基因芯片檢測(cè)大鼠心肌頓抑相關(guān)基因的差異表達(dá)及左心室注射地爾硫卓對(duì)頓抑心肌功能的影響

1、基因芯片檢測(cè)大鼠心肌頓抑相關(guān)基因的差異表達(dá)及左心室注射地爾硫卓對(duì)頓抑心肌功能的影響心肌頓抑是一種常見的臨床現(xiàn)象 ,1975 年 Heyndrickx 等首次描述了這種心 肌缺血后收縮功能障礙延遲恢復(fù)的現(xiàn)象 ,1982 年 Braunwald 等明確提出心肌頓抑 的概念。開始僅僅認(rèn)為心肌頓抑是一種實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)象未引起重視 , 但在二十世紀(jì)九 十年代之后 , 缺血性心臟病人通過各種方式可以獲得冠狀動(dòng)脈的再通 , 因此對(duì)這 種現(xiàn)象的研究成為熱點(diǎn)。多年來人們選擇不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及方法對(duì)其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探討 , 但機(jī)制仍不 清楚, 主要的機(jī)制認(rèn)為與氧自由基、肌鈣蛋白降解及鈣假說有關(guān)。早有大量研究 證明缺血再灌注

2、可以誘導(dǎo)基因表達(dá)的改變 , 而這種改變正是心肌頓抑的分子學(xué)基 礎(chǔ)。了解心肌頓抑時(shí)有哪些基因的表達(dá)改變 , 不僅可以揭示缺血再灌注所導(dǎo)致的 心肌頓抑的分子學(xué)機(jī)制 , 還可以通過靶目標(biāo)基因的基因治療抑制心肌頓抑的機(jī)械 功能障礙而發(fā)揮心肌頓抑自我修復(fù)功能 , 這可能是今后缺血性心臟病治療的突破 口。雖然有各種針對(duì)心肌頓抑的基因表達(dá)改變的研究 , 但往往局限于幾個(gè)或數(shù)十 個(gè),對(duì)大量基因表達(dá)改變的研究需要新的方法學(xué) , 基因芯片是伴隨著人類基因組 計(jì)劃發(fā)展起來的一項(xiàng)高通量篩選技術(shù) , 它能在同一實(shí)驗(yàn)條件下同時(shí)篩檢數(shù)以千萬 計(jì)的基因的差異表達(dá) , 因此, 基因芯片技術(shù)的高效性和可靠性為研究心肌頓抑相 關(guān)基

3、因的表達(dá)變化提供了新的技術(shù)手段。心肌頓抑的特點(diǎn)在于其潛在的可恢復(fù)性 , 因此有人認(rèn)為治療一個(gè)可能自我痊 愈的病理生路過程沒有必要。但研究證明反復(fù)的心肌頓抑可以引起心肌冬眠 , 并 從而導(dǎo)致心力衰竭 , 因此及時(shí)有效地治療心肌頓抑對(duì)預(yù)防慢性心力衰竭的形成和發(fā)展是有重大意義的多數(shù)研究已經(jīng)證實(shí) , 再灌注時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心肌頓抑的主要原因。目前 , 預(yù)防細(xì)胞內(nèi)鈣超載的有效藥物之一是鈣拮抗劑。地爾硫卓是一類能選擇性地阻滯 Ca2+v/sup細(xì)胞膜上慢鈣通道進(jìn) 入細(xì)胞內(nèi)的藥物，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+v/sup度，另外，地爾硫卓作為鈣拮抗 劑可作用于外周血管平滑肌使血管舒張 ,降低血管阻力 ,減輕后負(fù)荷, 使

4、心輸出量 增加, 心肌的氧耗減少 , 減輕心肌頓抑。因此鈣離子拮抗劑有望逆轉(zhuǎn)這種異常從而 治療心肌頓抑。研究目的探討心肌頓抑的差異表達(dá)基因 , 分析其功能以探討心肌頓抑可能的 分子學(xué)機(jī)制以便為今后的基因治療提供目標(biāo)基因 ; 觀察鈣拮抗劑地爾硫卓不同時(shí) 間左心室直接注入對(duì)大鼠心肌頓抑的療效。研究方法 1. 采取大鼠開胸前降支結(jié) 扎 20 分鐘再灌注 120分鐘方法制造心肌頓抑模型 ;2. 取大鼠頓抑及假手術(shù)組前壁 心肌提取總RNA采用北京博奧生物有限公司的 27K Rat Genome Array芯片掃描 觀察差異表達(dá)的基因。3. 選擇基因芯片差異表達(dá)倍數(shù)高的基因進(jìn)行熒光 PCR驗(yàn)證確定芯片檢測(cè)

5、結(jié) 果的可靠性。4.應(yīng)用地爾硫卓在缺血前、 再灌注即刻、再灌晚期左心室注射觀測(cè) 其對(duì)頓抑大鼠心肌功能的影響。結(jié)果 1. 大鼠心肌頓抑模型的制造。心肌頓抑組與假手術(shù)組比較在缺血及再 灌注后出現(xiàn)心率增快 ,LVSP、LVDP、LVdp/dtmax 降低, 心肌酶無明 顯升高。2. 心肌頓抑時(shí)基因表達(dá)的變化基因芯片檢測(cè)頓抑組與假手術(shù)組心肌差異表 達(dá)的基因有 292條,其中 199條上調(diào),93 條下調(diào)。為便于進(jìn)一步分析基因功能及 意義, 我們進(jìn)一步以 4 倍差異表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)篩選出表達(dá)豐度較高的基因 41 條, 以芯片 中表達(dá)倍數(shù)較高的 HSP70 PAI-1、ATF-3、C-FOS與看家基因GADP做對(duì)照

6、,用 RT-PCR僉證,發(fā)現(xiàn)在RT-PCR僉證中表達(dá)倍數(shù)雖然不相同，但兩者總體的表達(dá)趨勢(shì) 是相同的 , 認(rèn)為芯片的篩查結(jié)果是可靠的。其中上調(diào)幅度最大為 23.1 倍, 進(jìn)一步提高篩選標(biāo)準(zhǔn)后表達(dá)下調(diào)的基因無入 選。對(duì)表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行功能分類有以下幾種 :1 、熱休克蛋白。2、立即早期基因。 3、生長(zhǎng)因子。4、凋亡相關(guān)基因。 5、其他如炎癥相關(guān)因子。3. 地爾硫卓不同時(shí)間點(diǎn)左心室注射對(duì)頓抑心肌功能的影響與假手術(shù)組比較,其他各組在缺血及再灌注 20 分鐘后均出現(xiàn)心率增快 ,LVSP、 LVDP、 LV dp/dtmax降低（Pv 0.05 ）;與心肌頓抑組比較，缺血期注射地爾硫卓 組再灌注60分鐘時(shí)LV dp/dtmax明顯改善（Pv 0.05 ）,再灌注90 分鐘時(shí)LVSP LVDP明顯改善（Pv 0.05 ）,至再灌注120分鐘時(shí)LV dp/dtmax 基本恢復(fù)至缺血前水平 ; 而再灌注早期注射地爾硫卓組在 再灌注90分鐘LV dp/dtmax明顯改善（Pv 0.05）,再灌注120分 鐘時(shí)LVSP LVDP明顯改善（Pv 0.05）;而再灌注晚期注射地爾硫卓組在再灌注 后 LVSP LVDP LV dp/dtmax 無明顯改善（P0.05 ）。結(jié)論 1.大鼠 開胸前降支結(jié)扎再灌注方法的心肌頓抑模型是成功可行的。2.心肌頓抑通時(shí)一些基因的表達(dá)發(fā)生改變 ,其中表達(dá)倍數(shù)較高的基因多