試劑與培養(yǎng)基配方

1、PDA培養(yǎng)基馬鈴薯去皮200 g ,切成小塊，加水煮爛，紗布過(guò)濾，加入15 g葡萄糖加熱，加瓊 脂20 g ,繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，攪拌均勻，稍冷卻后補(bǔ)純水定容至 1000 m L , 121 C高壓滅菌20 min,室溫保存。0. 5 M Tris-Cl ( PH 8. 0 )Tris 30. 25 g ,純水400 m L,先加入8 m L濃鹽酸，待溶液冷卻至室溫后再緩慢加入濃鹽酸直至PH值到8.0,加純水定容至500 m L ,121 C高壓滅菌20 min ,4 C保存。0. 5 M Tris-Cl ( PH 7. 0 )Tris 30. 25 g ,純水400 m L，濃

2、鹽酸20 m L ,冷卻至室溫后緩慢加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值到7.0,加純水定容到500 m L, 121 C高壓滅菌20 min , 4C保存。0. 5 M EDTA ( PH 8. 0 )EDTANa2- 2H20 93. 06 g,純水 400 m L , Na 0H 10 g,再用 Na 0H 溶液緩慢調(diào)節(jié)PH值到8.0,加純水定容至500 m L, 121 C高壓滅菌20 min , 4C保存。TE緩沖液配方0. 5 M Tris-Cl ( PH8. 0 ) 10 m L ,0. 5 M EDTA ( PH8. 0 ) 1 m L ,加純水定容至500 m L, 121 C 高壓滅菌 2

3、0 min, 4C 保存。CTAB抽提液CTAB 20 g ,0. 5M Tris-Cl ( PH8. 0 ) 200 m L0. 5 M EDTA ( PH 8. 0 ) 40 m L,Na Cl 81.8 g ,加純水定容至1 L , 121 C高壓滅菌20 min,室溫保存。3 M醋酸鈉(PH 5. 2)Na Ac 3H20 40. 8g,純水70 m L,溶解后加入冰醋酸調(diào)節(jié)p H值至5.2 ,加純水定容至100 m L, 121 C高壓滅菌20 min , 4C保存。RNase (10 mg/ml)配方RNA酶100 mg, TE 10 m L,沸水浴20 min,分裝于2 m L離

4、心管-20 C保存。TB3培養(yǎng)基Yeast Extract 3 g,酸水解酪蛋白3 g,蔗糖200 g,補(bǔ)純水定容至1 L, 121C高壓滅菌20 min , 4C 保存。STC buffer蔗糖 100 g , 0. 5 M Tris-Cl ( PH 8. 0 ) 50 m L , Ca C12 2H20 3. 6755 g,補(bǔ) 純水定容至500 m L, 121 C高壓滅菌20 min , 4C保存。PTC PEG 8000 40 g,補(bǔ)STC 溶液到100 m L,溶解后用細(xì)菌過(guò)濾器除菌過(guò)濾，4C保存。1.2 M KC1 溶液稱量KCI固體89.46 g并補(bǔ)水到1 L,溶解后121 C高

5、壓滅菌20 min , 4C保存。Bottom Agar 和I Top AgarYeast Extract 3 g ,酸水解酪蛋白 3 g ,蔗糖 200 g ,補(bǔ)水到 1 L , Bottom Agar 和Top Agar加入瓊脂的量分別為10 g/L和15 g/L , 121 C高壓滅菌20min ,室溫保 存。酶解液稱取崩潰酶 0.5 g,溶壁酶 0. 1 g , 20 m LI. 2 mol/L KCI , 30C, 90 rpm 震蕩培養(yǎng) 30 min,離心3500 rpm , 10 min,用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，4C保存。2. 5 M HC186. 2 m L HC1 ,用超純水定容至

6、400 m L。變性液Na Cl 87. 6 g , Na OH 20 g,加超純水定容至 1000 m L , 121 C 滅菌 20 min。中和液(p H 7.6 )Tris 60. 57 g , Na Cl 87.6 g，加入約800 m L的超純水，用濃HC1調(diào)節(jié)p H至76, 加超純水定容至1000 m L , 121 C滅菌20 min。20 X SSC ( p H 7. 0 )二水合檸檬酸鈉88.2 g, Na Cl 175.3 g,加入約800 mL的超純水，用濃HCI調(diào)節(jié)p H 至7.6,加超純水定容至1000 m L , 121 C滅菌20 min。轉(zhuǎn)膜時(shí)需要 用超純水稀

7、釋成 lOXSSCo5 X SSC量取250 m L 20 X SSC,用超純水定容至1000 m L。0. 5 X SSC, 0. 1% SDS量取100 m L 5 X SSC,用超純水定容至1000 m L,然后加入05 g SDS,充分 混勻。雜交緩沖液將64 m L超純水分兩次緩慢加入地高辛雜交顆粒（7號(hào)瓶）中，在37 C條件下攪拌至緩沖液完全澄清。馬來(lái)酸緩沖液稱取馬來(lái)酸116 g , Na Cl 8. 76 g ,加入800 m L純水中，用Na 0H （固體）調(diào)節(jié)p H 至 7.5 （20 C）,定容至 1000 m L , 121 C 滅菌 20 min。洗滌緩沖液稱取馬來(lái)酸1

8、16 g , Na Cl 8. 76 g ,加入800 m L純水中，用Na OH (固體)調(diào) 節(jié) p H 至 7. 5 ( 20 C ),然后加入 3 mLTween20,定容至 1000 mL, 121 C滅菌20 min。檢測(cè)緩沖液稱取 Na Cl 5.844 g , Tris 12. 114 g ,溶解于 800 m L 純水中，用 2. 5 M HC1 調(diào) 節(jié) p H 至 9. 5 ( 20 C ),定容至 1000 m L , 121 C 滅菌 20 min。封阻溶液用1:10的比例用馬來(lái)酸緩沖液將10 X封阻液(6號(hào)管)稀釋成1 X工作溶液?？贵w溶液每次使用之前將原始管中的ant

9、i-digoxigenin-AP ( 4號(hào)管)1000 rpm離心3min,從表面小心吸取所需用量，用封阻液按1:5000 ( 150 m U/m L )的比例稀 釋。YPDYeast Extract 10 g、Peptone 20 g Agar 20 g、定容至 900 ml , 121 C 滅菌 20 min后，再加入100 m L單獨(dú)滅菌的20 %的Dextrose。PEG 4000 ( 50 % W/V )4CPEG 4000 25 g,補(bǔ)純水到50 m L , 65C水浴鍋加速溶解，細(xì)菌過(guò)濾器除菌后,保存。1 M Li AcLi Ac 10. 2 g ,加水到100 m L,細(xì)菌過(guò)濾器除菌后，4C保存鮭魚(yú)精 DNA ( 2 mg/ml )鮭魚(yú)精DNA 2 mg,加TE 緩沖液至10 m L,振蕩溶解后用注射器劇烈抽吸30-40次，沸水浴20 min后馬上置于冰上降溫，分裝100 口 L到1. 5 m L離心 管中-80C保存。SD-Trp培養(yǎng)基無(wú)氨基氮源(含硫胺酸)67 g ,細(xì)菌級(jí)