配的環(huán)狀光闌和重新合抽調(diào)整。使用油鏡時(shí)，集光器上透鏡 表面與載玻片之間要同時(shí)加上香柏油。 低速離心機(jī)使用 將需要離心的樣品對(duì)稱放入離心機(jī)內(nèi)，關(guān)好蓋子，接上電源，調(diào)整轉(zhuǎn)速和運(yùn)轉(zhuǎn) 時(shí)間，按離心鍵。待轉(zhuǎn)速降至 0000后，打開蓋子，取出樣品。 傳遞窗使用 每扇門旁設(shè)面板一塊，面板有一只LED顯示燈，一只開門按鈕和一只殺菌燈開 關(guān)。顯示燈為綠色時(shí)，為開門指示燈，滅表示對(duì)面的門衛(wèi)開狀態(tài)，禁止此門打 開，按開門按鈕無法打開門。亮表示允許開門，按開門按鈕，門鎖打開，開門 傳遞物件。殺菌開關(guān)可以控制箱內(nèi)的殺菌燈的亮和滅。 酸缸、酸筒使用 酸缸分為內(nèi)缸

9、和外缸，外缸里面放液體，內(nèi)缸里面放要清洗的器皿，浸泡結(jié)束 后，將內(nèi)缸向上提出，內(nèi)缸上面有很多的小孔，液體從內(nèi)缸體小孔流出，取出 物品，蓋上蓋子。 移液器使用 一、標(biāo)準(zhǔn)操作 適用的液體：水、緩沖液、稀釋的鹽溶液和酸堿溶液。 1）按到第一檔，垂直進(jìn)入液面 3-5毫米。 2）緩慢松開控制按鈕，否則液體進(jìn)入吸頭過速會(huì)導(dǎo)致液體倒吸人移液器內(nèi)部吸人 體積減少。 3）打出液體時(shí)貼壁并有一定角度，先按到第一檔，稍微停頓1s后，待剩余液體 聚集后，再按到第二檔將剩余液體全部壓出。 二、黏稠或易揮發(fā)液體的移取 在移取黏稠或易揮發(fā)的液體時(shí)，很容易導(dǎo)致體積誤差較大。為了提高移液準(zhǔn)確 性，建議采取以下方法： 1）移液前

10、先用液體預(yù)濕吸頭內(nèi)部， 即反復(fù)吸打液體幾次使吸頭預(yù)濕， 吸液或排出 液體時(shí)最好多停留幾秒。尤其對(duì)于移取體積大的液體（如10001），建議將吸頭預(yù) 濕后再移取。 2）采用反相移液法：吸液時(shí)按到第二檔，慢慢松開控制按鈕，打液時(shí)按到第二檔， 部分液體殘留在吸頭內(nèi)。 微量移液器使用 使用方法同移液器的使用。 細(xì)胞計(jì)數(shù)板使用 分3點(diǎn)： 將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。 將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置 卑微如婕蟻豎劉以大象 共享知說分享快樂 3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。 計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)算左側(cè)和上方的。然后

11、按照公式計(jì)算： 細(xì)胞數(shù)/ml=四大格細(xì)胞總數(shù)14* ? 咼壓火菌鍋使用 分為6點(diǎn)： 1. 首先將內(nèi)層滅菌筒取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相 平為宜。 2. 放回滅菌筒，并裝入待滅菌物品。 3. 加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌筒的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方 式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。 4. 用電爐或煤氣加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待 冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。 當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。 5. 滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下

12、降，壓力 降為0時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物體。 6. 將取出的滅菌培養(yǎng)基放入 37C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，經(jīng)檢驗(yàn)無雜菌生 長(zhǎng)，即可待用。 酶標(biāo)儀使用 冰箱使用 冰箱中試劑藥品分類放置，關(guān)閉冰箱時(shí)檢查是否關(guān)好。 液氮罐使用 使用前，檢查容器內(nèi)部是否清潔干燥，充液氮前要用少量液氮預(yù)冷。不能在容 器蓋上放置物體和密封頸口，放進(jìn)或取出冷凍物品時(shí)，要盡量使罐口打開時(shí)間 短，以減少液氮消耗，也不要把提桶完全提出來。嚴(yán)防沖擊和碰撞。嚴(yán)謹(jǐn)用硬 物清除頸管內(nèi)的凍霜，以免損傷頸管。 超低溫冰箱使用 1. 一般制冷溫度設(shè)置為-60度，過濾網(wǎng)每個(gè)月必須清洗一次。 2. 存取樣品時(shí)門開得不要過大，存取時(shí)間盡量要短。 3. 注意經(jīng)常要存取的樣品放在上面兩層，需要長(zhǎng)期保存不經(jīng)常存取的樣品放在 下面兩層，保證開門時(shí)冷氣不過度損耗。 4. 定期除霜。 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基本液體配制 培養(yǎng)基配制 PBS配制 成分配比為：1% （w/v