總大腸菌群數量測定

1、總大腸菌群在飲用水的微生物安全監(jiān)測中，普遍采用正常的腸道細菌作為糞便污染指 標，而不是直接測定腸道致病菌?？偞竽c菌群系指一群需氧及兼性厭氧的，在37C生長時能使乳糖發(fā)酵，在24h 內產酸產氣的革氏陰性無芽胞桿菌?？偞竽c菌群系指每升水樣中所含有的總 大腸菌群的數目?？偞竽c菌群可用多管發(fā)酵法或濾膜法檢驗。一多管發(fā)酵法1 應用范圍1.1 本法適用于飲用水、水源水，特別是渾濁度含量高的水質中總大腸菌群 的測定。1.2 水樣中總大腸菌群數的含量，表明水被糞便污染程度，而且間接地表明 有腸道致病菌存在。2 原理根據總大腸菌群應具有的生物特性，產氣，能在選擇性培養(yǎng)基上產生典型菌落。3 儀器3.1xx3.2

2、革蘭氏染色用有關器材。3.3 高壓蒸汽滅菌器。3.4 干熱滅菌箱。3.5 恒溫箱。3.6 冰箱。3.7 放大鏡。3.8 試管、平皿（直徑4 培養(yǎng)基4.1 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液4.1.1 成分 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g 氯化鈉 5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 蒸餾水 1000ml4.1.2 制法 將蛋白胨、牛肉膏、 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，滅菌20min，貯存于冷暗處備用。4.2 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液 按上述乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制。4.3 品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（供多管發(fā)酵法用）4.3. 1 成分蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氫二鉀3. 5gxx1530g蒸餾水 1000ml

3、無水亞硫酸鈉 5g 左右5%堿性品紅乙醇溶液4.3. 2 儲備培養(yǎng)基的制備如革蘭氏陰性無芽胞桿菌，9cm）、刻度吸管等，置于干熱滅菌箱中1ml1000ml 蒸餾水中加熱溶解，充分混勻，分裝于裝有倒管的試管中，在37C24h內能發(fā)酵乳糖并產酸160C滅菌2h調整 pH 為7.27.4，再加入1ml置高壓蒸汽滅菌器中，以115C乳糖及氯化鈉置于20ml先將瓊脂加至 900 蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀及蛋白胨，混勻使之溶解，再以蒸餾水補足至 1000ml，調整PH值為7.27.4 ，趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入乳糖，混勻后定量分裝于燒瓶內， 置高壓蒸汽滅菌中以115C滅菌20min，貯

4、存于冷暗處備用。4.3.3 平皿培養(yǎng)基的配制將上法制備的儲備培養(yǎng)基加熱融化，根據燒瓶內培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸 管按比例吸取一定量的 5%堿性品紅乙醇溶液，置于滅菌空試管中。再按比例稱 取所需的無水亞硫酸鈉置于另一個滅菌空試管內，加滅菌水少許使其溶解后， 置于沸水浴中煮沸 10min 以滅菌。用滅菌吸管吸取已滅菌的嚴硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液內至深 紅色褪成淡粉紅色為止。將此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加入已融化的 儲備培養(yǎng)基內，并充分混勻（防止產生氣泡），立即將此種培養(yǎng)基適量傾入于 已滅菌的空平皿內，待其冷卻凝固后置冰箱內備用。此種已制成的培養(yǎng)基于冰 箱內保存不宜超過二周，如培養(yǎng)基已

5、由淡紅色變成深紅色，則不能再用。4.4 伊紅美藍培養(yǎng)基4.4. 1 成分蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氫二鉀 2gxx2030g蒸餾水 1000ml2%伊紅水溶液 20ml0.5 %美藍水溶液 13ml4.4. 2 儲備培養(yǎng)基的制備先將瓊脂加至 900ml 蒸餾水，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀及蛋白胨， 混勻使之溶解，再以蒸餾水補足至 1000ml，調整PH為7.27.4 。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入乳糖，混勻后定量分裝于燒瓶內， 置高壓蒸汽滅菌器內以115C滅菌20min，貯存于冷暗處備用。4.4. 3 平皿培養(yǎng)基的制備將上法制備的儲備培養(yǎng)基加熱融化，根據燒瓶內培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸 管

6、按比例吸取一定量已滅菌的 2%伊紅水溶液及一定量已滅菌的0.5%美藍水溶液，加入已融化的儲備瓊脂內，充分混勻（防止產生氣泡） 立即將此種培養(yǎng)基適量傾入于已滅菌和空平皿內，待其冷卻凝固后置冰箱內備 用。5 步驟5.1 生活飲用水5.1. 1 初發(fā)酵試驗：在 2 個各裝有已滅菌 50ml 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（瓶中（內有倒管）內，以無菌操作各加入水樣100ml;在10支裝有已滅菌胨培養(yǎng)液的試管中（內有倒管），以無菌操作各加入水樣10ml，混勻后置于24h。5.1.2 平板分離：經培養(yǎng) 24h 后，將產酸產氣及只產酸的發(fā)酵管，分別接種于品紅亞硫酸鈉 培養(yǎng)基或伊紅美藍培養(yǎng)基上，再置于 37 C恒溫

7、箱內培養(yǎng)1824h,挑選符合下列 特征的菌落，取菌落的一小部分進行涂片、革蘭氏試驗、鏡檢。品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上的菌落：xx,具有金屬光澤的菌落。深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落。淡紅色,中心色較深的菌落。伊紅美藍培養(yǎng)基上的菌落：xxxx，具有金屬光澤的菌落。XX,不帶或略帶金屬光澤的菌落。淡XX,中心色較深的菌落。并4.2）的大試管或燒5ml三倍濃縮乳糖蛋白37C恒溫箱內培養(yǎng)5. 1 .3復發(fā)酵試驗：上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽胞桿菌,則挑取該菌落的另一部 分再接種于普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中（內有倒管）,每管可接種分離自同 一初發(fā)酵管的最典型的菌落13個，然后置于37C恒溫箱中培養(yǎng)2

8、4h,有產酸 產氣者（不論倒管內氣體多少皆作為產氣論）,即證實有總大腸菌群存在。5.1.4 根據證實有總大腸菌群存在的陽性管（瓶）數查表1，報告每升水樣中的總大腸菌群數。表 1 總大腸菌群數檢數表（接種水樣總量 300ml100ml 2份， 10ml 10份）100ml 水量的陽性 012管（瓶）數10ml 水量的陽性管數每升水樣中每升水樣中總大腸菌群數總大腸菌群數 0 v 18371327040692305.2 水源水5.2.1 將水樣作 1 ：10 稀釋。5.2.2 于各裝有 5ml 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（4.2）的 5 個試管中（內有倒管），各加入水樣；于各裝有10ml 乳糖蛋白胨培養(yǎng)液（4.1 ）的 5 個試管中（內有倒管），各加入 1ml 水樣，于各裝有 10ml 乳糖 蛋白胨培養(yǎng)液（4.1）的 5 個試管中（內有倒管），各加入 1ml1：10 稀釋水樣。共計 15 管，三個稀釋度