人參皂苷Rg1抗同型半胱氨酸誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的作用及相關機制研究

1、人參皂苷rg1抗同型半胱氨酸誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的作用及相關機制研究1376?論著?童墮皇11年5月第4o卷第14期人參皂苷rgl抗同型半胱氨酸誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的作用及相關機制研究賀國洋,李永真,李新強,朱慧芳,韓芳毅,千新來(新鄉(xiāng)醫(yī)學院病理學教研室,河南新鄉(xiāng)453003)摘要:目的探討人參皂苷rgl抗同型半胱氨酸(hcy)誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(huvecs)凋亡的作用及相關機制.方法體外培養(yǎng)huvecs細胞,采用瓊脂糖凝膠電泳和末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(tunel)染色檢測細胞凋亡情況,逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(rt-pcr)和westernblotting分析各

2、組內(nèi)皮型一氧化氮合酶(enos)mrna和蛋白質(zhì)的表達.結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳顯示:與對照組和rgl組比較,hcy組可見特征性dna的梯狀條帶.tunel染色顯示:與對照組和rgl組比較hcy組細胞凋亡率增加差異有統(tǒng)計學意義(p<o.01);rt-pcr顯示:與對照組和rgl組相比,hcy組enosmrna水平表達降低差異有統(tǒng)計學意義(p<o.o1);與hcy組相比,hcy+rgl組enosmrna水平表達增加差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01),但仍低于對照組和rgl組,差異有統(tǒng)計學意義(p<o.01).westernblotting顯示:與對照組和rgl組相比,hcy組en

3、os蛋白水平表達降低差異有統(tǒng)計學意義(p<o.01);與hcy組相比,hcy+rgl組enos蛋白水平表達增加差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01),但仍低于對照組和rgl組,差異有統(tǒng)計學意義(p<o.o1).結(jié)論人參皂苷rgl能夠抑制hcy誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡,此作用可能與上調(diào)血管內(nèi)皮細胞enos水平有關.關鍵詞:人參皂苷;細胞凋亡;同型半胱氨酸;內(nèi)皮型一氧化氮合酶doi:10.3969/j.issn.16718348.2011.14.010文獻標識碼:a文章編號:1671-8348(2011)14137603inhibitingeffectsofginsenosiderg

4、lonhumanumbilicalveinendothelialcellsapoptosisinducedbyhcyanditsmolecularmechanismheguoyang,liyongzhen,lixinqiang,zhuhuifang,hanfangyi,qianxinlai(departmentofpathology,xinxiangmedicaluniverserty,xinxiang,henan453003,china)abstract:objectivetoinvestigatetheinhibitingeffectofginsenosiderglonapoptosiso

5、fhumanumbilicalveinendothelialcells(huvecs)inducedbyhomocysteine(hey)anditspossiblemechanism.methodshuvecswereincubatedinvitro.theagarosege1electrophoresisandtheterminaldeoxynucleotidy1transferase-mediateddutpbiotinnickendlabeling(tunel)wereappliedforthedetectionofapoptosisofhuvecstreatedwithhcyandr

6、g1.rtpcrandwesternblottingwereperformedtodeterminetheexpressionofendothelia1nitricoxidesynthase(enos).resultstheresultsfromtheagarosegele1ectrophoresisdisplayedthatdnaladderwasseeninhuvecstreatedwithhcygroup.theresultsfromthetunelstainingdisplayedthatcomparedtothecontrolgroupandrglgroup.thenumberofa

7、poptoticcellsinhcygroupincreasedsignificantly(p<0.01);comparedtothehcygroup,thenumberofapoptoticcellsinthehcy+rg1groupdecreasedmarkedly(p<0.01),andtheapoptoticpercentagedecreasedfrom33.733to9.200,butthepercentagewasstillhigherthanthecontrolgroupandrglgroup(p<0.01).theresultsfromthertpcrandw

8、esternblottingshowedthatcomparedtothecontrolgroupandrglgroup,theexpressionofenosdecreasedappatentlyinthehcygroup(p<0.o1);comparedtothehcygroup,theexpressionofenosincreasedvisiblyinthehcy+rg1group(p<o.o1),buttheexpressionofenoswasstilllowerthanthecontrolgroupandrglgroup(p<0.01).conclusionhcy

9、caninducetheapoptosisofhuvecs.gisenosiderglcanprotecthuvecsfromtheinjuryinducedbyhcy.upregulationofenosexpressionmaybeoneofthepossiblemechanisms.keywords:ginsenoside;apoptosis;homocystein;endothelialnitricoxidesynthase血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能損傷是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,as)的始動環(huán)節(jié)】.同型半胱氨酸(homoeysteine,hey)是as等心血管疾病的獨立危

10、險因子,其致病機制之一就是通過降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthease,enos)的合成和活性,使內(nèi)皮細胞no生成減少,導致血管內(nèi)皮功能損害.血管內(nèi)皮細胞死亡分為凋亡和壞死兩種形式,人參皂苷究竟是通過抑制何種死亡形式防止氧自由基對血管內(nèi)皮細胞的損傷目前尚未探明.本研究以hcy誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(humanumbilicalveinendothelialcells,huvecs)凋亡為模型,探討人參皂苷rgl是否有抑制hcy誘導通訊作者,telemail:qxlfssws163.corn血管內(nèi)皮細胞凋亡的作用及其相關分子機

11、制,為保護血管內(nèi)皮功能和防治as開辟新途徑.1材料與方法1.1材料,試劑與主要儀器人臍靜脈內(nèi)皮細胞(huvecs)由中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供;胎牛血清(fbs)購自杭州四季青生物工程材料研究所;100bpdnamarker為美國fermentas公司產(chǎn)品;人參皂苷rgl購自北京中國藥品生物制品鑒定所,編號07039711;rpmi1640瓊脂糖,rna酶a,蛋白酶k,胰蛋白酶等為美國invitrogen公司產(chǎn)品,酶標儀為美國thermo公司產(chǎn)品,凋亡試劑盒購自德國roche公司.p_ac重慶醫(yī)學2011年5月第4o卷第14tin鼠抗人單抗(igg),en()s兔抗人多克隆抗體(igg),辣根

12、酶標記的兔抗鼠(igg)和辣根酶標記的羊抗兔(igg)二抗均購自美國santacruz公司.1.2方法1.2.1細胞培養(yǎng)條件huvecs培養(yǎng)條件為:含體積分數(shù)為1ofbs和青/鏈霉素(青霉素100u/ml,鏈霉素100rag/i)的rpmi1640培養(yǎng)基,在37,體積分數(shù)為5c()2孵箱中培養(yǎng).1.2.2細胞凋亡檢測(1)瓊脂糖凝膠電泳:常規(guī)胰蛋白酶消化法收集對數(shù)生長期對照組,200/,mol/lhcy(hcy組),200mol/lhcy和40/,g/mirgl組(hcy+rgl組)及40ig/mlrgl組(rgl組)處理24h的huvecs細胞,按分子克隆方法提取基因組dna嘲.定量后dna

13、樣品與上樣緩沖液5:1(v/v)混勻,加樣10l在含有溴化乙錠的15g/l瓊脂糖凝膠電泳中電泳4h,電壓5ov,電泳緩沖液為1xtae,電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下觀察并拍照分析細胞凋亡情況.(2)末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(tunel)染色觀察凋亡細胞,常規(guī)胰酶消化huvecs,取用新鮮配制40g/i的多聚甲醛處理過的載玻片,室溫固定huvecs60rain.然后滴加3過氧化氫一甲醇室溫作用10rain,磷酸鹽緩沖液(pbs)沖洗3次上搖床5rain,pbs沖洗滴加標記反應混合物每片5ol,于37烤箱避光反應60min,陰性對照只加5ol分出的管2溶液.pbs沖洗后放

14、在濕盒中滴加管3液體每片5ol,于37,避光反應30rain.dab顯色,復染,分化,脫水,中性樹膠封片,光鏡觀察并照相.1.2.3enosmrna檢測由trizol試劑提取對數(shù)生長期的對照組,hcy組,hcy+rgl組和rgl組處理24h的huvecs細胞總rna并定量,按rtpcr試劑盒方法合成cdna第1條鏈,以cdna為模版,采用rtpcr方法檢測enosmrna表達.引物和目的片段見表1.反應條件:94預變性2min,94變性45s,60退火45s,72延伸2min,擴增3o個循環(huán),最后72延伸5rain.產(chǎn)物以18g/l瓊脂糖凝膠電泳后觀察并照相.以gapdh為內(nèi)參照.表1引物序列

15、和目的片段1.2.4enos蛋白檢測常規(guī)胰蛋白酶消化法收集對數(shù)生長期對照組,hcy組,hcy4-rgl組及rgl組處理24h的huvecs細胞,細胞總蛋白提取,定量及變性見文獻7.提取的總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉(sds)變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后進行westernblotting操作,檢測enos蛋白表達.蛋白上樣量均為5og,actin鼠抗人單抗(igg),enos兔抗人多克隆抗體(igg),辣根酶標記的兔抗鼠(igg)和辣根酶標記的羊抗兔(igg)二抗稀釋倍數(shù)分別為1:2500,1:200,1:7500和l:5000.1.3統(tǒng)計學處理應用spss11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,多樣本均數(shù)

16、的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用lsd和snk檢驗.檢驗水準為a一0.05.2結(jié)果2.1細胞凋亡的檢測與對照組和rgl組相比,hcy組可見l377明顯dna梯狀條帶,而hcy4-rgl組未見特征性dna的梯狀條帶(圖1);tunei染色結(jié)果顯示,hcy組細胞凋亡率明顯高于對照組和rgl組(p<o.05).見表2.(130)i)500l巾41)m:100bpdnamarkers;1:對照組細胞;2:rgl組細胞;3:hcy+rgl組細胞;4:hcy組細胞.圖l瓊脂糖凝膠電泳分析細胞dna斷裂情況表2tunel染色檢測細胞凋亡情況:p<0.01,與對照組,rgl組和hcy+rgl

17、組比較;:p<0.01,與對照組和rgl組比較.2.2enosmrna檢測結(jié)果rtpcr結(jié)果見圖2,表3.1:對照組細胞;2:rgl組細胞;3:hey組細胞;4:hcy+rgl組細胞;m:100bpdnamarkers.圖2rt-pcr方法檢測enosmrna水平表達變化瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表3enosmrna水平表達變化rt-pcr檢測結(jié)果組別enos/gapdh灰度比值(i)對照組rgl組hcy組hcy+rgl組p0.79870.01300.80670.03500.10430.00780.59030.0220671.9720.000:p<50.01,與對照組,rgl組和hcy+r

18、gl組比較;一:p<0.01,與對照組和rgl組比較.13782.3enos蛋白表達情況westernblotting結(jié)果見圖3,表4.,.參考文獻e8一act】11:對照組細胞;2:rgl組細胞;3:hcy組細胞;4:hcy+rgl組細胞.圖3westernblotting方法方法檢測enos蛋白水平表達變化結(jié)果表4enos蛋白水平表達變化westernblotting檢測結(jié)果(js)組別enos/gapdh灰度比值對照組rgl組hey組hcy十rgl組fp0.40930.01150.40670.00570.0917土0.00550.30430.00761053.4280.000:p&

19、lt;0.01,與對照組,rgl組和hcy+rgl組比較;一:_尸<0.01,與對照組和rgl組比較.3討論血管內(nèi)皮細胞位于血管腔的內(nèi)表面,不僅是血流與血管壁之間的屏障結(jié)構(gòu),而且是維持血管正常功能的關鍵因素,包括調(diào)節(jié)動脈血管收縮,凝血系統(tǒng)平衡血小板聚集,單核細胞黏附和促進新生血管生長等.血管內(nèi)皮功能障礙是多種心血管疾病共同的病理生理改變,尤其在as,心肌缺血及缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用.近年來的研究發(fā)現(xiàn)血漿hcy水平升高是as,心肌缺血等心血管疾病一個獨立危險因素.血管內(nèi)皮細胞的過度凋亡在as,急性冠狀動脈綜合征等心血管疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用,因此抑制hcy誘導的血管內(nèi)皮細胞過度

20、凋亡是心血管疾病防治的重要環(huán)節(jié)口.實驗中以hcy作用于huvecs細胞24h時,與對照組相比,細胞凋亡比例顯著升高(對照組為2.367,hcy組為33.733),rtpcr和westernblotting結(jié)果顯示,hcy能夠抑制enosmrna和蛋白的表達,進而抑制enos活性,從而減少內(nèi)皮細胞n0的生成.同時血管內(nèi)皮細胞enos表達水平也明顯降低.人參皂苷是一類正在開發(fā)的防治心血管疾病的新藥,目前已經(jīng)明確其有3o多種單體,其藥理效應各自不盡相同,人參皂苷rgl為原人參三醇類的主要組成成分之一.,在實驗中發(fā)現(xiàn)人參皂苷rgl能抑制hcy誘導的huvecs細胞凋亡,使凋亡比例由33.733下降到9

21、.200.rgl抑制hcy誘導huvecs細胞凋亡的同時還能上調(diào)被hcy抑制的內(nèi)皮細胞enos水平.因此推測rgl抑制hcy誘導內(nèi)皮細胞凋亡的作用機制可能是通過上調(diào)enos水平,提高血管內(nèi)皮細胞no的含量,減輕細胞的脂質(zhì)過氧化損傷來實現(xiàn)的.綜上所述,人參皂苷rgl可抑制hcy誘導的血管內(nèi)皮細胞凋亡,此作用可能與上調(diào)血管內(nèi)皮細胞的enos水平有關.重墮蘭生5月第4o卷第14期1王海東,余雙奇,高芬,等.脂聯(lián)素的抗動ilglg作用ej.重慶醫(yī)學,2009,38(19):2509.23hermanag,moncadas.therapeuticpotentialofnitricoxidedonorsi

22、nthepreventionandtreatmentofatherosclerosisj.eurheartj,2005,26(19):1945955.e32段珩.動脈粥樣硬化的發(fā)病機制fj.中國保健:醫(yī)學研究版,2008,16(21):971-972.e43durandp,prostm,loreaun,eta1.impairedhornocysteinemetabolismandatherothromoboticdiseasej.labinvest,2001,81(5):645.53sttihlingermc,okark,grafee,eta1.endothelialdysfunctionin

23、ducedbyhyperhomocyst(e)inemia:roleofasymmetricdimethylargininejcirculation,2003,108(8):933-938.6薩姆布魯克.分子克隆實驗指南m.金冬雁,譯.3版.北京:科技出版社,1992:305.7崔靜,千新來,李永真,等.鈣磷酸蛋白c對乳癌細胞mdamb-435s凋亡的影響ej.鄭州大學學報:醫(yī)學版,2009,44(4):731-735.e8mengx,lizm,zhouyj,eta1.effectoftheantioxidantalphalipoicacidonapoptosisinhumanumbilicalveinen-dothelialcellsinducedbyhighglucosej.clinexpmed,2008,8(1):4349.9黃朝暉,趙洪雯,劉宏,等.核因子一b對apoe-/一小鼠腎動脈粥樣硬化斑塊破裂腎損害的實驗研究j.重慶醫(yī)學,2008,37(8):79