亞慢性毒性試驗

1、毒理學作業(yè)農(nóng)藥2,4-滴鈉鹽原藥 為白色粉末，水溶性，表1就是其對SD大鼠得急性經(jīng)口試驗結(jié)果, 請根據(jù)表中結(jié)果，給出該農(nóng)藥得90天亞慢性試驗得試驗方案，以及如何對保證實驗質(zhì)量予以控制。表12，4-滴鈉鹽原藥對 SD大鼠急性毒性實驗結(jié)果動物性別劑量（mg/kg）動物數(shù)（只）死亡數(shù)（只）LD50 及 95%可信限（mg/kg）雌21550584（430794）46451100055215055雄21550501（344730）46452100055215055劑量設置高劑量為 25%LD50中劑量為12、5%,低劑量為6、3%雌性LD50為584mg/kg，高劑量為146mg/kg,中劑量為73m

2、g/kg,低劑量為37mg/kg ;雄 性為 501mg/kg，高劑量為 125mg/kg，63mg/kg，低劑量為 31mg/kg。根據(jù)GB15670農(nóng)藥登記毒理學實驗方法得農(nóng)藥急性毒性分級標準，2, 4-滴鈉鹽原藥得LD50500mg/kg,屬于低度農(nóng)藥。因此試驗時選擇SD大鼠得LD50為584mg/kg。農(nóng)藥2,4-滴鈉鹽原藥SD大鼠亞慢性毒性試驗目得；研究喂飼農(nóng)藥2,4-滴鈉鹽原藥對大鼠得亞慢性毒性。方法：取初斷乳SD大鼠80只，雌雄各半按照體重隨機分為4組。將2,4-滴鈉鹽原藥按146、90d。73、37mg/kg mg/kg劑量分別拌入飼料內(nèi)經(jīng)口喂飼染毒觀察：大鼠外觀體征、體質(zhì)量、

3、進食情況等。在實驗中期與末期采血檢測檢測血液學。試驗末期檢測血生化指標以及尿常規(guī)檢查。實驗結(jié)束時處死實驗動物，計算臟器指數(shù)，并對主要臟器進行病理組織學觀察。1 材料與方法1、1 受試物農(nóng)藥 2,4-滴鈉鹽原藥，白色粉末，水溶性，由某地某農(nóng)藥公司提供。80只，雌雄各半，體質(zhì)量 50100 g，由XXX實驗動物研究所繁育場提供, 醫(yī)動字第XX-XXXX號。1、2 飼養(yǎng)與管理SPF 環(huán)境條件下，同組同性別兩只一籠喂養(yǎng)，自由進食與飲水。環(huán)境溫度 相對濕度40%60%嚴格控制晝夜交替。SPF級初斷乳大鼠動物合格證號為21 25C,1、3 實驗方法試驗前將雌、雄大鼠各半按體重隨機分為 3 個劑量組與 1

4、個對照組，每組 20 只，將 2,4- 滴鈉鹽原藥按 146、 73、37mg/kg mg/kg 劑量分別均勻混入飼料中制成顆粒飼料輻照滅菌后 分別供高、中、低劑量組動物食用，連續(xù)每日一次喂養(yǎng)90d ;對照組給予不加受試物得正常飼料。1、4 觀察指標1、4、1 一般情況試驗期間觀察動物得一般情況包括外觀體征與行為活動、糞便性狀、食物攝入量及體重變化等。1、4、 2 血常規(guī)在實驗中期與末期按常規(guī)方法測定血液學指標1、4、 3 血液生化指標試驗末期檢測血液生化指標1、4、 5 尿常規(guī)檢查尿常規(guī)測定顏色、pH 值、比重 (SG)、 尿糖 (GLU)、 尿蛋白，將尿液離心， 并對尿中沉淀物進行鏡檢。1

5、、4、 6 臟器病理肝、脾、肺、腎、 胃腸、 腎上腺、胸腺、 腦與卵巢、 睪丸等解剖動物，取心、臟器，觀察大體變化并稱重(胃腸除外)，計算臟器指數(shù)臟器質(zhì)量/體重)X 100%。將解剖取得得臟器福爾馬林固定，常規(guī)制片，HE 染色，光學顯微鏡進行病理組織學檢查 。1、5統(tǒng)計學分析亞慢性毒性試驗結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗后，符合正態(tài)得指標采用 SPSS13 0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，否則經(jīng)變換后分析。結(jié)果2、1一般狀況2、2體重變化 見表22、3血常規(guī)檢驗結(jié)果見表32、4血生化檢測結(jié)果見表42、5尿常規(guī)檢查2、5臟器指數(shù)見表52、6病理組織學檢查表22, 4滴原藥大鼠90 d亞慢性毒性試驗體質(zhì)量變化情況性

6、別染毒周數(shù)(mg/kg)01013377314637 73146表3 2 ，4-滴鈉鹽原藥大鼠90 d亞慢性毒性試驗血液常規(guī)檢驗性別量 RBC/(X10L) Hb/(gL)WBC/(X10L)GRA/%LYM/%雌性試驗雄性試驗雌性試驗雄性試驗(mg/kg)37731463773146377314637731463773146表4 2 , 4-滴鈉鹽原藥大鼠90 d亞慢性毒性試驗血生化檢測結(jié)果性別 劑量AST/(UL)ALT/(UL)ALP/(UL)BUN/(mmol L) TP/(g L)ALB/(g L)(mg/kg)3773146表5臟器指數(shù)%性別 劑量 大腦肝臟 脾臟 心臟 肺臟 胸腺

7、 腎臟 腎上腺 睪丸（卵巢）(mg/kg)3773討論控制實驗質(zhì)量大鼠毒理學實驗中實驗技術因素得質(zhì)量控制1、1動物臨床觀察指標得質(zhì)量控制在藥品臨床前大鼠毒理學實驗研究過程中其臨床觀察指標主要包括行為活動、體質(zhì),數(shù)據(jù)得客觀性與實驗環(huán)境、給藥過程中。在動物臨床指標統(tǒng)計分析；每籠2只；體質(zhì)量在實驗前應適應 每周給藥完畢即計算大鼠得飼料生物；分析產(chǎn)生差異得原因，討論差、增質(zhì)量、飼料生物利用度指標均為需要、增質(zhì)量、飼料生物利用度等，而體質(zhì)量統(tǒng)計分析得客觀指標。因其貫穿于整個實驗周期 動物感受就是否舒適、動物密度、動物健康狀況等因素相關前控制體系中，實驗環(huán)境應選擇S PF級動物實

8、驗室 環(huán)境周期 1周；計算飼料攝入量每日應稱質(zhì)量，利用度，比較分析各組動物飼料生物利用度得統(tǒng)計學意義異就是否與動物自發(fā)性疾病 ( 如大鼠自發(fā)性糖尿病會引起大鼠飼料生物利用度明顯增大 ) 有關 , 同時應排除營養(yǎng)因素或給藥途徑對動物得損傷因素 ; 在動物行為活動指標觀察中 應在每日投藥過程中重點觀察大鼠投藥部位就是否發(fā)生充血 、水腫 、嘔血 , 就是否發(fā)生動 物爭斗外傷 、皮毛稀疏豎散 、糞便性狀改變等變化 , 并及時處理與藥物因素無關得改變 , 并詳細記錄 , 認真分析 。1、 2 血液學樣本得質(zhì)量控制( R B C ) 、 蛋白定量 ( H b ) 、白細胞計數(shù)及其分類計數(shù) ( WB C+D

9、 C ) 、血小板計數(shù) ( P T ) 血時間 ( C T ) ; 血清生物化學檢測項目主要有天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ( A S T ) 酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ( A L T ) 、堿性磷酸酶 ( A L P ) 、總蛋白 ( T P ) 、清蛋白 ( A L B ) 、 總膽固醇 ( T -C H O )、總膽紅素 ( T - B I L ) 、空腹血糖 ( G L U )U N ) 、肌酐 ( C r ) 。選擇合適得血樣采集法，不僅對動物損傷小 可重復采樣等優(yōu)勢 , 而且使大鼠慢性毒理實驗中分階段檢測藥物對造血系統(tǒng) 影響成為可能。大鼠慢性毒理學實驗中血液學常規(guī)得檢測項目主要有紅細胞計數(shù)血紅、凝、丙

10、氨、尿素氮 ( B、樣本溶血率低 、生化系統(tǒng)得組織病理學檢查對于判斷實驗動物得毒性靶器官或靶組織具有重要意義 學實驗中有重要地位 靶器官或靶組織具有重要意義根據(jù)實驗取材項目設計表格 于一個完整得記錄單元中 200 mL 備用 ; 對擬取材得大鼠進行解剖分組順序編號 血致死f胸腔組織(胸腺、心、肺)7腹腔組織( 盲腸 、直腸 、肝 、脾 、胰腺 、腎上腺 、腎 、卵巢 附睪)7頸、腦部組織(甲狀腺、腦、垂體、脊髓于 3、分辨 ,組織外1、 4動物實驗中得給藥途徑不同而引起得取材質(zhì)量控制1、 3 動物病理組織標本分析前得質(zhì)量控制。在長期毒理, 就是評價藥物毒性得重要依據(jù)。組織病理學檢查對判斷動物得

11、毒性 。實踐中使用得組織學檢測前優(yōu)質(zhì)標本取材流程可以為 : , 需要取得臟器系數(shù)得器官或組織與其她器官或組織分別標示使用 250 m L 廣口瓶貯存新鮮配制得 10%甲醛溶液 180 ; 大鼠麻醉狀態(tài)下 , 股動脈放 胃 、十二指腸 、空腸 、回腸 、子宮 、膀胱 、前列腺 、睪丸 、 ) 。其中胸腺 、胰腺 、腎上腺 、卵巢 、甲狀腺 、垂體 、脊髓等腺體組織或微小組織應使用擦鏡紙或紗布非擠壓式包裹置 6%4、0%甲醛。這樣使浸泡于甲醛溶液中得易混淆臟器在進行石蠟包埋時容易 同時保證病理組織學檢查中組織樣本數(shù)目完整 ; 其她組織除大體觀察有明顯病灶得 , 要求動物組織樣本均取自該組織得代表區(qū)

12、因臨床給藥途徑不同 , 在大鼠慢性毒理實驗項目中存在不同得給藥方式 , 主要給途 徑有 主要給藥途徑有 灌胃 、直腸 、舌下 、腹腔注射 、肌內(nèi)注射 、皮膚涂抹等。在毒理 學研究中可能通過對直接接觸藥物部位得檢測結(jié)果分析藥物慢性刺激對直接刺激局部組織 得影響 , 還可以分析藥物吸收與給藥技能合理與否 。2 影響大鼠毒理學實驗結(jié)果得環(huán)境 、動物福利 、誤差控制2、 1 毒理學實驗中得環(huán)境控制在不同環(huán)境中進行動物實驗得大鼠 , 對照組與藥物組動物均不同程度地存在因環(huán)境所 致得炎性細胞浸潤或間質(zhì)性肺炎等病理變化 , 這些變化與實驗環(huán)境級別及日常消毒措施合 理與否息息相關。 樣本固定前得大體解剖觀察處

13、理與組織學檢查結(jié)果具有直接關系 , 取樣以 肉眼能觀察到病灶得肺葉與表面觀察正常得肺葉各取一為原則 , 在同一個受試動物肺組織 中不可單一地單純選擇大體觀察異常得小葉或大體觀察正常得小葉樣本2、 2 毒理學實驗中得動物福利控制, 生理, 抓取動物輕拿輕放 , 要求實驗研究人員具備愛護動動物在毒理學研究過程中，會產(chǎn)生緊張 、疼痛 、呼吸困難 、痙攣 、顫抖 、腹瀉 、 孔道出血 、癱瘓 、休克 , 甚至死亡得情況 。因此 , 它們在遇到恐懼或惡劣環(huán)境時 與心理都可能患病 。控制原則為實驗人員投藥過程時間宜短不宜長 血清采樣宜快不宜慢 , 盡量提供人為因素影響小得實驗環(huán)境， 物之心與熟練得動物實驗

14、技能并貫穿于整個實驗周期2、 3 毒理學實驗中得誤差質(zhì)量控制、實驗操作得一致性 、流程得在大鼠慢性毒理學實驗中系統(tǒng)誤差主要與樣本得隨機性 恒定性有關 。 抽樣誤差 : 一般情況下 , 慢性毒性實驗中每個實驗組應使用相等數(shù)量得 雌 、雄動物 。每組動物大鼠至少 20 只 。差異應不超過平均體質(zhì)量得 20%。 系統(tǒng)誤差 。 包括下列兩類情況 。實驗技術熟練因素造成得誤差 : 在毒理學實驗研究中 , 為了真實反映 外來化合物得毒性 , 除了要統(tǒng)一各種實驗條件外 , 每日得給藥時間應一致 。一就是可比性 強 , 二就是為了避免錯誤而影響其她藥理實驗甚至臨床用藥。因此 , 應將實驗人員得技術熟練因素以一定得模式貫穿于各實驗組中 , 在整個給藥期中給藥人員每天應互換給藥得組 別 , 同時應保證給藥時間得準確性與一致性；流程造成得誤差控制 : 系統(tǒng)誤差可因分析方( 器皿不凈 、加樣 。在藥物安全性評。比如空腹法 、儀器校正錯誤 、試劑純度不夠 、檢測者得感觀 、環(huán)境因素改變等因素造成 ; 隨機可 能因動物實驗過程中各種隨機因素得共同作用等因素造成 。如實驗過程得溫