工業(yè)微生物菌種選育和保藏

1、工業(yè)微生物菌種選育和保藏 第一節(jié) 工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物 一、工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物* 從自然界中分離出來就能被利用； 對野生菌株進(jìn)行人工誘變，得到突變株才能被利用。 使用重組DNA技術(shù)改造的菌株 目前育種總趨勢 從野生菌轉(zhuǎn)向變異菌從野生菌轉(zhuǎn)向變異菌 自然選育轉(zhuǎn)向代謝育種自然選育轉(zhuǎn)向代謝育種 從誘發(fā)基因突變轉(zhuǎn)向基因重組的定向育種從誘發(fā)基因突變轉(zhuǎn)向基因重組的定向育種。 第二章 生物工業(yè)菌種與種子的擴(kuò)大培養(yǎng) 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 由于發(fā)酵工程本身的發(fā)展以及遺傳工程的介入，藻類藻類 （alga）、病毒（）、病毒（virus）等也正在逐步地變?yōu)楣I(yè)生產(chǎn)用 的生物。 盡管如此，目前人們對微生物的認(rèn)識還是

2、十分不夠的 。已經(jīng)初步研究的不超過自然界微生物總量的10%左右。 微生物的代謝產(chǎn)物據(jù)統(tǒng)計(jì)已超過一千三百多種，而大規(guī) 模生產(chǎn)的不超過一百多種； 微生物酶有近千種，而在工業(yè)上利用的不過四五十種。 可見潛力是很大的。 在工業(yè)生產(chǎn)中常用的微生物主要有細(xì)菌、酵母菌、霉 菌和放線菌。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 工業(yè)生產(chǎn)常用的細(xì)菌有工業(yè)生產(chǎn)常用的細(xì)菌有 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 乳酸桿菌乳酸桿菌(Lactobacillus lactics) 醋酸桿菌醋酸桿菌(Acetobacter) 棒狀桿菌棒狀桿菌(Corynebacterium) 短桿菌短桿菌(Brevibacte

3、rium) 用于生產(chǎn)：用于生產(chǎn)： 生產(chǎn)淀粉酶生產(chǎn)淀粉酶(amylase） 蛋白酶（蛋白酶（proteinase） 乳酸乳酸(lactic acid) 醋酸醋酸(acetic acid) 氨基酸氨基酸(amino acid) 肌苷酸肌苷酸(inosinic acid) 細(xì)菌（bacteria）： 屬于單細(xì)胞原核生物 （ unicellular prokaryote），），以典型 的二分分裂(binary)方式繁殖。 細(xì)胞生長時(shí)細(xì)胞生長時(shí)，環(huán)狀染色體 （chromosome）被復(fù)制，細(xì)胞內(nèi)的 蛋白質(zhì)等組分同時(shí)增加一倍，然后在 細(xì)胞中部產(chǎn)生一橫段間隔，染色體被 分開，繼而間隔分裂形成兩個(gè)相同的 子細(xì)

4、胞。 如間隔不完全分裂就形成鏈狀細(xì) 胞。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 酵母菌（酵母菌（yeast） 酵母菌為單細(xì)胞真核生物（ unicellular eukaryote），在自然界 中普遍存在，主要分布于含糖質(zhì)較多的的酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜、 花蜜（nectar）和植物葉子上，以及果園土壤中。石油酵母（petroleum yeast）較多地分布在油田周圍的土壤中。 酵母菌大多為腐生，常以單個(gè)細(xì)胞存在，以發(fā)芽形式進(jìn)行繁殖。母 細(xì)胞體積長到一定程度時(shí)就開始發(fā)芽。芽長大的同時(shí)母細(xì)胞縮小，在母 子細(xì)胞間形成隔膜，最后形成同樣大小的兩個(gè)細(xì)胞。如果子芽不

5、與母細(xì)如果子芽不與母細(xì) 胞脫離就形成鏈狀細(xì)胞，稱為假菌絲胞脫離就形成鏈狀細(xì)胞，稱為假菌絲(pseudomycelium)。 工業(yè)上用的酵母菌有：啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、假絲 酵母(Candida)、類酵母(Saccharomycodes)等，用于釀酒(Brewing)、制 造面包、制造低凝固點(diǎn)石油、生產(chǎn)脂肪酶（lipase），以及生產(chǎn)可食用 、藥用和飼料用酵母菌體蛋白等。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)示意圖真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)示意圖 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 霉菌（霉菌（mould） 霉菌不是一個(gè)分類學(xué)上的名詞。凡生長在營養(yǎng) 基質(zhì)上形成絨毛狀、網(wǎng)狀或絮

6、狀菌絲的真菌 (fungi)統(tǒng)稱為霉菌。 霉菌在自然界分布很廣，大量存在于土壤、空 氣、水和生物體內(nèi)外等處。它喜歡偏酸性環(huán)境， 大多數(shù)為好氧性(aerobiotic)，多腐生，少數(shù)寄生。 霉菌的繁殖能力很強(qiáng)，它以無性孢子和有性孢子 進(jìn)行繁殖，大多以無性孢子繁殖為主。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 生長方式是菌絲末端的伸長和頂端分 支，彼此交錯(cuò)呈網(wǎng)狀。菌絲的長度既受遺 傳性的控制，又受環(huán)境的影響，其分支數(shù) 量取決于環(huán)境條件。菌絲或呈分散生長， 或呈菌絲團(tuán)狀生長。 工業(yè)上常用的霉菌有：工業(yè)上常用的霉菌有： 藻狀菌綱的根霉、毛霉、犁頭霉，子 囊菌綱的紅曲霉，半知菌類的曲霉、青霉 等； 產(chǎn)品產(chǎn)品： 酶制劑

7、（enzyme preparation）、抗生 素(antibiotic)、有機(jī)酸（organic acid）及 甾體激素（steroid hormone） 等。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 例如 1、青霉屬 青霉素產(chǎn)生菌 點(diǎn)青霉菌 產(chǎn)黃青霉菌誘變提高產(chǎn)量 v 青霉：延胡索酸 葡萄糖酸 v2、頭孢霉菌 產(chǎn)生頭孢菌素C v3、曲霉菌生產(chǎn)有機(jī)酸、甾體類轉(zhuǎn)化 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 放線菌放線菌(Actinomycetes) 放線菌因菌落呈放線狀而得名。它是一個(gè)原核 生物類群，在自然界中分布很廣，尤其在含有機(jī)質(zhì) 豐富的微堿性土壤中較廣。大多腐生，少數(shù)寄生。 放線菌主要以無性孢子進(jìn)行繁殖，也可借菌絲

8、片段進(jìn)行繁殖。后一種繁殖方式見于液體沉沒培養(yǎng) （submerged cultures）中。其生長方式是菌絲末 端伸長和分支，彼此交錯(cuò)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，成為菌絲體 。菌絲長度即受遺傳性的控制，又與環(huán)境相關(guān)。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 在液體沉沒培養(yǎng)中由于攪拌器（agitator ）的剪應(yīng)力作用，常常形成短的分支旺盛的菌 絲體，或呈分散生長，或呈菌絲團(tuán)狀生長。它它 的最大經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于能產(chǎn)生多種抗生素的最大經(jīng)濟(jì)價(jià)值在于能產(chǎn)生多種抗生素（ antibiotics）。）。從微生物中發(fā)現(xiàn)的抗生素，有 60%以上是放線菌產(chǎn)生的，如鏈霉素、紅霉素 、金霉素、慶大霉素等。 常用的放線菌主要來自以下幾個(gè)屬：鏈霉 菌屬、

9、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬等。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 v1、鏈霉菌屬，是產(chǎn)生抗生素最多的一個(gè)屬 v鏈霉素 灰色鏈霉菌 v紅霉素 紅色鏈霉菌 v四環(huán)素 金色鏈霉菌 v2、小單孢菌 慶大霉素 由絳紅小單孢菌和棘 孢小單孢菌產(chǎn)生。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 其他生物：其他生物： A: 擔(dān)子菌（擔(dān)子菌（Basidiomycetes ）：所謂的擔(dān)子菌 就是人們通常所說的菇類(mushroom)生物。擔(dān)子 菌資源的利用正愈來愈引起人們的重視，如多糖 (polysaccharide)、抗癌(anticancer)藥物的開發(fā)。 近幾年來，日本、美國的一些科學(xué)家對香菇的 抗癌作用進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)香菇中的“

10、1， 2-葡萄糖苷酶”及兩種糖類物質(zhì)具有抗癌作用。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 B：病毒：病毒(virus) 其特點(diǎn)如下： 1. 形體微小，體積比細(xì)菌 小的多。 2. 沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是一種 獨(dú)特分子的生物，主要由核 酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。 3. 營寄生生活，由于缺乏 獨(dú)立代謝的酶體系，不能脫 離寄主而自行生長繁殖，有 專一性。 人類免疫缺陷病毒 （ human immunodeficiency virus ，HIV ） 獲得性免疫缺陷綜合癥（ acquired immunodeficiency syndrome， AIDS ） 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 噬菌體（phage）是

11、病毒的 一種。 ：烈性噬菌體和溫和噬菌：烈性噬菌體和溫和噬菌 體概念與區(qū)別。體概念與區(qū)別。 噬菌體在寄主細(xì)胞中的生長 繁殖過程可分為吸附、浸入、增 殖、成熟和釋放。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 C：藻類（：藻類（alga）： 培養(yǎng)螺旋藻，按干重計(jì)算每公頃可收獲60噸，而種植 大豆每公頃才可獲4噸；從蛋白質(zhì)產(chǎn)率來看，螺旋藻是大 豆28倍。 培養(yǎng)珊列藻，從蛋白質(zhì)產(chǎn)率計(jì)算，每公頃珊列藻所得 蛋白質(zhì)是小麥的20-35倍。此外，還可通過藻類將CO轉(zhuǎn) 變?yōu)槭?，培養(yǎng)單胞藻或其他藻類而獲得的石油，可占細(xì) 胞干重的5%-50%,合成的油與重油相同，加工后可轉(zhuǎn)變汽 油、煤油、和其他產(chǎn)品。 有的國家已建立培植單胞藻

12、的農(nóng)場，每年每公頃地培 植的單胞藻按5%干物質(zhì)為碳水化合物（石油）計(jì)算，可 得60噸石油燃料。此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，還可減輕因工業(yè)生產(chǎn) 而大量排放CO造成的溫室效應(yīng)。 國外還有人從“藻類農(nóng)場”獲取氫能的報(bào)道，大量培養(yǎng) 藻類，利用其光合放氫作用來取得氫能。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏藻藻 類類 工工 廠廠 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 二、 微生物工業(yè)對菌種的要求微生物工業(yè)對菌種的要求 目前，隨著微生物工業(yè)原料的轉(zhuǎn)換和新產(chǎn)品的不斷出現(xiàn) ，勢必要求開拓更多新品種。盡管微生物工業(yè)用的菌種多 種多樣，但作為大規(guī)模生產(chǎn)，對菌種則有下列要求： (1)廉價(jià)原料、生長迅速、目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。 (2)易于控制培養(yǎng)條件，酶活性

13、高；發(fā)酵周期較短。 (3)抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)。 (4) 菌種純，不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害的生 物活性物質(zhì)和毒素，保證安全生產(chǎn)。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 在篩選所需的菌種時(shí)應(yīng)考慮的一些重要的指標(biāo)： （1） 菌種的營養(yǎng)特征： （2） 菌種的生長溫度： （3） 菌種對所采用的設(shè)備及生產(chǎn)過程的適應(yīng)性： （4） 菌種的穩(wěn)定性： （5） 產(chǎn)物的得率和產(chǎn)物的濃度： （6） 產(chǎn)物容易回收： 能滿足（3）（6），則有希望成為效益較高的生產(chǎn)菌種。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 第二節(jié)第二節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯與保藏菌種的衰退、復(fù)壯與保藏 v菌種退化是指經(jīng)較長時(shí)間傳代保藏后，菌株的 一個(gè)或多個(gè)生理性狀和形態(tài)特

14、征逐漸減退或消 失的現(xiàn)象。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 一、微生物菌種衰退的原因一、微生物菌種衰退的原因 1. 原因原因 一是菌種保藏不妥; 二是菌種生長的要求沒有得到滿足，或是遇到不 利的條件，或是失去某些需要的條件； 三是經(jīng)誘變獲得的新菌株發(fā)生回復(fù)突變回復(fù)突變，從而喪 失新的特征的情況。 連續(xù)傳代是菌種退化的直接原因，這是由于菌種 經(jīng)常處于旺盛的生長狀態(tài)。 衰退菌株的特點(diǎn)：個(gè)體或群體特征發(fā)生變化；生個(gè)體或群體特征發(fā)生變化；生 產(chǎn)能力降低；代謝能力降低；發(fā)酵周期延長；抗不產(chǎn)能力降低；代謝能力降低；發(fā)酵周期延長；抗不 良環(huán)境能力降低。良環(huán)境能力降低。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 2 防止菌種衰退的

15、措施 菌種的分離菌種的分離: 因?yàn)樵诰N發(fā)生衰退的同時(shí)，并 不是所有的菌體都衰退，其中未衰退的菌體往往是 經(jīng)過環(huán)境條件考驗(yàn)的，具有更強(qiáng)的生產(chǎn)能力。 因此，對于已衰退的菌株采用單細(xì)胞菌株分離單細(xì)胞菌株分離 的措施，即用稀釋平板法或用平板劃線法，以取得 單細(xì)胞所長成的菌落（colony），再通過菌落和菌體 的特征分析和性能測定，就可獲得具有原來形狀的 菌株，甚至性能更好的菌株（strain）。）。 如果菌種已經(jīng)發(fā)生退化，產(chǎn)量下降，則要進(jìn) 行 分離復(fù)壯。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 如對芽孢桿菌(Bacillus)，可先將菌液用沸水 處理幾分鐘，再用平板進(jìn)行分離，從所剩下的孢 子中挑選出最優(yōu)的菌體。

16、如果遇到某些菌株即使進(jìn)行單細(xì)胞分離，仍 不能達(dá)到復(fù)壯的效果，則可改變培養(yǎng)條件，達(dá)到 復(fù)壯的目的。 如AT3.942棲土曲霉(Aspergillus terricola)的 產(chǎn)孢子能力下降，可適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度，恢復(fù)其 能力。 同時(shí)通過實(shí)驗(yàn)選擇一種有利于高產(chǎn)菌株而不 利于低產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 其它防其它防 衰衰 措措 施施 v菌種的復(fù)壯 v提供良好的環(huán)境條件 v使用優(yōu)良的保存方法 v定期純化菌種 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 二 、 菌種的復(fù)壯 v通過分離達(dá)到復(fù)壯:菌落純菌落純/細(xì)胞純細(xì)胞純 在瓊脂平板劃線、涂布或與瓊脂培養(yǎng)基 混合培養(yǎng)再分離，達(dá)到菌落純菌落純 采用單細(xì)胞或單

17、孢子分離法達(dá)到細(xì)胞細(xì)胞 純純 v通過寄主體達(dá)到復(fù)壯: 對于寄生性微生物的退化菌株,將菌株接種 到寄主細(xì)胞進(jìn)行繁殖達(dá)到復(fù)壯。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 三、菌種保藏（strain preservation） 基本原理基本原理：根據(jù)菌種的生理、生化特點(diǎn)，人為 地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動處于休眠狀態(tài)。 要求：要求：維持菌種的存活和減少菌種的變異，盡 量使菌種保持原來優(yōu)良的生產(chǎn)性能。 保藏時(shí)首先選擇優(yōu)良純菌種優(yōu)良純菌種，最好是它們的休 眠體如孢子（ spore）、芽孢 (gemma)等；其次是 要創(chuàng)造一個(gè)有利于休眠的環(huán)境條件，如低溫、干燥低溫、干燥 、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等，使

18、菌體的代謝活動處于 最低狀態(tài)，延長其保存期。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 保存方法：保存方法： 應(yīng)能較長期地保存原有菌種的優(yōu)良性能，使菌種穩(wěn)定，同 時(shí)也要考慮到方法本身的經(jīng)濟(jì)簡便。不同的菌種有不同的保存 方法，以便長期保藏。 酵母菌酵母菌：定期移植斜面低溫保藏法。也可采用石蠟油封保 藏法。 霉菌：霉菌：斜面保藏法和沙土管保藏法。 細(xì)菌和放線菌細(xì)菌和放線菌：一般細(xì)菌以采用冷凍干燥保藏法為佳。 放 線菌可用沙土或冷凍保藏法保藏。短期可采用斜面保藏。 保藏應(yīng)注意的問題保藏應(yīng)注意的問題： 菌體狀態(tài)：休眠體 基質(zhì)：營養(yǎng)貧乏 操作過程：不應(yīng)對細(xì)胞造成傷害不應(yīng)對細(xì)胞造成傷害 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 工業(yè)生產(chǎn)

19、中微生物育種的基本方法包括自然選育、誘變 育種、抗性菌種選育、代謝控制育種及基因重組定向育種等。 育種就是要改善菌種的特性，使之能提高產(chǎn)量、改進(jìn)質(zhì) 量、降低成本、改進(jìn)工藝、方便管理及綜合利用等。 代謝控制育種主要有兩個(gè)方面： 改變代謝通路的育種 改變代謝自動調(diào)節(jié)系統(tǒng)的育種 第三節(jié)第三節(jié) 菌種的選育菌種的選育 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 一、自然選育 采樣 增殖培養(yǎng) 從自然界選育菌株 純種分離 性能鑒定 從自發(fā)突變中選育菌株 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 二、誘變育種 按照生產(chǎn)的要求，根據(jù)生物的遺傳和變異的理論， 用人工的方法造成菌種變異，再經(jīng)過篩選、而達(dá)到 菌種誘變選育的目的。 誘變育種誘變育種一般

20、采用物理、化學(xué)誘變劑使微生物 DNADNA的堿基的堿基排列發(fā)生變化，以使排列錯(cuò)誤的DNA模板 形成異常的遺轉(zhuǎn)信息，造成某些蛋白結(jié)構(gòu)變異，而 使細(xì)胞功能發(fā)生改變。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 原種（出發(fā)菌株）純化斜面培養(yǎng)完全培養(yǎng)基 同步培養(yǎng)離心洗滌玻璃珠震蕩分散過濾單 細(xì)胞或孢子懸浮液 活菌計(jì)數(shù) 誘變處理 誘變處理預(yù)備實(shí)驗(yàn) 處理液活菌計(jì)數(shù) 平板分離 形態(tài)變異并計(jì)算其變異率 斜面培養(yǎng) 初篩、復(fù)篩 自然分離和再復(fù)篩 保藏及擴(kuò)大試驗(yàn) 誘變育種 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 出發(fā)菌株的選擇 誘變劑的選擇 誘變操作及培養(yǎng) 突變株的篩選 突變高產(chǎn)基因的表現(xiàn) 形態(tài)突變 高產(chǎn)突變 耐藥性突變 營養(yǎng)缺陷型突變 結(jié)構(gòu)類似

21、物抗性突變 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 出發(fā)菌株出發(fā)菌株（parent strain）選擇應(yīng)考慮的問題選擇應(yīng)考慮的問題 v出發(fā)菌株的穩(wěn)定性： v選用具備優(yōu)良特性的菌株： v挑選對誘變劑敏感的菌株： v注意菌株的生理狀態(tài)及生長發(fā)育時(shí)間： 野生菌株 自發(fā)突變后獲得的高產(chǎn)菌株 已經(jīng)誘變過的菌株 出發(fā)菌株出發(fā)菌株 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 考慮試驗(yàn)菌株的遺傳背景：各種誘變劑有不同 的作用機(jī)制，一種誘變劑的作用常主要集中在 DNA的某些特異部位上，多次反復(fù)用一種誘變因 子易出現(xiàn) “飽和”或恢復(fù)突變現(xiàn)象，因此誘變 時(shí)常采用多種不同的誘變因子或復(fù)合誘變因子。 誘誘 變變 劑劑 的的 選選 擇擇 菌懸液的制備菌

22、懸液的制備 單細(xì)胞懸浮液：單細(xì)胞懸浮液：10106 6個(gè)個(gè)/mL/mL 孢子懸浮液：孢子懸浮液：10108 8個(gè)個(gè)/mL/mL 誘變：預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適宜的誘變條件誘變：預(yù)實(shí)驗(yàn)確定適宜的誘變條件 篩選：選擇合適的篩選方法篩選：選擇合適的篩選方法 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 紫外線誘變 紫外線是應(yīng)用最廣、研究最多、最經(jīng)濟(jì)、誘變 效果較理想的誘變劑， 紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈， 波長為2537A燈與處理物的距離為 1530cm，照射時(shí)間依菌種而異，一般 為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞 的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率 控制在7080%為宜。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)

23、，細(xì)菌為106個(gè)/ml 左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為106107個(gè) /ml。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液 不要太深，約0.51.0cm厚，同時(shí)要用電 磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。 由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照 射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 操作步驟 1將細(xì)菌培養(yǎng)液以3000rmin離心5min， 傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水 再離心洗滌。 2將菌懸液放入一已滅菌的，裝有玻璃珠 的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液 倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細(xì)胞濾液 裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì) 胞數(shù)可達(dá)108個(gè)ml左右，作為待處理菌懸

24、液 。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 3取24m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)， 放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、 15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫 外線10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式 在攪拌下照射1050s。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行， 或用黑紙包住，避免白熾光。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 4取未照射的制備菌液和照射菌液各0.5ml進(jìn)行 稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。 5取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶 內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120rmin振蕩培養(yǎng)46h。 6取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 7挑取菌落進(jìn)行篩選。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 氮芥的誘變作

25、用 :常用其鹽酸鹽，為白色粉末，在碳酸氫鈉存在 的情況下，呈游離狀態(tài)，再與微生物細(xì)胞作用， 引起誘變?？捎酶拾彼峤舛尽?使用方法：1配制活化劑和解毒劑，高壓滅菌備 用，活化劑：取碳酸氫鈉68g溶于10ml蒸餾水中 即可；解毒劑：碳酸氫鈉136mg,甘氨酸120mg, 溶解于200ml水中。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 2氮芥鹽酸鹽溶液的配制：所有用品滅菌、烘干， 取約10mg氮芥鹽酸鹽放入一小瓶，加入蒸餾水 2ml，加蓋橡皮塞即可。 3吸取1ml孢子懸液（200萬孢子/ml）加入一滅 菌小瓶，加入0.6ml緩沖液，再加入0.4ml氮芥溶 液，加蓋橡皮塞，搖勻，此時(shí)氮芥作用濃度 1mg/ml. 4

26、加氮芥溶液30s后計(jì)時(shí)，到時(shí)間后，取0.1ml作 用液加入9.9ml解毒液中，使停止作用。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 亞硝基胍誘變曲霉菌亞硝基胍誘變曲霉菌 N甲基N-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或 NTG)對真核或原核微生物都有強(qiáng)烈的誘變作用。其精 確的作用機(jī)制尚不很清楚，據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的 生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細(xì)胞內(nèi)的 DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨 pH的升高而增強(qiáng)。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 (二)操作步驟 1單孢子懸液制備 取斜面，加入6ml 0.1mol L pH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子， 振蕩試管，立即通過帶濾紙漏

27、斗過濾，由此制 得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度 可達(dá)l06個(gè)ml，此為待處理孢子懸液。 2MNNG溶液的制備 用分析天平稱取2mg， 加入2ml 0.1molL pH 6.0磷酸緩沖液，于暗處 振蕩溶解。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 3誘變處理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢 子懸液中，30振蕩30min，立即稀釋1000倍 停止作用，然后以10-2，10-4兩個(gè)稀釋度分離培 養(yǎng)，30 3天后計(jì)數(shù)。 4死亡率計(jì)算 將未處理的孢子液1ml加入1ml 磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離， 30下培 養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡 率。 5挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選

28、工業(yè)微生物菌種選育和保藏 隨機(jī)篩選方法：隨機(jī)篩選方法： 菌種經(jīng)誘變處理后,進(jìn)行平板分離,隨機(jī)挑選單菌落,從中篩 選高產(chǎn)菌株。為了提高篩選效率，發(fā)展了一些快速篩選方法快速篩選方法 （包括搖瓶篩選法，瓊脂塊篩選法等），并歸納出篩選高產(chǎn)（包括搖瓶篩選法，瓊脂塊篩選法等），并歸納出篩選高產(chǎn) 菌的培養(yǎng)基菌的培養(yǎng)基選擇準(zhǔn)則: 1、制備一系列含有各種類型營養(yǎng)成分（生長限制因素） 培養(yǎng)基； 2、避免使用容易同化的碳源或氮源，（引起分解代謝物 阻遏）； 3、加入緩沖液以減少pH的變化； 4、確定含有所需的輔助因子。 。 工業(yè)微生物菌種選育和保藏 生長因子產(chǎn)生菌（對應(yīng)于營養(yǎng)缺陷型）的篩選：生長因子產(chǎn)生菌（對應(yīng)于營養(yǎng)缺陷型）的篩選： 通過觀察分離菌能否促進(jìn)營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）的生 長，便可檢出生長因子產(chǎn)生菌。 抗反饋突變株（抗結(jié)構(gòu)類似物）的篩選抗反饋突變株（抗結(jié)構(gòu)類似物）的篩選 ：